Summary
Galleria mellonella служит беспозвоночных модель для распространенных кандидоз. Здесь, мы подробно инфекции протокол и предоставлять вспомогательные данные для модели эффективности.
Abstract
Видов Candida являются общие грибковых Комменсалами людей колонизации кожи, слизистых поверхностей и желудочно-кишечного тракта. При определенных условиях Candida могут перерасти их природных ниш, что приводит к изнурительной слизистой инфекции как хорошо как опасные для жизни системных инфекций, которые являются одним из основных направлений расследования из-за их связанные высокой смертности. Животные модели распространения инфекции существуют для изучения прогрессирования заболевания и рассекает характеристики Candida патогенности. Из них Galleria mellonella waxworm инфекции модель обеспечивает экономически экспериментальный инструмент для исследования высок объём системных вирулентности. Многие другие бактерий и эукариот инфекционные агенты эффективно изучались в G. mellonella понять патогенности, что делает его широко принятой модели системы. Тем не менее изменения в метод, используемый для заразить G. mellonella можно изменить результаты фенотипических и затруднить интерпретацию результатов. Здесь мы приводим, преимущества и недостатки waxworm модели для изучения патогенеза системный кандидоз и подробно такой подход к улучшению воспроизводимость. Наши результаты выделить диапазон кинетики смертности в G. mellonella и описывают переменные, которые можно модулировать эти кинетики. В конечном итоге этот метод стоит как этического, быстрое и эффективное подход для изучения вирулентности в модели распространения кандидоза.
Introduction
Видов Candida являются общие человеческие Комменсалами, которые способны как оппортунистических патогенов в сильно ослабленным и дисбиотических пациентов. Хотя многие виды Candida могут вызывать заболевания, C. albicans является самой распространенной причиной распространения кандидоз1,2. Системных заболеваний результаты от C. albicans доступ кровоток через либо прямого проникновения ранее ограничительных хост барьеров или введение в хирургических сайтов и другие нарушения тела3. Candida видов использования ряда патогенных процессов могут вызвать системные заболевания в пределах узла, включая филаментацию, биопленки, уклонение иммунных клеток и бежать и железа, очистку4. В vitro подходы существуют для расследования индивидуальных патогенетических механизмов, но Животные модели продолжать предоставлять лучший вариант, чтобы исследовать весь исход болезни5,6. Предыдущие исследования подробно многие случаи перспективным в vitro исследования вирулентности, неспособность воспроизводить в vivo7,8. Таким образом, Животные модели по-прежнему необходимы для оценки вирулентности в vivo. Большинство моделей болезни полагаются на мышах в качестве суррогата для человека инфекции, несмотря на неспособность C. albicans естественно колонизировать мышиных систем как синантропных9. Беспозвоночных модели распространенных кандидоз включают нематоды Caenorhabditis elegans, фрукты fly Drosophila melanogasterи waxworm Galleria mellonella, хотя опасения по поводу основных различий в основных физиологии температуры тела пребывания и пути воздействия препятствовали их широкое признание10,11.
Совсем недавно была принята модель инфекции waxworm G. mellonella для модели патогенности широкого спектра бактериальных и грибковых патогенов12,,1314. Преимущества этой модели включают его относительно низкая стоимость, увеличение пропускной способности, простота использования и снижение этические соображения относительно животных благодеяние, по сравнению с мышиных моделях. Для исследователей это приводит к увеличению возможность протестировать несколько переменных, сильнее доверительные интервалы, более быстрое экспериментов и обход животных протоколов. G. mellonella служил в качестве платформы для быстро оценить C. albicans вирулентности после возмущения генов, необходимых для регулирования формирования, филаментацию и Джин биопленки через клинических изолятов11,15 ,16. Недавние исследования включили расследования противогрибковая эффективность с использованием G. mellonella для оценки фармакокинетики препарата активности и сопротивления параметры в естественных условиях , которые в противном случае вызов и много времени 17,18. Тем не менее исследования C. albicans вирулентности в G. mellonella было осложнено сообщается, что высокие уровни вариации в рамках экспериментов и несовместимые протоколы между исследовательскими группами, которые производят различные вирулентности фенотипов между мышами и waxworms11,13,19,,2021. Здесь мы приводим G. mellonella протокол стандартизировать C. albicans воспроизводимость увеличение инфекции, в экспериментах вирулентности, и продемонстрировать соответствие ранее описанных исследований вирулентности в мышиных модели.
