우리는 루시퍼 옐로우 (LY)가 hCMEC/D3 세포 단층의 명백한 paracellular 투과성을 결정하는 강력한 마커, 인간 혈액 뇌 장벽의 체외 모델임을 입증하기 위해 형광 분석방법을 제시합니다. 우리는 배양 된 hCMEC / D3 세포에서 동시 단일 층 형성의 역학을 결정하기 위해이 분석기를 사용했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
혈액-뇌 장벽 BBB 는 비필수 이온및 독성 물질의 교환을 방지하기 위해 전신 순환과 뇌 사이의 장벽을 형성하는 내피 세포로 구성됩니다. 단단한 접합부(TJ)는 단층의 파라셀룰러 공간을 효과적으로 밀봉하여 손상되지 않은 장벽을 생성합니다. 본 연구는 명백한 투과성 계수(P 앱)를 결정하는 데 사용될 수 있는 LY기반 형광 분석(P app)을 설명하고, 그 결과로 인한 단층 형성의 역학을 결정하는 데 사용될 수 있다. hCMEC/D3 단층의 장벽 무결성. 우리는 또한 형질감염된 세포에 있는 TJ 기능 무결성을 결정하기 위하여 이 분석의 추가 유용성을 보여줍니다. LY P앱 분석에서 우리의 데이터는 트랜스웰 설정에서 시드된 hCMEC/D3 세포가 LY 파라셀룰러 수송을 효과적으로 제한한다는 것을 보여준다 7 일 포스트 배양. 제시된 분석의 추가 유틸리티로서, 우리는 또한 DNA 나노 입자 형질감염이 hCMEC/D3 단층에서 LY 파라세포 수송을 변경하지 않는다는 것을 입증한다.
서론
혈액-뇌 장벽 (BBB) 뇌 조직에 플라즈마 구성 요소의 유입을 제한 하는 보호 장벽 이며 pericytes 같은 지원 세포와 함께 뇌 내 피 세포로 구성. BBB의 주요 역할은 말초 혈액과 중추 신경계(CNS) 사이의 공간을 밀봉하여 신경 미세 환경의 지혈을 유지하는 장벽역할을한다1,2. 뇌 모세관 내피 세포효과적으로 세포 간 단단한 접합부 (TJs)의 형성을통해 paracellular 통로를 밀봉 1. 이 보호 장벽은 포도당과 선택한 영양소가 뇌에 들어가는 것을 허용하며 대부분의 이온, 독성 물질 및 약물이 이 단단한 장벽을 통과하는 것을 방지합니다. BBB의 보호 역할 외에도, BBB의 자연 장벽 기능은 CNS를 대상으로 하는 약물 전달 시스템 개발에 심각한 도전을 제기합니다.
BBB의 체외 세포 배양 모델은 생물학을 연구하고 TJ 장벽 무결성에 대한 약물 치료의 효과를 이해하는 데 유용한 도구입니다. 우리는 인간 뇌 내피 의 허용 모델이기 때문에 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포주 (hCMEC / D3)를 시험관 내 모델로 사용3 인간 BBB의 많은 ....
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프로토콜
1. 일반 hCMEC/D3 세포 배양
- 냉동 세포의 소생술
참고: 모든 세포 배양 유지 및 실험은 멸균 된 생물 안전 성 후드 내부에서 수행되었습니다. 배양 배지, 보충제 및 시약은 미생물 오염을 방지하기 위해 0.22 μm 멤브레인 필터를 사용하여 여과를 통해 멸균 제품으로 구입하거나 살균하였다.- 조직 배양 플라스크 (75 cm2 성장 영역; 이제부터 T75로 언급)에 콜라겐 용액 (0.15mg / mL)의 8.5 mL를 추가하고 인큐베이터 (37 °C, 5 % CO 2)에 1 시간 동안 배치합니다.
- 콜라겐 용액을 제거하고 멸균 된 인산완식염수 (PBS)로 플라스크를 부드럽게 씻으십시오. 플라스크에 15 mL의 완전한 성장 배지를 넣고 CO2 인큐베이터에 15 분 동안 둡니다.
참고: 전체 배지(최종 농도)에는 태아 소 혈청(5%), 페니실린-스트렙토마이신(1%), 하이드로코르티손(1.4 μM), 산 아스코르브(5 μg/mL), 화학적으로 정의된 지질이 함유된 내피 세포 성장 기저 배지 2(500 mL)가 포함되어 있습니다. 농축액 (1/100), HEPES (10 mM) 및 기본 섬유아세포 성장 인자 (1 ng / mL).
