Summary
Ett detaljerat protokoll för rening och efterföljande analys av en monoklonal antikropp från skördad cell odlings vätska (HCCF) av automatiserade mikrobioreaktorer har beskrivits. Användning av analys för att fastställa kritiska kvalitetsattribut (CQAs) och maximera begränsad provvolym för att extrahera viktig information presenteras också.
Abstract
Monoklonala antikroppar (mAbs) är en av de mest populära och väl kännetecknas biologiska produkter som tillverkas idag. Vanligast produceras med kinesisk hamster äggstockar (CHO) celler, kultur och processförhållanden måste optimeras för att maximera antikropp titrar och uppnå mål kvalitets profiler. Normalt använder denna optimering automatiserade mikroanalys bioreaktorer (15 ml) för att avskärma flera processförhållanden parallellt. Optimerings kriterier inkluderar kultur prestanda och de kritiska kvalitetsattributen (CQAs) för den monoklonala antikroppen (mAb), som kan påverka dess effekt och säkerhet. Kultur prestandamått inkluderar celltillväxt och näringsämnes konsumtion, medan CQAs inkluderar mAb: s N-glykosylering och aggregering profiler, Charge-varianter, och molekylvikt. Detta detaljerade protokoll beskriver hur man renar och därefter analyserar HCCF-prover som produceras av ett automatiserat mikrobioreaktor system för att få värdefulla prestandamått och resultat. För det första används ett automatiserat protein en snabb proteinvätskekromatografi (FPLC) metod för att rena mAb från skördade cellkulturer prover. När koncentrerade, de glykananalys profilerna analyseras av masspektrometri med hjälp av en specifik plattform (se tabellen av material). Molekylvikter och agg regeringsprofiler bestäms med hjälp av storleks uteslutnings-kromatografi-multipel vinkel ljusspridning (SEC-mals), medan laddningsvarianter analyseras med hjälp av mikrochip kapillärzon elektrofores (mcze). Förutom de kultur prestandamått som fångas under bioreaktor processen (dvs. kultur lönsamhet, cellantal och vanliga metaboliter, inklusive glutamin, glukos, laktat och ammoniak), analyseras förbrukade medier för att identifiera begränsande näringsämnen för att förbättra utfodringsstrategier och övergripande process design. Därför beskrivs också ett detaljerat protokoll för absolut kvantifiering av aminosyror med vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) av förbrukade medier. De metoder som används i detta protokoll utnyttjar plattformar med hög kapacitet som är kompatibla för ett stort antal små volym exempel.
Introduction
Protein Therapeutics används för att behandla en växande variation av medicinska tillstånd inklusive vävnadstransplantation komplikationer, autoimmuna sjukdomar, och cancer1. Sedan 2004, Förenta staternas Food and Drug Administration (USFDA) har dokumenterat en ökande andel av biologiska licensansökningar (BLAs) av alla godkännanden som regleras av Center for Drug utvärdering och forskning (CDER), med BLAs står för över 25% 2014 och 20152.
Med tanke på denna expanderande marknad, biofarmaceutiska tillverkare utmanas att snabbt leverera mer produkt med jämn kvalitet. Ansträngningar för att öka produktens avkastning har fokuserat på CHO cell Engineering och produktion linje screening, även om de mest betydande förbättringarna beror på framsteg inom media/feed strategi optimering och cellkultur miljökontroller1, 3 , 4 , 5 under tillverkningsprocessen.
Eftersom mAbs produceras i ett biologiskt system, det kan finnas inneboende protein variation. Antikropps sammansättningen kan ändras efter translationellt, såsom glykosylering eller påverkas av nedbrytning eller enzymatiska reaktioner. Dessa strukturella variationer kan framkalla farliga immunreaktioner eller Alter antikroppsbindning, vilket i sin tur kan minska eller eliminera den avsedda terapeutiska funktionen5. Således övervakas och kontrolleras kritiska kvalitetsattribut (CQAs) av monoklonala antikroppar-N-Glycan-profil, laddningsvariant-fördelning och procentandelen av antikroppar i monomerform-regelbundet som en del av en kvalitets design (QbD)-metod under tillverkningsprocesser1,6. I en reglerad produktionsmiljö måste terapeutiska proteiner uppfylla acceptanskriterier för att licensieras som en godkänd kommersiell drog produkt7. De metoder som presenteras häri skulle normalt vara en del av kvalitetskarakteriseringsprocessen för en antikropp7,8, och alla proteinforskare kommer att vara bekant med deras användning.
I tidigare arbete9har användning och drift av mikrobioreaktorer för hög genomströmning screening av cell odlingsförhållanden i uppströms bio bearbetning beskrivits. Den renade produkten som erhålls från de varierande medie förhållandena utsätts för N-Glycan-analys med LC-MS. Glykosyleringmönster av terapeutiska proteiner kan upptäckas och karakteriseras med LC-MS-tekniker10,11och förekomst av olika glykananalys arter har kopplats till Bioprocess parametrar såsom foder strategi, pH, och temperatur12. Effekten av de varierande medie förhållandena på produktens kvalitet, som anges med den procentuella andelen av det resulterande IgG i monomerform, utvärderas också med kromatografi med storleks uteslutning-multi-Angle ljusspridning (SEC-mals)13,14 , 15. laddningsvariant-profilen representerar ett antal ändringar16 som kan påverka en produkts funktion. Microcapillary Zone elektrofores (mcze) är en teknik som erbjuder en betydligt snabbare Analystid jämfört med traditionell katjonbytarkromatografi och kapillärisoelektrisk fokusering (CIEF) metoder som används för laddning variant analys17 ,18. Förbrukade bioreaktor medier analyserades för att spåra aminosyrekonsumtionen under proteinproduktionen eftersom det relaterar till förändringar i antikroppens identifierande attribut19,20,21,22 , 23.
Protein analys gör det möjligt för oss att identifiera kritiska processparametrar (CPPs) baserat på relationerna mellan process ingångar och förändringar i CQAs. Under processen för utveckling av Bioprocess visar identifiera och mäta CPPs fundamentalt processtyrning och säkerställer att produkten inte har förändrats, vilket är viktigt i starkt reglerade tillverkningsmiljöer. I detta papper, analytiska tekniker för att mäta några av de biokemiska egenskaperna hos det protein som är mest relevant för produkten CQAs (N-Glycan profil, laddningvarianter, och storlek homogenitet) presenteras.