Предыдущие исследования показали, что C. albicans спаривания локус (MTL) тип как на хромосоме 5 регулирует ячеек самобытности и спаривания компетенции аналогичные Saccharomyces cerevisiae и других грибов аскомицетов22. Большинство C. albicans изолятов гетерозиготных в локусе мТл , кодирование один из каждого из мТл и MTLα аллелей (MTL/α) и следовательно стерильные15, 23 , 24. потери одной из аллелей MTL через потери гетерозиготности (LOH) или мутация приводит к гомозиготных MTL или MTLα штаммов, которые могут пройти фенотипические переключатель от стерильного «белый» государства спаривания компетентные государственные «непрозрачного»25. Предыдущая работа подчеркнул, что потеря гетерозиготности MTL также уменьшает вирулентности в мышиных моделях системной инфекции через различные деформации стола26. Здесь мы подробно G. mellonella модель для распространения с помощью генетически аналогичны экспериментальный набор изображать вклад гетерозиготности мТл к вирулентности в G. mellonellaкандидоза. Мы покажем, что МРЛ конфигурации влияние C. albicans патогенности, где MTLα штаммы были менее вирулентные MTL/α и MTL клетки, подобные выводы в мышиных инфекции модель26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные полагаются на использование беспозвоночных хостов и не требуют одобрения институциональный уход животных и использовать Комитет (IACUC).
1. galleria mellonella Waxworm личинок
- Заказать личинок от оптовиков и поставщиков, не вводить, гормоны, антибиотики или другие процедуры для личинки и которые способны корабль и доставить образцов.
- Убедитесь в том приобрести все личинки от того же поставщика в ходе экспериментов. Будьте внимательны при заказе личинок в летние месяцы, как температура превышает 30 ° C уменьшение жизнеспособности личинки.
- Контролировать температуру по всему маршруту ожидается доставка и соответствующим образом планировать и доставки или выбрать ускоренной доставки для сведения к минимуму их воздействие на условия окружающей среды.
- Когда личинки прибывают, проверьте каждый контейнер для обеспечения жизнеспособного, здоровые личинки присутствуют. Здоровые личинки будут полностью погруженным под постельные принадлежности, перемещение и обладают светло желтый/Тан окраски с несколько личинок, содержащие черные метки или пятна вдоль тела.
- Храните личинок в их контейнере в вентилируемое пространство при комнатной температуре (25 ° C). В зависимости от первоначального состояния личинки они могут использоваться для до двух недель.
2. Культура подготовка Galleria mellonella инфекции
Примечание: Надлежащего лаборатории наряд должен носить в течение этой части протокола, включая перчатки, лабораторный халат и защитные очки.
- Сделайте дрожжи Пептон Декстроза плиты жидкости и агар (YPD). Подготовка 1 x-фосфатный буфер (PBS) и 70% растворы этанола.
- Расти штаммов C. albicans будет введен на ночь в 3 мл свежего YPD в стандартных культуры трубы на вращающийся барабан на средней скорости и 30 ° C.
- Вращать клетки вниз на 2500 x g 5 мин в настольной центрифуги. Слить супернатанта, стараясь не нарушить Пелле ячейки.
- Ресуспензируйте клетки полностью в 5 мл ПБС неоднократные закупорить или vortexing. Повторите центрифугирования и ресуспендирования клеток в два раза больше PBS для обеспечения удаления всех культуры средств массовой информации.
- После окончательного мыть Ресуспензируйте клеток в 1 мл PBS и передавать их на пробки microcentrifuge.
