אנו מציגים שיטת הזריחה כדי להדגים כי לוציפר הצהוב (LY) הוא סמן חזק כדי לקבוע את החדירות הפראוטיות לכאורה של המונטמקים/D3 cell monolayers, מודל בלתי מתורבת של מחסום הדם-מוח האנושי. השתמשנו בקביעה זו כדי לקבוע את הקינטיקה של היווצרות מונאולייר מתורבת בתאי מימן מונולימקים/D3.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
לוציפר צהוב-מרקר חזק הקרנף מסמן במודל תא של מכשול הדם האנושי-מוח
במאמר זה
סיכום
תקציר
המכשול המוחי-דם BBB מורכב מתאי האנדותל היוצרים מחסום בין הסירקולציה הסיסטמית למוח כדי למנוע חילופי יונים לא חיוניים וחומרים רעילים. צמתים הדוקים (TJ) לאטום ביעילות את החלל הפאראתאי במונאולאיירס וכתוצאה מכך מכשול שלם. מחקר זה מתאר באופן מבוסס ביותר מבוססת על הקרינה הפלואורסצנטית כי ניתן להשתמש כדי לקבוע מקדם חדירות לכאורה שלה (Papp) ובתורו יכול לשמש כדי לקבוע את הקינטיקה של היווצרות של מונואולאיירס conol, ואת הצומת ההדוק שנוצר שלמות המכשול בבכצ/D3 מונאולאיירס. אנו עוד להדגים כלי נוסף של הספק הזה כדי לקבוע את השלמות הפונקציונלית TJ בתאים מזוהמים. הנתונים שלנו מ-LY Papp האפליקציה מראה כי ההטיות/D3 תאים שנזרע בהתקנה transwell ביעילות להגביל באופן מוגבל הובלה בלבד 7 ימים-הודעה התרבות. ככלי נוסף של התשובה המוצגת, אנו גם להדגים כי ה-DNA ננו-חלקיק הזיהום אינו משנה את התחבורה הקרנף לולי ב-Hmec/D3 monolayers.
מבוא
מחסום דם-מוח (BBB) הוא מכשול ההגנה המגביל את זרם רכיבי הפלזמה לתוך רקמת המוח ומורכב מתאי המוח המתכלים יחד עם תאים תומכים כגון קרום הלב. התפקיד העיקרי של bbb הוא לשמש מחסום כי חותמות את החלל בין דם היקפי מערכת העצבים המרכזית (cn) כדי לשמור על הומוסטאזיס של המיקרוסביבה העצבית1,2. מוחו של נימי המוח מתאים באופן יעיל את מסלול הקרנף באמצעות היווצרות הצמתים הצמודים הבינתאיים (TJs)1. מכשול הגנה זה מאפשר גלוקוז וחומרים מזינים שנבחרו להיכנס למוח בזמן שהוא מונע את רוב היונים, חומרים רעילים ותרופות לעבור דרך מכשול זה צר. מלבד תפקידה המגן, תפקוד המכשול הטבעי של BBB מהווה אתגר חמור בפיתוח מערכות משלו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבות התאים הכללית/D3
- החייאה של תאים קפואים
הערה: כל הטיפול בתרבות התאים והניסויים בוצעו בתוך מכסה ביולוגי סטרילי. מדיה תרבותית, תוספי מזון וריאגנטים נרכשו כמוצרים סטרילי או מעוקר דרך סינון באמצעות פילטר ממברנה 0.22 יקרומטר כדי למנוע זיהום מחיידקים.- הוסף 8.5 mL של פתרון קולגן (0.15 mg/mL) בבקבוקון תרבות רקמה (75 ס מ2 באזור הצמיחה; התייחס מעתה ואילך כמו T75) ומניחים אותו בחממה (37 ° צ', 5% CO2) עבור 1 h.
- להסיר את התמיסה קולגן בעדינות לשטוף את הבקבוקון עם מלוחים מעוקר מאגור פוספט (PBS). הוסף 15 מ ל של בינונית צמיחה מלאה לבקבוקון ולעזוב את החממה CO2 עבור 15 דקות.