Protocol
1. rening av antikroppar
Obs: equilibrationbufferten för den egna antikroppen är 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5. Den elutionsbuffert som används är 0,1 M ättiksyra. Buffertarna och hartsen (protein A) är beroende av den specifika antikroppen som renas. Kolumn volymen motsvarar kådan. Mängden mobil fas som används bestäms i termer av kolumn volym.
- Initialisera reningssystemet
- Öppna programvaran som är ansluten till reningssystemet. Med hjälp av manuella instruktioner, jämvikt kolonnen med equilibrationbufferten med en flödeshastighet på 2 ml/min för 40 min. stoppa den manuella körningen efter jämvikt.
- I fraktions samlaren, placera 15 mL koniska rör för att samla upp renad antikroppeluat och 50 mL koniska rör för att samla genomflöde under hög salt tvätt. Se till att fraktions insamlaren återställs till startpositionen genom att öppna och stänga bråk samlaren före början av körningen. Fraktionsamlaren bibehålls vid 7 ° c.
Obs: bråk samlaren kan återställas manuellt under fraktion Collector fliken i Inställningar, för både 15 ml och 50 ml rör.
- Prov injektion
Anmärkning: den skördade cell odlings vätskan som används i följande procedurer har erhållits från ovarialceller från kinesisk hamster odlade i automatiserade mikrobioreaktorer9.- Tillsätt 0,22 μm filtrerad skörd cellkultur vätska till en tom 12 mL spruta vars munstycke änden är utjämnade.
- Håll sprutan med munstycket vänd nedåt, sätt i sprutkolven tills en liten del av kolven är i. Att se till att vätskan inte läcker, vrid sprutan med munstycket vänd uppåt och ta bort locket.
- Fortfarande håller sprutan med munstycket vänd uppåt, tryck på cylindern för att skingra någon luft tills cellkulturen vätskan är på spetsen av munstycket. Sätt i sprutmunstycket i den manuella insprutnings porten på reningssystemet och vrid för att dra åt.
- Tryck ned kolven tills allt prov har injicerats och är synlig i den bifogade 10 mL-provslingan med stor volym.
- Öppna den sparade metod filen. Spara resultatfilen på önskad plats och ange filnamn när du tillfrågas. Hit Kör efter provet har injicerats i den stora volymen prov slinga.
- Köra reningsmetoden
- Välj den sparade metoden och klicka på Kör när du uppmanas av instrument programvara (steg 1.2.5).
Obs: systemet är inställt för att köra följande steg. Användaren behöver inte göra något medan instrumentet är igång. - Equilibrate kolonnen med tre kolonnvolymer (CVs) av equilibrationbufferten med en flödeshastighet av 2 mL/min. När kolonnen är jämvikt, kommer systemet, med hjälp av den stora volymens prov slinga, att injicera provet på kolonnen med en flödeshastighet på 1 mL/min.
- En droppe i UV-signal vid 280 nm indikerar att provet är färdigt lastning. Tvätta kolonnen med equilibrationbuffert med en flödeshastighet på 2 mL/min tills UV-signalen sjunker under 25 mAU.
- Använd fyra meritförteckningar på 25 mM Tris med 1 M NaCl vid pH 7,5 för att utföra en sekundär hög salt tvätt med en flödeshastighet på 2 mL/min. Systemet fraktion samlare kommer att samla in något protein/DNA som lossnar kolonnen under salt tvätt i 50 mL rör.
- Applicera fem CV i elutionsbufferten med en flödeshastighet på 1 mL/min för att eluera antikroppen från kolonnen. Samla upp eluatet i 15 mL-rör baserat på UV-signal; När UV 280 signalen är över 35 mAU, startar insamlingen; insamlingen avslutas när signalen sjunker under 50 mAU; Detta kallas Peak Cutting.
Obs: Peak Cutting säkerställer normalisering av elutionsprofiler och för att undvika elueringpeak tailing som kan innehålla protein aggregat24. - Tvätta kolonnen med hjälp av tre meritförteckningar för jämvikts buffert. Körningen avslutas efter TVÄTTNINGSSTEGET.
- Efter eluering neutraliserar omedelbart det renade proteinet med 1 M Tris bas till ett pH på ~ 5,5. Mät protein koncentrationen med en UV-VIS spektrofotometer med mikrovolym vid 280 nm och 260 Nm och förvara vid 4 ° c.
- Koncentrera den renade antikroppen med hjälp av centrifugalenheter (steg 2). Sedan ämne den renade antikroppen till glykananalys analys med LC-MS och efter aggregation profil analysera med SEC-mals (steg 3 & 4).
Anmärkning: den renade antikroppen bör inte frysas utan ytterligare buffertutbyte, eftersom täta frysnings cykler kan orsaka aggregering och nederbörd.
- Välj den sparade metoden och klicka på Kör när du uppmanas av instrument programvara (steg 1.2.5).
2. koncentration av renad antikropp
Obs: den Tris-acetat buffert är 0,1 M ättiksyra neutraliseras med 1 M Tris bas till ett pH på ~ 5,5.
- Sätt in 100 kDa-filter i centrifugrör.
- Tvätta filtren med 500 μL dubbelt destillerat vatten. Centrifugera i 10 minuter vid 14 000 x g vid rumstemperatur (RT). Upprepa detta steg två gånger. Kassera filtratet.
- Överför sköljfiltren till färska centrifugrör och tillsätt 500 μL prov till varje filter. Centrifugera i 10 minuter vid 14 000 x g.
- Invertera filtret till ett nytt spinn rör. Centrifugera i 2 min vid 1 000 x g för att samla upp det koncentrerade provet.
- Bestäm provkoncentrationerna med hjälp av en UV-VIS-spektrofotometer. Blanka spektrofotometern med en lösning av Tris-acetatbuffert. Använd en proteinutrotningskoefficient på 1,37 mL • (mg • cm)-1 vid 280 nm för en 1% (% m/v) IgG-lösning.
- Använd det koncentrerade provet för att bereda 12,5 μl av 2 mg/ml arbetslösning för glykananalys-analys och 30 μl 3,5 mg/ml arbetslösning för SEC-mals.
Obs: protokollet kan pausas här. Proverna ska förvaras i kylskåp vid 4 ° c. Vid koncentration av 2 mg/mL bör dessa prover vara stabila i minst tre månader vid 4 ° c, medan högre koncentrationer kan fällas ut.
3. analys av N-glykaner med hjälp av masspektroskopi
- N-Glycan märkning och isolering
- Börja med koncentrationer av antikroppar på 2 mg/mL i en lämplig buffert, såsom neutralt natriumfosfat, citrat eller HEPES buffert. Bered en intakt mAb-standard (t. ex. NIST mAb) på 2 mg/mL för att bearbeta tillsammans med de experimentella proverna för att fungera som en positiv kontroll.