- Проводить набор серийных разведений в PBS для генерации 1: 100, 1:1, 000 и картирование разрежения серии.
Примечание: Альтернативные разведениях может быть необходимо достичь желаемого клеток.- С помощью Горяева, подсчитать ячейки от 1: 100 или 1:1,000 разрежения. Чаще всего 1:1,000 разрежения обеспечивает соответствующую ячейку подсчитывает для культур, C. albicans .
- Расчет общей концентрации клеток в пределах первоначальной культуры с помощью математика сетка Горяева, направленных для между 30-300 клетки быть подсчитанным в сетке Центральной 5 x 5. Счетчик автоматизированной клеток может использоваться в качестве альтернативы; Однако использование оптической плотности для определения клеток приветствуется как морфология клеток (размер, форма и т.д.) может существенно повлиять на ее точность.
- Используя измеренные клеток, сделайте новый разрежения 2, 5х107 кл/мл в ПБС в пробки microcentrifuge. Это раствора будет служить основой для каждой прививки G. mellonella с C. albicans. Каждая инъекция потребует 10 мкл этой посевным материалом для инфекционных дозы 250.000 клеток C. albicans .
- Подтвердите точность инфекционных дозы, покрытие правильный объем картирование разрежения на 100 единиц образуя колонии (CFUs) на YPD агар для каждой культуры, которые будут использоваться в инфекции.
- Инкубации клеток количество пластин из шага 2.7 для 48 часов (h) при 30 ° C и подсчитать количество колоний на пластину. Между 80 и 120 колоний представляет собой приемлемый диапазон для точности в посевным материалом.
3. инфекции Galleria mellonella личинки с Candida культур
Примечание: Надлежащего лаборатории наряд должен носить в течение этой части протокола, включая перчатки, лабораторный халат и защитные очки.
- Добавьте 1 мл 100% этанола и 1 мл ПБС в двух отдельных microcentrifuge трубы. Этанола и PBS будет использоваться для мытья иглу между инфекции.
- Спред небольшое количество waxworm кроватей в пустой, стерильные Петри 100 x 15 мм, которая разместится личинок после прививки для каждой независимой штамма. Кроме того постельные принадлежности ограничивает соблюдение мертвых G. mellonella личинок на Петри блюдо поверхности.
- Стерилизуйте 26 G, 10 мкл шприц, принимая и стирания 10 мкл 70% этанола, три раза, после чего три автомойки с 10 мкл ПБС. Вихрь прививка разрежения C. albicans и занять 10 мкл культуры. Убедитесь, что есть нет пузырьков воздуха в шприц, как инъекции воздуха способствует смерти и осложнит течению анализ.
- Откройте контейнер, содержащий G. mellonella личинок и осторожно перевернуть постельные принадлежности с пальцем, чтобы раскрыть личинки. Выберите личинки, которые находятся в добром здравии, выявленные активное движение, светло желтый/коричневый цвет и отсутствие черной пигментации на теле личинки. Эти личинки следует быть аналогичного размера через экспериментальных полный набор.
- Забрать одну личинок и удерживайте его нежно между индекс/средний палец и большой палец похож на держа карандаш. Ролл личинки на его обратно, поэтому ноги вверх. Провести полную длину тела между пальцами и большого пальца, так что личинки не может свернуться или тянуть от инъекций.
Примечание: При желании, стерилизуйте месте инъекции, используя ватный тампон, смоченный в 100% этанола. - Вращать шприц так скос иглы обращена вверх и медленно вставьте кончик иглы, включая длину фаски в тело на стыке с задней левой ноги. Убедитесь, что игла проникает в тело и не просто нажимаем тела личинки внутрь. Не использовать силу в проникновении тело, как игла может пробить полностью личинки быстро. Аккуратно лифтинг с иглой подтвердит соответствующим проникновения. Придать посевным материалом Candida полный 10 мкл и извлеките иглу.
- Повторите шаг 3.3-3.5 для каждого личинки. Чтобы предотвратить ячейку, оседая, вихревой Candida культур для прививки после каждого третьего инъекции. Как элемент управления придать набор G. mellonella 10 мкл ПБС.