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결과
첫째, 우리는 TJ 형성의 명백한 역학을 결정하기 위해 LY 투과성에 배양 시간의 효과를 결정했다. 1일째부터 10일까지의 평균 LY P앱 값은 그림 2a에나와 있습니다. 1일차 의 평균 P 앱은 4.25 x 10-4 cm/min이었고, 2일째에는 3.32 x 10 -4cm/min로 약간 떨어졌습니다. 평균 P앱 값은 3일째에 3.93 x 10-4 cm/min로 약간 증가했으며 6일째까지 큰 변동없이 변동했습니다. P앱 값은 7일째(P< 0.05)에 비해 2.36 x 10-4 cm/min으로 크게 감소하여 장벽이 더 엄격해졌을 것입니다. P앱 값은 7일째부터 10일째까지 2.14 x 10-4 및 2.36 x 10
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토론
BBB의 주요 역할은 신경 미세 환경의 지혈을 유지하기 위해 전신 순환과 뇌 사이의 비 필수 이온 및 독성 물질의 교환을 방지하는 것입니다. BBB의 특징적인 특징 중 하나는 모세관 내피 세포가 수송의 파라셀룰러 경로를 효과적으로 밀봉하는 단단한 접합부(TJs)를 형성하는 능력이다. 우리는 배양 된 hCMEC / D3 단층에서 TJ 장벽 형성의 명백한 역학을 결정하는 정량적 방법으로 LY P앱 분석법을 입증했습니다. 서양 블로팅을 통해 검출된 ZO-1 발현은 다음 단락에서 상세히 논의된 바와 같이 LY P앱 연구에서 데이터를 정형화하여 검증했다. 개발된 분석법의 추가 유틸리티로서, 우리는 DNA NP 형질감염이 실험 설정에서 TJ 장벽 특성의 변화를 결정하기 위해 이 분석법의 적합성을 나타내는 LY P앱을 측정 가능하게 변경하지 않았다는 것을 더 입증하였다.
웨스턴 블롯 데이터는 3일째, 5일, 7포스트 파종및 10일사후.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 약국의 미국 협회에서 2017 새로운 조사자 상, Duquesne 대학에서 Hunkele 공포 질병 상과 Manickam 실험실에 대한 약학 창업 기금의 학교에서 재정 지원에 감사드립니다. 우리는 서부 블로팅 지원과 오디세이 16 비트 이미저의 사용을 허용 누출 실험실 (Duquesne 대학)에 감사드립니다. 우리는 또한 칸다프 데이브 (Manickam 실험실)에 대한 감사의 특별한 메모를 포함하고 싶습니다 서부 블로팅에 대한 도움.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| hCMEC/D3 세포주 | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | 인간 대뇌 미세혈관 내피 세포주 |
| gWizLuc | 알데브론 | 5000-5001 | 플라스미드 DNA 인코딩 루시퍼라제 유전자 |
| 루시퍼 옐로우 CH 디리튬 염 | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell 인서트는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 트랙 에칭 멤브레인이 있는 | Falcon | 353095 | |
| Tissue Culture Flask | Olympus Plastics | 25-207 | |
| 24웰 플랫 바텀 | Olympus Plastics | 25-107 | |
| 블랙 96-웰 면역 플레이트 | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) |
| 인산염 완충 식염수 1X | HyClone | SH3025601 | |
| 콜라겐 타입 I | 디스커버리 Labware, Inc. | ||
| Pierce BCA 단백질 분석 키트 | Thermo Scientific | 23227 | |
| 세포 배양 용해 5X 시약 | Promega | E1531 | |
| 딱정벌레 루시페린, 칼륨 소금 | 프로메가 | E1601 | |
| 스펙트라맥스 i3 | 분자 장치 | 형광 플레이트 리더 | |
| Trypan 블루 솔루션, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| ZO-1 다클론 항체 | ThermoFisher | 61-7300 | |
| 항-GAPDH 항체 | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12-well, Flat | Bottom Olympus Plastics | 25-106 | |
| RIPA buffer (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx 이미저 | LI-COR Biosciences | 웨스턴 블롯 멤브레인 스캐닝 |
참고문헌
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platfo....
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재인쇄 및 허가