Anmärkning: antikropparna bör vara i en slutlig buffert som inte innehåller något SDS och mindre än 0,1 mM nukleofiler (såsom Tris, DTT, glycin eller histidin). Säkerhetsdatabladet i provbufferten måste tas bort. Om nukleofiler är i bufferten, sedan späda ut dem eller utföra ett buffertutbyte eftersom de kommer att störa satsen. Det allmänna protokollet medföljer glykananalys-satsen. - Späd ut 7,5 μL av antikropparna med 15,3 μL LC-MS-grade vatten i 1 mL-rör som medföljer satsen och sedan denaturera med 6 μL 5% lösning av ett enzym vänligt och MS-vänligt tensid vid 90 ° c i 3 minuter.
- Kyl proverna i 3 minuter till rumstemperatur (RT). Tillsätt sedan 1,2 μL PNGase F och inkubera i 5 min vid 50 ° c.
- Efter kylning 3 min till RT, märk de klyvt N-glycans genom att tillsätta 12 μL fluorescerande märkreagens upplöst i vattenfri dimetylformamid (DMF) och vänta i 5 min. Späd den märkta N-glykanblandningen med 358 μL acetonitril (ACN).
- Placera en hydrofila interaktionskromatografi (HILIC) platta i ett vakuum grenrör med shims och spillbricka. Använd en flerkanalspipett för ett stort antal prover.
- Villkora brunnarna med 200 μL vatten, där vakuum justeras så att vätskan tar 15-30 s att passera genom HILIC harts. Equilibrate med 200 μl av 85% ACN före lastning av ACN-utspädd glykananalys-blandning (400 μl), applicering av vakuum efter varje ny vätska tillsätts till brunnarna. Tvätta hartset med 600 μL 1% myrsyra (FA)/90% ACN två gånger.
- Sätt tillbaka spillfacket med 600 μL uppsamlings rör. Eluera de märkta N-glykanerna med SPE elutionsbuffert (3 elutioner på 30 μL vardera) i uppsamlings rören. Späd de poolade elutionerna med 310 μL DMF/ACN-provspädnings medel. Pipettera proverna till Auto sampler injektionsflaskor för att vara redo för fluorescens (FLR)-MS-analys.
Obs: dessa prover är stabila vid förvaring vid-80 ° c i minst 1 månad. Förvara HILIC plattan i originalförpackningen, tejpade och inuti en exsickator för framtida bruk.
- Börja med koncentrationer av antikroppar på 2 mg/mL i en lämplig buffert, såsom neutralt natriumfosfat, citrat eller HEPES buffert. Bered en intakt mAb-standard (t. ex. NIST mAb) på 2 mg/mL för att bearbeta tillsammans med de experimentella proverna för att fungera som en positiv kontroll.
- LC-MS-analys av märkta N-glykaner
- Analysera de märkta N-Glycan elutionsproverna på ett UPLC-system (Ultra Performance vätskekromatografi) kopplat till en fluorescensdetektor och en fyrpolig tid-för-flygning (Q-ToF) masspektrometer. Använd en kolonn som är godkänd för kromatografisk separation av de märkta glykanerna och Värm till 60 ° c under separationer.
Anmärkning: kolonnen måste spolas med 60% acetonitril och 40% H2O före användning: 50 CVS före den första användningen eller 20 CVS om kolonnen har använts tidigare.- Använd 50 mM ammoniumformate (AmF) (tillverkad med mobilt faskoncentrat) och 100% LC-MS-grade ACN för mobila faser. AmF är känslig för pH-förändringar och är användbar för 1 månad efter blandning. Ställ in det initiala flödet till 0,4 mL/min, med LC-lutningen som ger ökad AmF under elutionsfasen.
- Ställ in FLR-detektorn på ex 265/EM 425 nm med en samplingsfrekvens på 2 Hz. Ställ in Q-TOF till MS1 positiv Jon känslighet, med ett Mass intervall på 100-2000 Dalton (da), en skannings tid på 0,25 sekunder och kontinuum datainsamling. Använd leucin enkefalin (2 ng/μl i 50% ACN/0.1% FA) för den interna massan referens, i "inte gäller korrigering"-läge.
Anmärkning: den interna massan referens korrigering kommer att tillämpas senare under databehandling. - Återsuspendera dextran-stegen sekventiellt i 22,5 μL av H2O, 25 μl dmf och 52,5 μl av ACN. Förbered 10 μL alikvoter för förvaring vid-80 ° c, eftersom stegen inte är stabil i mer än 24 h vid högre temperaturer (rumstemperatur, 4 ° c). Den dextran stege bryts ned efter mer än en frys-Tina cykel.
- Placera proverna i den automatiska provtagaren inställd på 10 ° c. Ladda en flaska med dextran stege tillsammans med prover, som retentionstid information om stegen kommer att användas för tilldelningar medan massan information som används för att validera identifieringar. Använd 10 μL injektioner för proverna och 7,5 μL injektioner för stegen. Injicera prover i tre exemplar. Kör den inlästa metoden.
- Analysera de märkta N-Glycan elutionsproverna på ett UPLC-system (Ultra Performance vätskekromatografi) kopplat till en fluorescensdetektor och en fyrpolig tid-för-flygning (Q-ToF) masspektrometer. Använd en kolonn som är godkänd för kromatografisk separation av de märkta glykanerna och Värm till 60 ° c under separationer.
- N-Glycan-identifiering för LC-MS-data
- Utför databehandling med ett program optimerat för hydrofila interaktionskromatografi fluorescensmasspektrometri (HILIC-FLR-MS) data.
- Tillämpa interna Mass referens korrigeringar i programmet. Bestäm injektionerna av dextran som "standard" i exempel informationen. I den analysmetod, ange separation sammansatta kvarhållningstider till de av stegen föreningar som upptäcktes under körningen.
- För att säkerställa att område% kommer att returneras för identifierade glykaner, ändra analysmetoden: under fliken bearbetning , klicka på Kvantitationsinställningar -kalibrera och Ställ in "kalibreringskurvan passar typ" till "relativ respons (%)".
4. analys av antikropps aggregering med SEC-MALS
- Provberedning
- Överför 3,5 mg/mL (steg 2) utspädd protein till en injektionsflaska med en 150 μL glasinsats. Använd en gel lastning tips för att Pipettera i den nedre klockan på skäret för att undvika införandet av bubblor.