- Совместное дом 10 личинки вводят от той же культуры Candida в каждом Петри 100 x 15 мм, после прививки. Инкубируйте личинки при 37 ° C в течение восьми дней, проверка личинки каждые 24 ч для мониторинга смерти.
- Оценить смертность первоначально по темной пигментации, формирование черные пятна или органов и отсутствие движения. Для подтверждения смертности, используйте пинцет нежно рулон умирающий личинок на их обратно и слегка толкать нижней личинки с помощью пинцета. Non оперативность как отмечалось отсутствие видимых движения тела или ног оценивается как смерть и личинки, удаляются из Петри.
- Запись личинки смертности в течение времени. Личинки, которые начинают окукливаются в моли могут быть включены в анализ, но должны быть удалены, если они начинают линьки. Pupating личинок может подвергаться цензуре от конечной точки анализа как вирулентность различия между личинки и куколки являются неясными.
- Оценка статистической значимости, используя статистический тест Mantel-Кокс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы демонстрируем воспроизводимый метод для использования waxworms G. mellonella расследовать модель распространенных кандидоз инфекции с использованием C. albicans. Хранения, обслуживания и отбора личинок для инфекции являются критическим компонентом обеспечивая воспроизводимость G. mellonella смертности (рис. 1А). Здоровых личинки, которые являются активными, имеют светло желтый/коричневый цвет, и отсутствие черные пятна на теле должен использоваться для этой системы и обычно жизнеспособным для инфекции до двух недель после прибытия. Чтобы свести к минимуму любые потенциально смешанные эффекты G. mellonella физиологии, личинки были отобраны из аналогичного размера и веса. Перемешанных посевным материалом и последовательного впрыска на том же сайте анатомические тела личинки также стоят как важные переменные в продвижении воспроизводимость между экспериментов. Изображения Витрина поддержание зараженные личинки через продолжительность экспериментов (рис. 1Б).
Чтобы оценить влияние возраста личинок на вирулентности, отдельные PBS контроля инфекции были выполнены с личинки ноль или десять дней после прибытия. Никакого существенного различия в кинетика G. mellonella смерти существовали между этими группами (рисA). Характерные признаки болезни возникло в личинок из обеих групп, которые поддались к инфекции; Первоначально желтый/Тан окраска личинки стал бесцветные и уступили черные пятна до полной потери подвижности и, в конечном счете, смерть (рис. 2B). Инфекции с C. albicans ускоряет этот процесс обесцвечивание и заболеваемости, но не повлияют Каскад фенотипические маркеры, ведущих к смерти по сравнению с неинфицированным личинки или PBS вводят личинки (рис. 2C).
Инфекционный дозы также значительно влияет на смертность кинетики G. mellonella инфекций. Оценить эффекты C. albicans посевным материалом размера, мы заражены G. mellonella четыре различных клинических изолятов (12 C, P60002, P75010 и SC5314: Таблица 1) в трех различных дозах. Личинки, инфицированных с SC5314 отображается смертности при всех дозах, в соответствии с повышенной патогенности этой изоляции по отношению к большинство других используемых в рамках эксперимента (Рисунок 2D). Больше личинок поддался инфекции с 1,0 x 105 SC5314 или 12 C ячеек по сравнению с 1,0 x 104 клетки. Высшая доза 1,0 x 106 клеток оказалось чрезмерно смертоносных с личинками, умирает после инфекции всех штаммов, включая менее вирулентные изолятов, P60002 и 12 C. Личинки, вводится с P75010 и SC5314 поддался инфекции в течение 24 ч, предполагая, что более умеренные дозы инфекционных подходит для определения различий в вирулентности. Следовательно инфекционные доза 2, 5х10-5 был использован для всех последующих экспериментов.
