Summary
מאמר זה מספק שיטה לבודד טהור עובריים רקמות מעוברים שליו ועוף שניתן לשלבם לטופס ex-vivo האיברים chimeric.
Abstract
היכולת לבודד את רקמות עובריים היה צעד חיוני להקמת המערכת כמירה שליו-עוף, אשר בתורו סיפקה תרומות ללא עוררין חשיפת תהליכים מרכזיים בביולוגיה התפתחותית.
בזאת הוא תיאר שיטה ממוטבת כדי לבודד עובריים רקמות שליו ותרנגולות למיקרו, עיכול אנזימטי תוך שמירה על המאפיינים הביולוגיים שלו. לאחר בידוד, רקמות בשני המינים קשורים בשום וזמינותו organotypic במבחנה עבור 48 ה שליו, עוף רקמות ניתן שיפלו על ידי נפרדים תכונות גרעיניות סמנים מולקולריים המאפשר חקר הסלולר צולבות לדבר בין האגודה heterospecific של רקמות. גישה זו היא, אפוא, כלי שימושי עבור לימוד אינטראקציות רקמות מורכבות בתהליכים התפתחותיים עם השינויים מרחבי דינמי מאוד, כגון אלה המתרחשים במהלך מורפוגנזה לועי ואת היווצרות במעי הקדמי נגזר האנדודרם איברים. בגישה ניסויית זו פותחה לראשונה כדי לחקור את האינטראקציות אפיתל mesenchymal במהלך השלבים המוקדמים של היווצרות בלוטת התימוס. בחודש זה, נגזר האנדודרם rudiment הרתי פוטנציאליים, נגזר והמזודרם מזנכימה, הם בודדו אותנו מהמתרחש עוברי שליו ועוף, בהתאמה.
הקיבולת של הרקמות הקשורים להפקת איברים יכול להיבדק עוד יותר על ידי הרכבה אותם על גבי קרום chorioallantoic (CAM) של העובר עוף. מצלמת מספק חומרים מזינים ומאפשרת חילופי גז הרקמות explanted. לאחר 10 ימים בפיתוח ovo, ניתן לנתח את האיברים chimeric ב explants שנקטפו על ידי שיטות קונבנציונליות מורפולוגי. הליך זה מאפשר גם לומד רקמות ספציפיות תרומות במהלך היווצרות האיברים, של התפתחותו הראשונית (פיתוח במבחנה) בשלבים האחרונים של organogenesis (בשלבי פיתוח ovo).
לבסוף, שיטת בידוד משופר מספק גם three-dimensionally (3D) לשימור רקמות עובריים, יכול לשמש גם לניתוח הטופוגרפי ברזולוציה גבוהה של דפוסי ביטוי גנים של רקמות ספציפיות.
Introduction
בשנות השבעים המוקדמות, מערכת אלגנטיות תרנגולת-שליו כמירה פותחה על ידי Le Douarin, פתיחת דרכים חדשות כדי להבין את התפקיד של נדידת תאים אינטראקציות סלולרי במהלך פיתוח1,2. המודל הומצאה על ההנחה כי התא החליפין בין שני המינים לא כן משמעותית מופרה, מאוחר יותר מאושרת כאשר חקר תהליכים התפתחותיים רבים, כולל הקמת לחוצה, את hematopoietic מערכות1. לוקחים שהאחרון כדוגמה, הגלים מחזורית של אבות hematopoietic colonizing תחילתו אפיתל הרתי קודם נצפתה באמצעות מערכת כמירה שליו-עוף3. בשביל זה, הטריטוריה פוטנציאליים של בלוטת התימוס, האנדודרם של השיטה השלישית, הרביעית בלוע (3/4PP), היה, enzymatically מבודדים מעוברים שליו (q) בשלב 15 עד 30 - somite [היום עובריים (E) 1.5-E2.5]. שלבים אלה תואמות המבורגר ועוף המילטון4 (HH) - שלבים 12-17. ההליכים בידוד התחיל עם השימוש של טריפסין מביצועם enzymatically את האנדודרם מ מזנכימה המצורפת. האנדודרם מבודד היה הושתל לתוך האזור somatopleura של העובר עוף (c) מארח ב- E3-E3.5 (HH-שלבים 20-21). מזנכימה heterologous זה נחשב "מתירניות" להתפתחות אפיתל הרתי לתרום גם היווצרות האיברים3. לאחר מכן, גלים רצופים של עוף מארח נישא בדם ובתאים הסתננו שליו התורמת הרתי אפיתל המקביל לו לתרום התימוס היווצרות העובר מארח3.
לאחרונה, גירסה שונה של גישה זו גם הוכח להיות חשוב ללמוד אינטראקציות אפיתל mesenchymal במהלך השלבים המוקדמים של היווצרות בלוטת התימוס5. במובן זה, הרקמות המעורבים היווצרות של בלוטת התימוס חוץ רחמי העוברים chimeric3 היו מבודדים, שניהם מעוברים התורם ואת המארח, ומקושרת ex-vivo. פרוטוקול משופרת שימש כדי לבודד את האנדודרם 3/4PP שליו (E2.5-E3) ווהמזודרם somatopleura את העוף (E2.5-E3). בקצרה, רקמות עובריים היו מבודדים על ידי תיאום ובכפוף במבחנה pancreatin עיכול. כמו כן, התנאים של עיכול אנזימטי, טמפרטורה וזמן של דגירה אופטימציה על פי סוג הרקמה שלב התפתחותי (טבלה 1).