- Locket injektionsflaskan med en septa Cap och analysera omedelbart. Förvaras vid 4 ° c vid senare analys.
- SEC-MALS konfiguration och jämning
Obs: analysera aggregering på SEC-MALS konfigurerad med en ultra högtrycks vätskekromatografi (UHPLC) med en MALS detektor och refraktiv index detektor som kontrolleras av MALS programvara.- Konfigurera en metod fil i UHPLC-programvaran för kontroll av UHPLC-systemet, ställa in flödeshastigheten till 0,4 mL/min med en mobil fas av 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (utspädd från 10X), injektionsvolymen till 5 μL, kolonntemperaturen till 25 ° c , och dioden array Detector (DAD) för att övervaka 280 nm. Ställ in körtid på 20 min. Equilibrate systemet i minst 4 h före någon provanalys.
- Gränssnittet mellan UHPLC och multi Angle ljus scattering-refractive index (MALS-RI) detektorer kräver användning av den analoga utgången på pappa. Ställ in DAD dämpning till 1 000 mAU i DAD Method File och AU/UV-inställning till 1 (UV-instrument ≫ kanaler ≫ kanal 1).
- Slå på pappa lampa 30 min före början analys och Ställ in våglängden till 280 nm. Töm referenscellen refractive index (RI) i 15 minuter eller tills baslinjen är stabil och stäng sedan referenscellen.
- Konfigurera SEC-MALS programvara sekvens, ställa in insamlingstiden till 12 min, injektionsvolymen till 5 μL, DN/DC till 0,185 mL/g, A280 utdöende koefficient om tidigare experimentellt bestäms eller till 1,37 mL * (mg * cm)-1, och koncentrationen av den Prov. Klicka på Kör och vänta tills dialogrutan "väntar på att injicera" visas på skärmen.
Anmärkning: A280-utrotningskoefficienten är specifik för proteinet av intresse och bör bestämmas experimentellt. - Konfigurera en exempel lista i UHPLC-programvaran i samma ordning som i MALS-RI-programvara och skicka.
Obs: det är viktigt att köra en system lämplighet kontroll före och efter en körning. Bovint serumalbumin vanligtvis används för att kontrollera maximal breddning, ett tecken på att SEC-kolumnen kan behöva rengöras eller bytas. Samma standard injektion av BSA kan användas för att specificera signal justering, toppbreddning och detektor normalisering.
-
Aggregerad analys med MALS programvara
- Klicka på fliken markerade procedurer. Ange den lägsta nivån av fördumma krav; ingen är vanligtvis tillräcklig.
- Kontrollera att baslinjerna har ritats korrekt och justera vid behov för LS1, LS2, LS3, RI och UV-kanaler. Ange det högsta området av intresse.
- Granska den molekylära Mass distributionen för att bekräfta att de anropade topparna innehåller partiklar av liknande storlek.
5. laddning variant analys
- Provberedning och märkning
- Börja med 80 μL av en 3,5 mg/mL antikropps lösning. Desalt provet med hjälp av en 0,5 mL avsaltning kolonn (7k MWCO). Förbered kolonnen genom att först knäppa av botten proppen, sedan lossa den övre proppen, och placera den i en 1,7 mL mikro-centrifug röret. Centrifugera avsaltning kolumnen i 1 min vid 1 500 x g.
Märk: Markera kolumnens utsida med en punkt så att den kan placeras i den ursprungliga orienteringen för nästa steg. - Överför kolonnen till ett nytt mikrocentrifugeringsrör. Tillsätt 80 μL utspädd protein till toppen av kolonnen. Justera kolumnen till den ursprungliga orienteringen. Centrifugera i 2 min vid 1 500 x g. Ta bort provet från centrifugen, kassera avsaltning och blanda provet väl.
Anmärkning: avsaltning krävs endast om prov matrisen innehåller primära aminer, hjälpämnen som kommer att förvanska provet elektrofores eller andra oförenliga substanser. - Späd provet till en slutlig koncentration på 2 mg/mL i en volym av 25 μL och tillsätt 5 μL av etiketteringsbufferten (se tabell över material: laddningsvariant reagenssats) på plattan 96-well. Förbered etiketteringsreagens genom att späda ut den nödvändiga mängden av märkning reagens (se tabell över material: Charge variant reagens kit) 1:30 i dimetylformamid. Inkubera provet i 10 min vid rumstemperatur från ljus.
Anmärkning: det är viktigt att Tina och sedan omedelbart använda denna reagens och använda den inom 10 min av blandning med DMF. - Efter inkuberingen, tillsätt 60 μL reagens grade vatten och blanda väl genom pipettering. Täck plattan med en plåt tätning och centrifugera plattan vid 1 000 x g i 1 min.
- Börja med 80 μL av en 3,5 mg/mL antikropps lösning. Desalt provet med hjälp av en 0,5 mL avsaltning kolonn (7k MWCO). Förbered kolonnen genom att först knäppa av botten proppen, sedan lossa den övre proppen, och placera den i en 1,7 mL mikro-centrifug röret. Centrifugera avsaltning kolumnen i 1 min vid 1 500 x g.
- Förbereda laddningsvariant-chip
- Förbered laddning variant chip genom att ta bort lagringslösning och tvätt brunnar 1, 3, 4, 7, 8 och 10 med vatten. Ersätt sedan vattnet med pH 7,2 löpbuffert (se tabell över material: Charge variant reagens kit).
- Tillsätt 750 μL pH 7,2-körningsbuffert till buffertröret och placera buffertröret på den angivna platsen i det övre vänstra hörnet av prov facket. Ta nu bort platttätningen från 96-brunnen plattan, tryck på utmatnings plattan på instrumentets användargränssnitt och sätt in plattan i gxii-provfacket.
Anmärkning: pH 7,2 buffertar användes för denna analys. pH 5.6-7.2 buffertar kan användas beroende på proteinet pI. Vid användning av lägre pH-buffertar kan längre prov körningstider krävas. - Tryck på knappen för att inaktivera chip på användargränssnittet. Se till att elektroderna är fria från partiklar, och om inte, rengör med en luddfri pinnpinne. När du sätter in chip se till att fönstret i mitten av chip är fri från partiklar eller fläckar. Rengör vid behov med en luddfri mjuk trasa.