Чтобы продемонстрировать сходство в вирулентности между мышиных и G. mellonella модели системных заболеваний, мы assayed вирулентности штаммов SC5314-производные C. albicans , кодировку либо гетерозиготной (/α или гомозиготных (/или Α /-) MTL локусов. Инфицирование G. mellonella MTL heterozygotes от SC5314 или его прототрофного производных BWP17 генетический фон производится высокий уровень смертности по сравнению с PBS-вводят животных. Три четверти личинок управления выжил в день 8, по сравнению с потерей более половины всех животных C. albicans вводят в течение 3 дней пост инфекции (dpi), которая возросла на 8 точек на дюйм (рис. 3A, 3B). Инфекции с BWP17 смоченной C. albicans летальность в этой модели (27% выживания, по сравнению с 4% выживания в SC5314 MTL heterozygotes на 8 точек на дюйм; Рисунок 3 C, 3D). G. mellonella личинки инфицированных штаммами MTLα /-выжили значительно больше по сравнению с MTL гетерозиготных родителей штаммов (лог ранг теста, SC5314; p = 0.0006, BWP17; p = 0.0002). Интересно, что вирулентности MTL- C. albicans клетоксоответствует его MTL гетерозиготных коллегой в SC5314 и BWP17 стола. Таким образом конфигурация MTL влиять на C. albicans вирулентности штаммами MTLα /-показано снижение убийства, по сравнению с MTL/α или мТл/ клетки.
Рисунок 1 . Обзор процедуры заражения. (A) блок-схема освещаются ключевые элементы процедуры инфекции, в том числе упорядочения и хранения личинок, инфекции культуры подготовки и инъекции. (B) представитель изображения показывают условия здорового хранения, подготовка инфекции пространства, инъекции и личинки обслуживания после инфицирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Эффекты G. mellonella инфекции процедур. (A) PBS контроля были заражены сразу же по прибытии (PBS-D0, синий) или после 10 дней (PBS-D10, красный). (B) представитель изображения выделите личинки обесцвечивание и смерти. (C) изображения серии инфекции плит подробно эффекты инъекций с PBS (средний) или SC5314 (Нижняя) по сравнению с неинфицированным личинки (вверху) на дни 1, 3, 5 и 7, после инъекции. (D) дозировка эффекты отображаются в коллекции клинических изолятов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . MTLаллеля способствует C. albicans убийства G. mellonella. MTL Локус гетерозиготной (/α) и гомозиготных (/- и α /-) SC5314, (A) и BWP17 (C) производные выводятся личинки смертности свыше восьми дней. Доверительные интервалы выводятся для каждого SC5314 (B) и BWP17 (D) производные напрягаться, чтобы выделить последовательность в кинетика личинки смертности через эксперименты. Средний (сплошная линия) построена с стандартных отклонений (заполняется в пространстве) для трех биологических реплицирует 10 личинок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Кандида штамм | Родительский сорт | Генотип | MTL | Ссылка |
| MAY1 | SC5314 | Candida albicans клинического изолята | a/α | Wu et al. 2007 |
| MAY6 | P60002 | Candida albicans клинического изолята | a/a | Wu et al. 2007 |
| МАЙ11 | P75010 | Candida albicans клинического изолята | a/α | Wu et al. 2007 |
| MAY15 | 12C | Candida albicans клинического изолята | a/a | Wu et al. 2007 |
| MAY61 | SC5314 | MTLa:: SAT1 | Α /- | Это исследование |
| MAY71 | SC5314 | MTLα:: SAT1S tac1::TAC1-GFP-г | a /- | Это исследование |
| MAY313 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-arg4-ura3-BN sir2::his1/sir2::dpl200 | a/α | Это исследование |
| MAY314 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | Α /- | Это исследование |
| MAY315 | BWP17 | ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/his1::hisG arg4::hisG/arg4::RS-ARG4-URA3-BN sir2::HIS1/sir2::dpl200 | a /- | Это исследование |
Таблица 1. C. albicans sпоезда, используемые в данном исследовании.
