Analyse de repliement des protéines, des transports et dégradation dans les cellules vivantes par radioactifs Pulse Chase

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour une méthode de chasse générale qui permet l’analyse cinétique de pliage, le transport et la dégradation des protéines qui doivent être suivies dans des cellules vivantes.

Résumé

Marquage radioactif pulse-chase est un outil puissant pour l’étude de la maturation conformationnelle, le transport vers leur localisation cellulaire fonctionnelle et la dégradation des protéines cibles dans des cellules vivantes. En utilisant les radiolabeling temps courts (impulsion) (< 30 min) et étroitement contrôlé fois chase, il est possible d’étiqueter seulement une petite fraction de la piscine de protéines totales et suivre son pliage. Lorsqu’il est combiné avec non-réducteurs/réduire l’électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) et immunoprécipitation avec des anticorps (conformation spécifique), processus de pliage peut être examiné en détail. Ce système a été utilisé pour analyser le repliement des protéines avec une énorme variation de propriétés telles que des protéines solubles, des protéines transmembranaires simples et multi-pass, fortement protéines N - et O-glycosylées et des protéines avec ou sans une vaste disulfure collage. Méthodes de chasse sont à la base des études cinétiques dans une gamme de fonctionnalités supplémentaires, notamment des co - et des modifications post-traductionnelles oligomérisation et polymérisation, essentiellement en permettant l’analyse d’une protéine de la naissance à la mort. Études de Pulse-chase sur le repliement des protéines sont complémentaires avec d’autres méthodes biochimiques et biophysiques pour l’étude des protéines in vitro en offrant une résolution temporelle accrue et des informations physiologiques. Les méthodes décrites dans cet article sont facilement adaptés pour étudier le repliement des presque toute protéine qui peut être exprimé dans les systèmes de mammifères ou des insectes-cellule.

Introduction

Le repliement des protéines de même relativement simple implique plusieurs différentes enzymes pliants, chaperons moléculaires et modifications covalentes¹. Une reconstitution complète de ces processus in vitro est pratiquement impossible, étant donné le grand nombre de différents composants impliqués. Par conséquent, il est hautement souhaitable, pour étudier le repliement in vivo, dans des cellules vivantes des protéines. Techniques de chasse radioactifs s’avérer un outil puissant pour l’étude de la synthèse, pliage, transport et la dégradation des protéines dans leur environnement naturel.

Le mét....

Protocole

Tous les réactifs radioactifs et les procédures ont été traitées conformément aux règlements et les règles locales de rayonnement de l’Université d’Utrecht.

1. pulse Chase

1. Pulse-Chase pour les cellules adhérentes
   NOTE : Les volumes donnés ici sont basées sur les boîtes de culture cellulaire 60 mm. Pour 35 mm ou 100 mm plats, multiplier les volumes de 1/2 ou 2, respectivement. Ce protocole utilise un temps d’impulsion des temps 10 min et chase de 0, 15, 30, 60, 120 et 240 min. Ceux-ci peuvent varier selon les protéines spécifiques à l’étude (voir ci-dessous).
   1. Semences de cellules adhérentes (p. ex.<....

Résultats

Le repliement et la sécrétion de la gp120 du VIH-1 d’un chase impulsion adhérentes est illustré à la Figure 2. Le gel non réductrice (NR de cellules dans la figure) montre le repliement oxydatif de gp120. Immédiatement après la pulsion d’étiquetage de gp120 5 min (0 min chase) apparaît comme une bande diffuse plus élevée dans le gel, et à mesure que progresse la chase, la bande migre vers le bas le gel grâce à encore plus diffus pliage intermédiaires (IT) jus.......

Discussion

Les méthodes Pulse-chase ont été essentiels pour développer la compréhension des scientifiques de protéine pliage dans les cellules intactes. Alors que nous avons tenté de fournir une méthode qui est aussi générale que possible, cette approche a le potentiel pour des variations presque infinies étudier les divers processus qui se produisent pendant le pliage, le transport et la vie des protéines à l’intérieur de la cellule.

Lors d’une poursuite de l’impulsion à l’aide de cellules adhérentes da.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,5 mL tubes à centrifuger safeseal	Sarstedt	72.706.400
Acide acétique	Sigma	A6283	acétique glacial
BAS Écran de stockage au phosphore 20x25 cm	GE Life Sciences	28956475
Bromophenol Blue	Sigma	B8026	Qualité biologie moléculaire
Carestream Biomax MR films	Kodak	Z350370-50EA
Milieux de culture cellulaire	Divers	S.O	. Milieux de culture cellulaire normaux pour des lignées cellulaires spécifiques utilisés
Milieux de culture cellulaire, sans méthionine/cystéine	Divers	S.O	Même formulation que les milieux de culture normaux, p.ex. DMEM/MEM/RPMI, sans méthionine ni cystéine
Papier filtre à charbon de bois	Whatman	1872047
Pointes de pipette filtrées au charbon de bois	Moléculaire bioproduits	5069B
Charbon de bois vacu-guard	Whatman	67221001
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma	112,553	pour l’électrophorèse
Cysteine	Sigma	C7352	Qualité de biologie moléculaire, Fabriquer un stock de 500 mM, stocker à -20  ;
Dithiothréitol (DTT)	Sigma	10197777001	Qualité de biologie moléculaire
EasyTag Express35S Mélange d’étiquetage des protéines	Perkin Elmer	NEG772014MC	D’autres lots d’étiquettes de taille sont disponibles en fonction de l’utilisation
EDTA	Sigma	E1644	Qualité de biologie moléculaire
Équipement de séchage de gel	Divers	N/A
Glycérol	Sigma	G5516	Biologie moléculaire grade
3 papier de chromatographie	GE Life Sciences	3003-917
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	24020117
Kimwipes lingettes de travail délicat	VWR	21905-026
MES	Sigma  ;	M3671	Biologie moléculaire grade
Méthanol	Sigma	MX0490  ;
Méthionine	Sigma	M5308	Qualité biologie moléculaire, Fabriquer un stock de 250 mM, stocker à -20
Équipement de coulée/fonctionnement Minigel	Divers	N/A
NaCl	Sigma	S7653	Biologie moléculaire grade
N-éthylmaléimide	Sigma	E3876	Biologie moléculaire, Fabriquer 1M de stock en 100 % éthanol, stocker à -20
PBS	Sigma	P5368	Biologie moléculaire grade
Protein-A Sepharose fastflow beads	GE health-care	17-5280-04
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	Sigma	L3771	Biologie moléculaire grade
Triton X-100	Sigma	T8787	Grade de biologie moléculaire
Trizma base (Tris)	Sigma	T6066	Grade de biologie moléculaire
Typhoon IP Imageur biomoléculaire	Amersham	29187194
Unwire Éprouvette Rack 20 mm pour bain d’eau	Nalgene	5970-0320PK

acide .