Obs: när du arbetar med kapillärelektrofores chips, ta bort buffert genom vakuum aspiration, följt av omedelbar tillsats av nästa lösning för att förhindra att brunnar torkar ut. För att minimera införandet av bubblor, öva omvänd pipettering teknik. Vid hantering av chip, vara uppmärksam på den sköra kapillär sträcker sig från botten av chip, att se till att det inte torkar ut och inte bryta igenom grov hantering. - Stäng locket till spånkammaren och välj det HT- Proteinladdningsvariant -analysen. Klicka på knappen Kör . Följ anvisningarna för att välja provbrunnar, platttyp, Analystid (68, 90 eller 100 s) och filnamn. Klicka på Start i slutet av prompter.
- Chip Cleanup kräver tvättning av varje brunn 2x med vatten, följt av tillsats av Lagringsbuffert (se tabell över material: Charge variant reagens kit). En gång i lagringbufferten, Ersätt chip i instrumentet och, när du uppmanas, Välj HT protein Charge assay. På huvudskärmen väljer du tvätta på användargränssnittet. När du är klar, ta bort chippet, torka av elektroderna med vatten och en luddfri pinne och förvara chippet vid 4 ° c.
- Avgift variantanalys
- Öppna instrument analysprogram varan. Importera filen kör genom att gå till fil ≫ importera datafil... och klicka på önskad *. GXD fil. Endast namnet kommer att föras över till programvara, så byta namn på brunnarna är fördelaktigt (verktyg ≫ exempel namn redaktör). Markera de filer som ska exporteras genom att hålla ned SKIFT medan du markerar filerna. Klicka på arkiv ≫ exportera... och välj RAW-data rutan och sedan AIA-format låda.
- Öppna fliken Bläddra i projekt i analysprogram varan. Klicka på databas ≫ importera data... och välj den exporterade *. CDF-filer.
- När importerade, navigera till injektioner fliken, Välj de filer som ska analyseras, högerklicka och gå till processen... I fönstret som dyker upp, markera kryssrutan bredvid process och markera radio rutan "Använd specificerad bearbetningsmetod" och önskad bearbetningsmetod i listrutan. I listrutan direkt under etiketten "How:" Välj Kalibrera och Kvantitera. När bearbetas, navigera till fliken resultat och kontrollera integrationen av kromatogrammen.
Observera: bearbetningsmetoden måste verifieras för varje metod. Som utgångspunkt inkluderas parametrarna som används för den aktuella bearbetningsmetoden i tilläggsfilen.
Anmärkning: export av uppgifterna kan göras i form av en rapport eller så kan endast den maximala kvantifieringen exporteras. Dessa kan göras samma tid som bearbetning eller från resultatfönstret.
6. aminosyra analys
- Ställa in standardkurvan för kvantifiering av absolut aminosyra genom LC-MS
- Bered den förlängda aminosyran (EAA) blandningen genom att lösa upp 59,45 mg ASN, 59,00 mg HYP, 65,77 mg GLN, och 91,95 mg TRP i 25 mL av 0,1 N HCl. Den slutliga koncentrationen av varje aminosyra i EAA-blandningen är 18 nmol/μL.
- Förbered den interna standarden (ISTD) stamlösning genom att lösa 58,58 mg NVA och 44,54 mg SAR i 50 mL HCl.
- Förbered den kompletta aminosyran standarder genom att kombinera aminosyran stamlösning som innehåller Ala, ASP, arg, CYS, Glu, GLY, hans, Ile, Leu, met, Phe, Pro, ser, THR, TRP, Tyr, val vid 1 nmol/μL vardera med EAA blandningen för slutliga aminosyrekoncentrationer av 900 , 225, 90, 22,5 och 9 pmol/μL. Tillsätt det beredda ISTD-beståndet till aminosyrenormerna för en slutlig koncentration av antingen 90 pmol/μL eller 900 pmol/μL för att skapa "låga" och "höga" interna standarder som ska användas som positiva kontroller för metoden.
- Placera aminosyrekoncentrationerna i provflaskor i autosamplen i UPLC. Generera en kalibreringskurva (9 till 900 pmol/μL) i instrumentets programvara baserat på standardkoncentrationerna av aminosyran enligt följande instruktioner.
- Använd Q-ToF i elektrosprayjonisering (ESI) positivt känslighets läge kopplat till en UPLC för intakta aminosyreanalys. För kromatografisk separation, Använd en normal fas kolumn gjord för aminosyra separationer. Bered följande buffertar med masspektrometrigrade reagens: A = acetonitril + 0,1% myrsyra och B = 100 mM ammoniumformat. Ställ in LC-flödet till 0,6 mL/min och kolonntemperatur till 40 ° c.
- Använd följande 15-minuters gradientförhållanden för aminosyra separationer: 14% B (0-3 min), 14-100% B (3-10 min), 100% B (10-13 min), 100-8% B (13-14 min), 8% B (14-15 min).
- Använd kolumn listorna "exempel typ" och "conc A" i MS Acquisition program för att skapa en kalibreringskurva för framtida analys av rå bioreaktor media i kvantifieringsprogrammet. Om du vill att dessa kolumner ska visas i anskaffnings programmet använder du kommandot Anpassa bildskärm... när du högerklickar på den övre menyraden.
- Provet typ för aminosyran standarder kommer att vara "standard" medan medierna proverna kommer att "Analyte". Fyll i kolumnen "conc A" med de numeriska koncentrationerna av standarderna i de erforderliga enheterna (ex: pmol/μL).
- Kör de beredda aminosyran standardkoncentrationerna minst två gånger. Validera att UPLC-instrumentet och masspektrometern fungerar som de ska genom att kontrollera ISTD-topparna.
- Använd alternativet "redigera metod" i kvantitering-programmet för att skapa kvantifieringsmetoden (*. mdb-fil). Definiera alla aminosyror av intresse i kvantitationsprogrammet, till exempel det sammansatta namnet, m/z-värdet och förväntad retentionstid. Ändra integrations parametrarna för metoden här.
- Använd den skapade aminosyran metoden på standardproverna för att skapa kalibreringskurvan. Den här kurvan kan exporteras till en *. CDB-fil för användning med medieproverna med hjälp av kommandot exportera ≫ kalibrering... .
- I kvantitering-programmet sparar du önskad layout till en *. qlt-fil för framtida datauppsättningar med hjälp av "Spara layout som...". Namn (insprutnings namn), Area och conc är de viktigaste utgångs kolumnerna.
- Aminosyra analys av råolja bioreaktor media av LC-MS
- Centrifugera rå bioreaktor media vid 1 962 x g i 5 minuter och passera genom ett 0,22 μm filter.