| Переменной составляющей | Предлагаемое управление | Ссылка |
| Личинки возраст в момент впрыска | Свести к минимуму время между прибытием червя и прививки | Это исследование |
| Размер личинки во время впрыска | Обеспечить согласованность при выборе червей | Фукс et al. 2010 |
| Личинки здоровья во время впрыска | Порядок Глисты при умеренной температуре, использовать сразу же по прибытии | Это исследование |
| Инфекционные дозы с C. albicans | Выберите инфекционных концентрации, которая представляет широкий спектр решений | Это исследование |
| Личинки ответ для инъекций | Проведение PBS впрыска управления наряду с червей с без инъекций | Хиракава et al. 2015 |
В таблице 2. Соображения относительно G. mellonella инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модель waxworm G. mellonella стоит как эффективный инструмент для быстрого и воспроизводимость анализа C. albicans вирулентности. Этот подробный протокол опирается на последовательной доставки определенных инфекционных дозы на тот же сайт через партию личинок. Инфекционные доза имеет глубокое влияние на смертность G. mellonella , тогда как использование личинок между их первоначального прибытия и через 10 дней после получения дал сходные результаты. Потеря аллеля C. albicansMTL приводит снижение вирулентности, согласуется с предыдущей эксперименты на мышах хотя нарушения аллеля α MTLне изменяют личинки смерти.
Итоги G. mellonella инфекции может быть значительно затронуты экспериментальный дизайн. В отличие от позвоночных модели инфекции небольшие вариации в месте инъекции, посевным материалом объем и размер посевным материалом могут повлиять интерпретации данных. Инфекции с увеличением числа клеток C. albicans , привело к более и более быстрое заболеваемости зараженные личинки. В определенный момент инъекционных слишком много C. albicans появляется способны перегрузки принимающей противовоздушной обороны к быстрой смерти хозяина, потенциально через токсический шок. Однако SC5314 был последовательно наиболее вирулентного штамма при всех дозах, следуют 12C, а затем другие штаммы. Таким образом инфекции параметры имеют глубокое влияние на абсолютной кинетика инфекции, но могут по-прежнему дают оценки относительной вирулентности. До работы в рамках этих экспериментов далее продемонстрировал важность тщательного мытья клетки Candida . Остаточные YPD включены в болюсного введения значительно уменьшается личинки выживания (данные не показаны).
Червь здоровья является критической переменной при проведении экспериментов G. mellonella . Личинки, перевозимых с использованием стандартной доставки в середине лета часто прибывают преждевременно возрасте или подчеркнул, покрытые черной патчи, с снижение жизнеспособности. Не значительную роль для личинок размер на заболеваемость наблюдается ранее хотя эксперименты, описанные здесь сосредоточена на опробование личинки примерно эквивалентной массы. Здоровых личинок и PBS управления личинки всегда должен выполняться наряду с инфекцией группы для учета любых изменений в жизнеспособности личинки между биологической реплицирует на отдельные дни. G. mellonella инфицированных через десять дней после прибывающих сопоставлены кинетика личинок, инфицированных сразу же по получении. Таким образом одну партию личинок может обеспечить достаточно материала и времени для выполнения полной экспериментов. Эти эксперименты полагались на 30 животных каждого штамма для определения различий в вирулентности, которая является значительно более животных, чем обычно используются в мышиных моделях, что приводит к укреплению доверия наблюдаемые результаты11,27 , 28. Эта модель также сокращен этические проблемы, время и затраты по сравнению с позвоночных модели инфекции. Таким образом использование личинок восковой может облегчить выявление меньше влияния на системные вирулентности, чем это возможно в других системах.
