Diferenciação de músculo esquelético é um processo altamente dinâmico, que particularmente se baseia no posicionamento nuclear. Aqui, descrevemos um método para controlar movimentos de núcleos por imagens de células vivas durante a formação de diferenciação e myotube myoblast e executar uma caracterização quantitativa da dinâmica de núcleos extraindo informações de rastreamento automático.
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Artigo de método
Explorando a imagem ao vivo aos núcleos de pista durante a diferenciação de Myoblast e fusão
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Posicionamento nuclear dentro de células é importante para vários processos celulares em desenvolvimento e regeneração. O exemplo mais intrigante de posicionamento nuclear ocorre durante a diferenciação do músculo esquelético. Fibras musculares (myofibers) são células multinucleadas, formadas pela fusão de células precursoras dos músculos (mioblastos) derivadas de células-tronco musculares (células satélites) que se submetem a proliferação e diferenciação. Correto posicionamento nuclear dentro de myofibers é necessária para a regeneração muscular adequada e função. O procedimento comum para avaliar a formação de diferenciação e miofibras myoblast se baseia em células fixas analisadas por imunofluorescência, que dificulta o estudo do comportamento de movimento e célula nuclear ao longo do tempo. Aqui, descrevemos um método para a análise da formação de diferenciação e miofibras myoblast por imagens de células vivas. Nós fornecemos um software automatizado de controle nuclear obter uma caracterização quantitativa da elevado-produção de nuclear dinâmica e comportamento de myoblast (ou seja, a trajetória) durante a diferenciação e fusão.
Introdução
Músculo esquelético é o tecido maior no corpo humano, totalizando 35% - 40% da massa do corpo1. Células satélites são células-tronco musculares, anatomicamente caracterizadas por sua posição (justaposta a membrana plasmática, por baixo da lâmina basal das fibras musculares), que dão origem à proliferação de mioblastos (células progenitoras miogênico), que eventualmente diferenciar e integrar myofibers existentes e/ou fusível para formulário novo myofibers2,3,4. O progresso no estudo de sua biologia e sua descoberta levou a insights significativos sobre....
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Protocolo
Todos os procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de uso e San Raffaele institucional Cuidado Animal.
1. a dissecação dos músculos do membro posterior de rato
- Esterilize as pinças e tesouras (retas e curvas) em autoclave.
- Preparar e filtro (0,22 µm) todas as mídias (bloqueio médio, médio de digestão, proliferando médio e diferenciando médio) antes de iniciar o experimento (ver Tabela de materiais).
- Colocar 5 mL de tampão fosfato salino (PBS) em uma placa de Petri para coleção de músculo de 35mm.
- Sacrificar o mouse por deslocamento cervical ou usando o CO
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Resultados
Para seguir automaticamente o movimento nuclear durante a diferenciação de myoblast em imagens ao vivo, os núcleos devem preferencialmente ser fluorescente etiquetados. É importante notar que usar moléculas de DNA-intercalante não é viável porque estas moléculas interferem com a proliferação e diferenciação de mioblastos primária13. Como exemplo, proliferação e diferenciação foram analisados em mioblastos primários cultivados com ou sem Hoechst (
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Discussão
Fibras musculares (myofibers) são células multinucleadas que são formadas pela fusão de células precursoras de músculo (mioblastos) derivada de células-tronco musculares (células satélites) que se submetem a proliferação e diferenciação2,3, 4. Para avaliar a diferenciação de myoblast, o procedimento comum consiste de cultivo mioblastos em diferenciar médio e fixação das células em pontos de tempo diferentes para realizar a manc.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela AFM-Teleton para E.V. (#21545) e pela Ospedale San Raffaele (OSR) semente subvenção para S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez do centro de análise de imagem do Institut Pasteur é reconhecido por compartilhar publicamente suas rotinas MATLAB "Simples Tracker".
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| extrato de embriões de galinha | Seralab | CE-650-J | |
| colagenase | Sigma | C9263-1G | 125 unidades / mg |
| colágeno da pele de bezerro | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1,78 unidades / mg |
| doxiciclina | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| soro fetal bovino | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicina | Sigma | G1397 | |
| Soro de cavalo | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamina | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicilina-estreptomicina | Sigma | P0781 | |
| meio de lise de glóbulos vermelhos | Biolegend | 420301 | |
| Meio de digestão | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtrado 0,22um | |||
| Meio de bloqueio | |||
| DMEM | |||
| Soro bovino fetal | 10% | ||
| L-glutamina | 1% | ||
| penicilina-estreptomicina | 1% | ||
| gentamicina | 1 e permil; | ||
| filtrado 0.22um | |||
| meio de proliferação | |||
| IMDM | |||
| Soro bovino fetal | 20% | ||
| L-glutamina | 1% | ||
| penicilina-estreptomicina | 1% | ||
| gentamicina | 1 e permil; | ||
| extrato de embrião chichen | 3% | ||
| filtrado 0,22um | |||
| meio de diferenciação | |||
| IMDM | |||
| Soro de cavalo | 2% | ||
| L-glutamina | 1% | ||
| penicilina-estreptomicina | 1% | ||
| gentamicina | 1 ‰ | ||
| extrato de embrião chichen | 1% | ||
| filtrado 0,22um |
Referências
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W.
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Reimpressões e permissões