הערה: המדיום המלא (הר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ראשית, קבענו את ההשפעה של זמן התפירה על חדירות LY לקבוע את הקינטיקה לכאורה של היווצרות TJ. ערכיApp P ממוצע מיום 1 עד 10 הצבת זריעה מוצגים באיור 2a. ביום 1,app ממוצע P היה 4.25 x 10-4 ס"מ/דקה וירד מעט ל 3.32 x 10-4 ס"מ/min ביום 2. ערך Papp ממוצע מעט גדל כדי 3.93 x 10-4 ס"מ/min ביום 3 ואינו משתנה ללא שינויים משמעותיים עד יום 6. The Papp ערכים ירדו באופן משמעותי כדי 2.36 x 10-4
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תפקיד מרכזי של BBB הוא למנוע חילופי יונים לא חיוניים וחומרים רעילים בין המחזור הסיסטמי והמוח כדי לשמור על הומוסטאזיס של מיקרואקולוגיה עצבית. אחת התכונות האופייניות של ה-BBB היא היכולת של תאי האנדותל הקפיציאל ליצור צמתים הדוקים (TJs) החותמות ביעילות את תוואי התחבורה של הקרנף. הדגמנו באופן LYapp האפליקציה כשיטה כמותית כדי לקבוע את הקינטיקה לכאורה של היווצרות המכשול TJ ב-hmec תרבותית/D3 monolayers. ZO-1 ביטוי שאותרו באמצעות המערבית מבחינה מערבית בתוקף הנתונים ממחקרים LY Papp כפי שנדונו בפירוט בפסקה הבא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים הם אסירי תודה על התמיכה הפיננסית של 2017 החוקר החדש של האגודה האמריקנית של בית המרקחת, הונקלאי מחלה חשש פרס מאוניברסיטת דוקיין ובית הספר של בית המרקחת כספים הפעלה עבור מעבדת Man,. אנחנו רוצים להודות המעבדה דליפה (האוניברסיטה דוקיין) עבור סיוע מערבי לחסום ומאפשר להשתמש האודיסיאה שלהם 16-bit imager. כמו כן, היינו רוצים לכלול מכתב הערכה מיוחד לקנארפ דייב (מעבדת מאנאיקרוס) לעזרה עם הכתמים המערביים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קו תאים hCMEC/D3 | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | קו תאי אנדותל מיקרו-וסקולרי במוח אנושי |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | DNA פלסמיד המקודד גן לוציפראז |
| לוציפר צהוב CH מלח דיליתיום | Invitrogen | 155267 | |
| תוספות Transwell עם ממברנות חרוטות מפוליאתילן טרפתלט (PET) פלקון | 353095 | ||
| בקבוק תרבית רקמות | אולימפוס פלסטיק | 25-207 | |
| 24 בארות תחתית שטוחה | אולימפוס פלסטיק | 25-107 | |
| צלחות חיסון שחורות 96 בארות | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | מדיום בסיסי של תאי אנדותל-2(EBM-2) |
| מי מלח חומציים בפוספט 1X | HyClone | SH3025601 | |
| קולגן מסוג I | דיסקברי לאבוור, בע"מ | ||
| ערכת בדיקת חלבון BCA של 354236 פירס | Thermo Scientific | 23227 | |
| מגיב תרבית תאים 5X | Promega | E1531 | |
| חיפושית לוציפרין, מלח אשלגן | פרומגה | E1601 | |
| ספקטרמקס i3 | מולקולריים | קורא צלחות פלואורסצנטיות | |
| תמיסה כחולה טריפאן, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| נוגדן פוליקלונלי ZO-1 | ThermoFisher | 61-7300 | |
| נוגדן אנטי-GAPDH | abcam ab8245 | ||
| Alexa Fluor680-מצומד AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12 בארות, | פלסטיק אולימפוס | שטוח 25-106 | |
| RIPA buffer (5X) | אלפא Aesar | J62524 | |
| אפרוטינין | פישר BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | לסריקת ממברנות כתם מערביות |
מקורות
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platfo....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