Присущие оговорками к системе G. mellonella существуют, которые ограничивают его полезности в изучении взаимодействия между хост патогеном. Во-первых G. mellonella отсутствие адаптивной иммунной системы и не может использоваться для изучения иммунологической памяти как в высших эукариот29или антигенностью. Тело личинки состоит из одного непрерывного полости заполнены с гемолимфа, который функция распространить питательных веществ, сигнальные молекулы, клетки иммунной системы и противомикробные пептиды. Эти клетки иммунной системы, hemocytes, ведут себя аналогично нейтрофилов и может поэтому фагоцитоз, генерировать окислительного очередей и секретируют литические ферменты, после активации через внеклеточного патогенов признание рецепторов30. Тем не менее эта функция является подмножеством innate иммунных клеток процессов в рамках систем хордовых, которые могут не полностью отражать все мероприятия лейкоцитов. Другим крупным оговоркой является отсутствие сборку генома для G. mellonella хотя генома было недавно виртуализированного31. Следовательно степень генотипической разнообразие в рамках вида неизвестна, и большинство поставщиков вероятно корабль генетически разнородных популяций, которые могут повлиять на смертности через эксперименты. Кроме того молекулярные методы не существуют для организма и осложнить любые попытки вскрыть взносов принимающих в патогенезе. Тем не менее результаты последовательного вирулентности после инфекции с C. albicans через эксперименты, поставщиков, время и лаборатории поддерживает их полезности в фундаментальные вопросы патогенности.
MTL потери снижение вирулентности C. albicans относительно MTL heterozygotes и MTLα homozygote стола. Эта тенденция согласуется с предыдущей работы, выполняемые с помощью мыши модели системных вирулентности26. В отличие от мышиных моделях потеря MTLα не изменяют вирулентности относительно MTL/α родительский сорт. Расхождение между результатами остается неясным, но может включать в себя компоненты адаптивного иммунитета, которые отсутствуют в беспозвоночных организмов. Кроме того повышение вирулентности связанных с MTL гетерозиготности может объясняться только MTLα аллеля в SC5314, потенцирования необходимость оценки через несколько штамм стола. Поэтому мы предлагаем дифференциального роль для вирулентности между двумя аллелями мТл .
В целом G. mellonella модель служит быстрое и воспроизводимые модель для оценки системный кандидоз. Другие надписи вирулентности может быть assayed с этой моделью, включая распространенность грибковых покрытие Гомогенат трутневых личинок для колонии, образуя11 единиц (CFUs) или биолюминесценции, который также обеспечивает грибковых локализации32. В будущем, эта модель может быть расширена для оценки вирулентности характеристики других видов Candida таких повышенных лекарственной устойчивости в вновь возникающим Candida auris видов33. Продолжение разработки инструментов для визуализации лимфоцитов в G. mellonella взаимодействующих с заражение Candida, waxworm инбредных линий для уменьшения инфекций результатов и визуализация инфекционный процесс изменчивость через репортер Candida линии34 дальнейшего совершенствования этой модели болезни и позволяют глубже расследования в vivo хост возбудитель взаимодействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить помощь, Памела Вашингтон и Лия Андерсон в получении Galleria mellonella для использования в данном исследовании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Snackworms.com | Buy twice as many worms as expected to use | |
| 10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe | Hamilton | 80000 | |
| Petri dish, 100X15 mm, 500 pack | Fisher | FB0875712 | |
| Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack | VWR | 87003-294 | |
| Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL | VWR | 97062-818 | |
| Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL | Millipore Sigma | EM-EX0276-1S | |
| autoclaved ddH2O |
References
- Kauffman, C. A., et al. Prospective multicenter surveillance study of funguria in hospitalized patients. The National Institute for Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Mycoses Study Group. Clinical Infectious Diseases. 30 (1), 14-18 (2000).
- Horn, D. L., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy alliance registry. Clinical Infectious Diseases. 48 (12), 1695-1703 (2009).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clinical Microbiology Reviews. 20 (1), 133-163 (2007).
- Sardi, J. C., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 1 10-24 (2013).
- Segal, E., Frenkel, M. Experimental in Vivo Models of Candidiasis. J Fungi (Basel). 4 (1), (2018).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. Animal models for candidiasis. Current Protocols in Immunology. 105, 11-17 (2014).
- Heymann, P., et al. The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome-type siderophores and is required for epithelial invasion. Infection and Immunity. 70 (9), 5246-5255 (2002).
- Priest, S. J., Lorenz, M. C. Characterization of Virulence-Related Phenotypes in Candida Species of the CUG Clade. Eukaryotic Cell. 14 (9), 931-940 (2015).