- Följ upp med en perklorsyra sanering för att ta bort protein och partiklar: blanda den filtrerade bioreaktor media med 0,4 N HClO4 vid ett 1:1-förhållande och centrifugera vid 14 700 x g för 5 min vid RT. samla in de förtydligade medierna i autosampler injektionsflaskor.
Obs: justera injektionsvolymen efter behov för att få aminosyrekoncentrationerna att falla inom kalibreringsområdet. Beroende på instrumentet kan injektionsvolymen justeras mellan 0,1 μL och 10 μL. - Kör medieprover i tre exemplar av LC-MS. Använd "process exempel" under kvantitering-programmet tillsammans med metoden (*. mdb) och kalibrerings filen (*. CDB). Metoden och kalibreringskurvan kommer automatiskt att appliceras på de råa medieproverna av kvantifieringsprogrammet när alla injektionerna är slutförda.
- Om du vill exportera data för analys i ett annat program (till exempel ett kalkylblad) använder du kommandot "Skriv ut" och skapar en *. XPS-eller *. pdf-fil.
Representative Results
Den skördade cell odlings vätskan från den automatiserade mikroskalningsbioreaktorn renas med hjälp av snabb proteinvätskekromatografi (FPLC), vilket framgår av figur 1 och de renade proteinernas kritiska kvalitetsattribut (CQAs) kännetecknades av olika analysmetoder nedströms. Detta är en viktig fördel med det automatiserade mikrobioreaktorsystemet. skillnader i CQAs kan snabbt bedömas i ett brett spektrum av villkor. N-Glycan-data från CHO-producerade mAbs som bearbetas med masspektrometri bör framstå som de kromatogram som visas i figur 2. Figuren skildrar en jämförelse mellan två kromatogram som visar att mannos 5-toppen (M5) från ett prov är betydligt lägre. Om endast en bullrig baslinje observeras i stället för toppar, kan detta innebära att kromatografiinstallationen är felaktig eller att förfarandet inte lyckas. Med hjälp av kontroller kan felsökning förenklas. Först, bedöma FLR toppar från dextran stege; Dessa toppar indikerar att kromatografisystemet fungerar som det ska. Jämför sedan experimentellt erhållna toppar med de som erhållits från en bearbetad intakt mAb-standard. Om toppar från standarden är synliga, men inga prov toppar identifieras, bearbetas inte mAb-proverna på rätt sätt. Detta kan bero på SDS eller nukleofil närvaro i bufferten stör N-Glycan märkning och rening.
SEC-MALS kan användas för att bedöma ytterligare två CQAs: sammansättnings profilen och molekylvikten för antikroppen. Ett representativt SEC-MALS kromatogram är jämförbart med det som visas i figur 3. Den molekylära Mass distributionen och den absoluta molekylvikten fastställdes med hjälp av den erforderliga programvaran med en utrotningskoefficient på 1,37 mL * (mg * cm)-1 och en dn/dc på 0,185 ml/g. Som Peak Calling och ställa in baslinjen i programvaran utförs manuellt, kan resultaten variera något från användare till användare. Den absoluta molekylvikten för monomerigg1 från figur 3 är 1,504 x 105 da ± 0,38% (blå) och den högre ordningens komplex är 7,799 x 105 da ± 3,0% (röd). Aggregatens polydispersitet är mycket större än monomeren, vilket indikeras av den röda molar Mass fördelningen av topp 1 (figur 3). Den lilla mängden prov och betydelsen av aggregering som en CQA göra denna teknik ett mycket värdefullt kompletterande analytiskt verktyg för att den automatiserade microbioreactor systemet.
Resultatet av mCZE är ett electropherogram, såsom i figur 4, som visar laddningsvariant profil för en monoklonal antikropp. Profilen är en unik signatur för det protein som undersöks och är mycket känsligt för pH i drift. Även synlig är en fri färg topp till vänster om laddningsvariantprofilen. Vid upprättande av ett operativt pH finns det en viss diskretion för operatören att balansera upplösning och signal; Dessutom måste operatören säkerställa god separation från fri-Dye topp som migrerar på ~ 30 s. Provet kan avsaltas efter märkning för att ta bort denna topp, även om detta leder till en betydande förlust i signalen. När ett operativt pH har upprättats kan prov profilerna jämföras. Även i allmänhet konsekvent, förändringar i märkning effektivitet eller skillnader i hjälpämnen kan leda till mindre skillnader i migration av ett prov och avgiften variant profil gör elektropherograms svårt att direkt jämföra. I stället baseras jämförelsemetoden vanligtvis på procentsatserna för grundläggande, huvudsakliga och sura arter. I det här fallet kan relativa skillnader så små som 1-2% identifieras med hjälp av mCZE.
Aminosyran konsumtion kan övervakas för att avgöra om utarmning orsakar förändringar i CQAs. Kromatogramavläsning från masspektrometern kan användas för att utvärdera den lyckade skapandet av en kalibreringskurva för den absoluta kvantifieringen av aminosyror i prover av rå bioreaktor media. Figur 5 visar två totala JONKROMATOGRAM (Tic) och en extraherad jonkromatogram (XIC) som representativa resultat under denna process. I figur 5A, visar den Tic visas bakgrunds signalen från Buffertsystemet som endast en vatten blank injicerades. Figur 5 B skildrar en representativ Tic av aminosyran standard där, jämfört med vattnet tomt, små toppar som motsvarar de enskilda aminosyran arter kan observeras (såsom lysin vid 7,96 minuter). För att integrera toppen och underlätta kvantifiering av Peak Area (och därmed koncentrationen) används XIC där endast signalen från ett definierat "kromatogrammasfönster" visas. Beroende på instrumentets känslighet och kvaliteten på den kromatografiska separationen måste det optimala Mass fönstret bestämmas av användaren. I detta exempel (figur 5C) visas XIC av lysin (m/z = 147,1144) med ett Mass fönster på 10 ppm där lysin i aminosyran eluera av kolonnen vid 8,03 minuter.