- Savage, D. C., Dubos, R. J. Localization of indigenous yeast in the murine stomach. J Bacteriol. 94 (6), 1811-1816 (1967).
- Ewbank, J. J., Zugasti, O. C. elegans: model host and tool for antimicrobial drug discovery. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 300-304 (2011).
- Amorim-Vaz, S., Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Examining the virulence of Candida albicans transcription factor mutants using Galleria mellonella and mouse infection models. Frontiers in Microbiology. 6, 367 (2015).
- Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection. Journal of Visualized Experiments. (81), e50964 (2013).
- Jacobsen, I. D. Galleria mellonella as a model host to study virulence of Candida. Virulence. 5 (2), 237-239 (2014).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Hirakawa, M. P., et al. Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans. Genome Research. 25 (3), 413-425 (2015).
- Dunn, M. J., Kinney, G. M., Washington, P. M., Berman, J., Anderson, M. Z. Functional diversification accompanies gene family expansion of MED2 homologs in Candida albicans. PLoS Genetics. 14 (4), 1007326 (2018).
- Astvad, K. M. T., Meletiadis, J., Whalley, S., Arendrup, M. C. Fluconazole Pharmacokinetics in Galleria mellonella Larvae and Performance Evaluation of a Bioassay Compared to Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Hemolymph Specimens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
- Mesa-Arango, A. C., et al. The non-mammalian host Galleria mellonella can be used to study the virulence of the fungal pathogen Candida tropicalis and the efficacy of antifungal drugs during infection by this pathogenic yeast. Med Mycol. 51 (5), 461-472 (2013).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Fuchs, B. B., O'Brien, E., Khoury, J. B., Mylonakis, E. Methods for using Galleria mellonella as a model host to study fungal pathogenesis. Virulence. 1 (6), 475-482 (2010).
- Kavanagh, K., Fallon, J. P. Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence. Fungal Biology Reviews. 24 (1-2), 79-83 (2010).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285 (5431), 1271-1275 (1999).
- Legrand, M., et al. Homozygosity at the MTL locus in clinical strains of Candida albicans: karyotypic rearrangements and tetraploid formation. Molecular Microbiology. 52 (5), 1451-1462 (2004).
- Lockhart, S. R., et al. In Candida albicans, white-opaque switchers are homozygous for mating type. Genetics. 162 (2), 737-745 (2002).
- Miller, M. G., Johnson, A. D. White-opaque switching in Candida albicans is controlled by mating-type locus homeodomain proteins and allows efficient mating. Cell. 110 (3), 293-302 (2002).
- Wu, W., Lockhart, S. R., Pujol, C., Srikantha, T., Soll, D. R. Heterozygosity of genes on the sex chromosome regulates Candida albicans virulence. Molecular Microbiology. 64 (6), 1587-1604 (2007).
- Herrero, A. B., et al. KRE5 gene null mutant strains of Candida albicans are avirulent and have altered cell wall composition and hypha formation properties. Eukaryotic Cell. 3 (6), 1423-1432 (2004).
- Hall, R. A., et al. The Mnn2 mannosyltransferase family modulates mannoprotein fibril length, immune recognition and virulence of Candida albicans. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003276 (2013).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Journal of Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infection and Immunity. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Lange, A., et al. Genome Sequence of Galleria mellonella (Greater Wax Moth). Genome Announcements. 6 (2), (2018).
- Krappmann, S. Lightning up the worm: How to probe fungal virulence in an alternative mini-host by bioluminescence. Virulence. 6 (8), 727-729 (2015).
- Chowdhary, A., Voss, A., Meis, J. F. Multidrug-resistant Candida auris: 'new kid on the block' in hospital-associated infections. Journal of Hospital Infection. 94 (3), 209-212 (2016).
- Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Adaptation of a Gaussia princeps Luciferase reporter system in Candida albicans for in vivo detection in the Galleria mellonella infection model. Virulence. 6 (7), 684-693 (2015).