Figur 1 . Representativt kromatogram av reningssystemet med hjälp av FPLC-tekniken (fast Proteinvätskekromatografi). Renings metodens faser som motsvarar volym (mL) är märkta längs x-axeln. UV-absorbans vid 280 nm (mAU y-axel, solid linje) övervakas under hela renings cykeln. Icke-specifikt bundna orenheter förskjuts genom att öka ledningsförmågan (mS/cm y-axel, streckad linje) under den höga Salttvätt. antikroppen elueras från protein en kolumn med införandet av elutionsbuffert (conc B, Prickig linje) när pH minskar till 4 (inte visas). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Ett representativt fluorescenskromatogram som erhålls från märkta glykaner som är massan kontrollerade. X-axeln är retentionstid (minuter) medan y-axeln är signalintensitet. Toppen på 14,94 min representerar Mannose 5 (M5) glykan, där en stor skillnad mellan M5 signalstyrkan kan observeras mellan de två prover som är överlagda. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Molekylvikt fördelning av IgG1 monoklonal antikropp. Kromatogram av en intakt IgG1 monoklonal antikropp, separerad efter storleks uteslutning i 1x PBS (pH 7.4). Absorbans övervakas vid 280 nm (svart; vänster axel) och ljusspridning och refraktiva index detektorer användes för att beräkna den absoluta molekylvikten för varje topp (röd och blå; höger axel). Högmolekylära arter indikeras med toppen märkt "HMW". Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Laddnings variantprofil för en IgG1 monoklonal antikropp. Detta elektroferogram genereras på en mcze-plattform. En fri-Dye Peak migrerar på ~ 30 s och är väl separerade från IgG1. För kvantifiering delades toppar i grundläggande, huvudsakliga och sura arter med hjälp av instrumentdata analysprogramvara. Den röda linjen beskriver de integrerade topp områdena. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Representativa resultat av jonkromatogrammen för masspektrometri-baserad aminosyra analys av rå bioreaktor media. X-axeln är tid (minuter) medan y-axeln är signalintensitet (a) en vatten blank fungerar som den negativa kontrollen och avslöjar den bakgrunds signal som observerats under loppet av den vätskekromatografigradienten (B) 225 pmol/μl Amino Acid standard används här som en positiv kontroll, eftersom de individuella toppar som observeras i detta totala jonkromatogram representerar de olika aminosyrorna i standard blandningen som löses kromatografiskt /z 147,1144, vilket är lysin. Den 7,96 min topp i B motsvarar 8,03 topp i C av lysin. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
HCCF innehåller skräp och stora partiklar som kan täppa till och förstöra dyr instrumentering, så kultur förtydligande behövs innan ytterligare nedströms bearbetning. Centrifugering är i allmänhet det första sättet att separera celler och andra olösliga partiklar från proteiner följt av filtrering. Denna filtrerade HCCF utsätts sedan för snabb Proteinvätskekromatografi (FPLC) för rening. Rening av HCCF från automatiserade mikrobioreaktorer för att få produkten är ett viktigt steg i nedströms bearbetning. Här används ett bänkmonterade FPLC-system med ett protein a-kolonn för att erhålla monoklonala antikroppar från hccf. Analys för uppströms processer kan ge värdefull insikt i cellens beteende och vägleda Bioprocess design, vilket hjälper till att få en konsekvent och tillförlitlig kvalitetsprodukt. Med Analytics kan vi också länka kritiska kvalitetsattribut (CQAs) till processer uppströms och nedströms. Här presenteras fyra analyser som vanligen används vid karakterisering av monoklonala antikroppar. Dessa tekniker är robusta, pålitliga och lätt att driftsättas för process-och produktanalys från en mängd olika uppströms källor som endast är delvis renade och kan fortfarande innehålla restnivåer av DNA och HCP.
Vid rengöring av prover för analys, måste en viktig balans uppnås mellan att skapa ett prov som är tillräckligt ren för analys samtidigt som variationen i bio reaktorn bibehålls. De två vanligaste föroreningarna som påverkar produkten är DNA och HCP, som kan kontrolleras genom att mäta förhållandet absorbans vid 260/280 nm och genom SDS-PAGE eller μCE-SDS. De analyser som presenteras här är inte känsliga för låga halter av DNA-innehåll. Produktens renhet är > 95% ren, bestämd enligt μCE-SDS.
Charge variant analys med ett microcapillary elektrofores system ger en hög genomströmning metod för att identifiera laddningsvarianter, med chips och reagens som är relativt lätt att genomföra. Arten av tekniken och kemin i märkningen reagens är både känsliga för hjälpämnen och andra primära aminer, vilket kräver en avsaltning steg för de flesta prov matriser. Från erfarenhet, låga nivåer av DNA sammigrera med fri-Dye från märkningen reaktionen och påverkar inte kvaliteten på resultaten. Medan variationen av grundläggande, huvudsaklig, och sura toppkvantifiering är typiskt < 1%, högre nivåer av DNA och andra föroreningar kan öka variationen av analysen. Det är oerhört viktigt att vara förenlig med proteinhalten och säkerställa en snabb användning av DMF efter avlägsnande från flaskan och blandas med färgämnet. Lysin och/eller histidin standarder rekommenderas som märkning kontroller. Med tiden och beroende på prov kvalitet, kan chips foul eller förlora beläggningen på mikrofluidics kanaler, vilket leder till större buller, närvaron av Ghost toppar, och större prov-till-prov variation. För att identifiera denna förekomst analyserades ämnen och en system lämplighet standard (dvs. NISTmAb) samtidigt med proverna med jämna mellanrum. När spånproblem uppstår kan spånorna tvättas med förvaringslösningen eller bytas ut.
De metoder som används för glykananalys analys av terapeutiska glykoproteiner främst innebär vätskekromatografi (LC) och/eller masspektrometri (MS), med lektin Microarray analys ökar i popularitet som ett tredje alternativ25. Den metod som beskrivs i detta dokument använder både LC och MS, som har fördelar och nackdelar. Masspektrometriska metoder har fördelen av massverifiering av de analyserade glykanerna, vilket inte är möjligt med LC-baserade metoder som använder en fluorescerande detektions utgång eller lektin Microarrays. Den här metoden använder LC och fluorescensdetektion för att tilldela glykananalys identiteter med hjälp av retentionstid jämförelse med en dextran stege standard. Fluorescens-övervakning möjliggör ökad känslighet och kvantifiering på grund av enkelheten i dess detektion, där MS Alone kanske inte kan kvantifiera låg förekomst arter på grund av den dåliga joniseringseffektiviteten hos oligosackarider. Mass informationen från MS används för att bekräfta glykananalys-identiteter, men bearbetnings programmet använder inte massinformation som primära tilldelningskriterier. Därför, utan reproducerbar kromatografi och lätt matchas toppar, denna metod kan lida om glykananalys uppdrag. Lyckligtvis kan massan information hjälpa till med glykananalys uppdrag även i situationer när kromatografi är subpar, såsom Skift i retentionstiden som hindrar reproducerbara glykananalys tilldelningar. Om denna metod används utan MS, skall kromatografin vara på den högsta nivån eftersom massinformation inte kan användas för att korrigera uppehålls tids drift.
Aminosyran analysmetod som beskrivs här använder LC-MS för snabb kvantifiering av underivatiserade aminosyror i rå cellkultur media. Alternativa aminosyra analysmetoder kräver aminosyran derivatisering agenter för att möjliggöra UV-detektion26. LC-MS-metoden ger viktiga fördelar jämfört med LC-UV-metoden: den möjliggör identifiering baserad på både retentionstid och Jon massa i motsats till LC-UV-metoden, som begränsas av en brist på Mass karakterisering. Dessutom, LC-MS-metoden erbjuder tid och reproducerbarhet fördelar, eftersom LC-UV-metoden kräver en tidskrävande derivatisering reaktion, som kan ge prov variation27. Emellertid, injektion av rå cellkultur media i LC-MS-metoden kan orsaka skadliga effekter på MS signal på grund av Jon skimmer nedsmutsning. En kalibrerings stege injiceras ofta som en system lämplighet kontroll, och prov beställning är slumpmässigt för att förhindra bias i data.
Cellodlingsprocessen för produktion av antikroppar med hjälp av mikrobioreaktorer beskrivs tidigare9. I denna studie är detaljerade protokoll för metoder för att karakterisera monoklonala antikroppar som maximerar data som erhållits från begränsade provvolymer väldefinierade. Begränsade mängder av skördad cellkultur vätska kan ibland begränsa den förvärvade produktinformationen och urvalet av rätt analytiska förfaranden för att få Produktkvalitets data är viktigt. Analys är viktigt att länka samman uppströms processparametrar till förändringar i produktkvalitet. Här finns en riktlinje för användare att karakterisera mAbs när man arbetar med mikrobioreaktorer.
Disclosures
Denna publikation återspeglar författarens åsikter och bör inte tolkas som företräder FDA: s åsikter eller politik.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja tacka Scott LUTE för det analytiska stöd han tillhandahöll. Partiell intern finansiering och stöd för detta arbete tillhandahålls av CDER Critical Path-programmet (CA #1-13). Detta projekt stöds delvis av en utnämning till praktik/forskning deltagande program på kontoret för bioteknikprodukter, US Food and Drug Administration, administreras av Oak Ridge Institute for Science and Education genom en institutionsöverskridande avtal mellan USA: s energidepartement och FDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| Akta Avant 25 | General Electric Life Sciences | 28930842 | |
| Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin | Millipore Sigma | 115115830 | Purification Stationary Phase |
| Omnifit 10cm Column | Diba Fluid Intelligence | 006EZ-06-10-AA | Housing for Stationary Phase |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Superloop 10 mL | GE Healthcare | 18-1113-81 | |
| µDawn Multi Angle Light Scattering Detector | Wyatt | WUDAWN-01 | |
| 0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane | Merck Millipore | SLGV033RB | |
| 10X Phosphate Buffered Saline | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mL Syringe | Covidien | 8881512878 | |
| 1290 Infinity Binary Pump | Agilent Technologies | G4220A | |
| 1290 Infinity DAD | Agilent Technologies | G4212A | |
| 1290 Infinity Sampler | Agilent Technologies | G4226A | |
| 1290 Infinity Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent Technologies | G1316C | |
| 15 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352097 | |
| 150 uL Glass Inserts with Polymer Feet | Agilent Technologies | 5183-2088 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352070 | |
| 96-Well Plate | Bio-Rad | 127737 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695072 | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | BPA996-4 | |
| ACQUITY I-Class UPLC BSM | Waters Corporation | 18601504612 | |
| ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager | Waters Corporation | 186015000 | |
| ACQUITY UPLC FLR Detector | Waters Corporation | 176015029 | |
| Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters | Merck Millipore | UFC810096 | |
| Amino Acid Standard, 1 nmol/µL | Agilent Technologies | 5061-3330 | |
| Amino Acid Supplement | Agilent Technologies | 5062-2478 | |
| Ammonium Formate Solution - Glycan Analysis | Waters Corporation | 186007081 | |
| Blue Screw Caps with Septa | Agilent Technologies | 5182-0717 | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
| Charge Variant Chip | Perkin Elmer | 760435 | |
| Charge Variant Reagent Kit | Perkin Elmer | CLS760670 | |
| Chromatography Water (MS Grade) | Fisher Chemical | W6-4 | |
| Dimethylformamide | Thermo Scientific | 20673 | |
| Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters Corporation | 186001831 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
| GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 Sample | Waters Corporation | 176003712 | |
| GXII Buffer Tubes | E&K Scientific | 697075- NC | |
| GXII Detection Window Cleaning Cloth | VWR | 21912-046 | |
| GXII HT Touch | Perkin Elmer | CLS138160 | |
| GXII Ladder Tubes | Genemate | C-3258-1 | |
| GXII Lint-Free Swab | ITW Texwipe | TX758B | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Intact mAb Mass Check Standard | Waters Corporation | 186006552 | |
| Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm | Imtakt | WAA25 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840274100 | |
| Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector | Wyatt | WTREX-11 | |
| Perchloric acid | Aldrich Chemistry | 311421 | |
| Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels | Labcon | 1034-960-008 | |
| Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 | |
| RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder | Waters Corporation | 186007982 | |
| Screw Top Clear Vial 2mL | Agilent Technologies | 5182-0715 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium Iodide | Sigma Aldrich | 383112 | |
| TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L | Tosoh Biosciences | 003449 | |
| UNIFI Scientific Information System | Waters Corporation | 667005138 | |
| Vacuum Manifold Shims | Waters Corporation | 186007986 | |
| Vacuum Pump | Waters Corporation | 725000604 | |
| Xevo G2 Q-ToF | Waters Corporation | 186005597 | |
| Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL | Thermo Scientific | 89883 |
References
- Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach. , (2004).
- New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA. , Available from: https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm (2015).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127, 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).
- Rathore, A. S. Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products. Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).
- International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH. , ed specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products Q6B (1999).
- Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level. Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).
- Yang, J. -M., et al. Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).
- Agarabi, C. D., et al. Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).
- Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions. Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).
- Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).
- Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).
- Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).
- Han, H., Livingston, E., Chen, X. High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis. Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).
- Wheeler, T. D., et al. Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants. Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).
- Carrillo-Cocom, L., et al. Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody. Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).
- Chen, P., Harcum, S. W. Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells. Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).
- Xing, Z., et al. Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production. Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).
- Fan, Y., et al. Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation. Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).
- Read, E. K., et al. Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture. Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).
- Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).
- Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins. MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).
- Wahl, O., Holzgrabe, U. Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes. Talanta. 154, 150-163 (2016).
- Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).