בשלב הבא, הרקמות מבודד היו משויך של organotypic במערכת חוץ גופית על 48 שעות, כפי שדווחה בעבר5,6. האגודה במבחנה של רקמות מחקה באינטראקציה תאית מקומי העובר, להתגבר על הגבלות מסוימות של המניפולציה ויוו. מערכת זו היא שימושית במיוחד ללמוד באינטראקציה תאית אירועים morphogenic מורכבים, כגון הפיתוח של מנגנון בלוע.
התרומה של כל רקמות התימוס histogenesis, כמו גם את היכולת של האגודה heterospecific כדי להפיק התימוס יכול להיות עוד יותר בחנו באמצעות מצלמת מתודולוגיה, מפורט בעבר5,7,8. תמציתי, הרקמות בתרבית היו הושתל אל מצלמת cE8 עוברי, מותר לפתח ovo במשך 10 ימים. לאחר מכן, היווצרות בלוטת התימוס הוערך על ידי ניתוח מורפולוגי ב explants שנקטפו. כמו לימודים קלאסיים שליו-עוף3, האפיתל הרתי שליו היה התנחלו מאת hematopoietic ובתאים (HPCs) נגזר מן העובר עוף, אשר הוצגה מאוחר יותר כדי לתרום איברים פיתוח9,10 . HPCs היגרו העובר את בלוטת התימוס chimeric חוץ רחמי דרך מאוד vascularized מצלמת5,7,8. שליו אפיתל הרתי נגזר ניתן לזהות באמצעות אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים תלויי מין (קרי, QCPN - MAb שליו PeriNuclear), התגברות על הצורך של סמנים מולקולריים רקמות ספציפיות.
זו השיטה הניסיונית, כמו הגישה שני שלבים דיווחו הפרסום הקודם8, מאפשרת את האפנון של מסלולים האיתות על ידי הממשל הרגיל של סוכנים תרופתי במהלך במבחנה, בפיתוח ovo. כמו כן, ניתן לקצור explants בכל נקודת זמן הקורס של ניסוי8.
לבסוף, הבידוד פרוטוקול מפורט כאן מאפשר השימור של מאפיינים טבעיים 3D-ארכיטקטורה של רקמות עובריים, שימושי במיוחד עבור המפרט את דפוסי ביטוי גנים באתרו של השטחים עובריים אחרת נגיש על ידי שיטות קונבנציונליות. בנוסף, גישות ניתוח transcriptome, כולל ה-RNA-seq או מיקרו-מערכים, ניתן להחיל גם ברקמות מבודדת ללא צורך גנטיים תוך מתן ניתוח "טכנולוגיות" תפוקה גבוהה רקמות ספציפיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בצע טיפול בבעלי חיים והנחיות אתיות של דה Centro Académico דה רפואה Lisboa.
1. מופרית שליו ועוף דגירה
- המקום מופרית ביצים של שליו יפני (שליו שליו יפני) בחממה humidified 38 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים. דגירה הביצים (ביצה הקהה) פונה למעלה בחדר של אוויר.
הערה: הסביבה humidified מושגת על-ידי הצבת מכולה מים בתחתית של החממה. - דגירה הביצים של עוף (גאלוס גאלוס) 2.5 ימים בחממה humidified 38 ° C. דגירה הביצים במצב אופקי ולסמן בצד העליון באמצעות פיסת פחם לזהות את מיקומו של העובר.
הערה: להתחיל עם ביצי שליו 40 ו- 60 ביצי תרנגולת בעת יצירת ניסוי זה.
2. בידוד של שליו האנדודרם המכיל את תחום פוטנציאליים תחילתו הרתי
הערה: השתמש תא אופקי למינארי, בכלים סטיריליים וחומרים עבור הביצה מניפולציה שגרות בתנאים סטריליים.
- הסר את האזור עובריים המכיל השטח הרב, שעורר של rudiment הרתי, אזור קשת פרינגיאלית המכיל את 3rd ו- 4th קשתות (3/4PAR), כמו שמתואר7,8.
- ממלאים קערה גדולה זכוכית בורוסיליקט (100 מ"מ x 50 מ"מ; 100 ס מ3) 60 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה פוספט (PBS).
- בעזרת מספריים מעוגלים, הקש, לחתוך חור עגול במעטפת של שליו ביצה זה יש כבר מתפשט במשך 3 ימים. תרחיב את החור הנגדי של הביצה בוטה ולהעביר את החלמון (עם העובר) לקערה עם PBS קר.
- הסר את העובר החלמון על ידי חיתוך קרום vitelline חיצונית לכלי במיוחד עובריים באמצעות מספריים מעוגלים.
- בעזרת מלקחיים דק, העברה העובר אל קערה קטנה (60 מ"מ x 30 מ"מ; 15 ס מ3) מלא 10 מ"ל של PBS קר.
- עם עוף, להעביר את העובר 100 מ מ צלחת פטרי עם בסיס שחור (ראה טבלה של חומרים) המכיל 10 מ"ל של PBS קר ומניחים אותו תחת stereomicroscope.
- לנתח את 3/4PAR, כפי שתואר לעיל8.
- לשאוב 3/4PAR ואת העברת צלחת זכוכית שלושה רבעים מלא PBS קר באמצעות פיפטה פסטר סטרילי של 2 מ.
- לבודד את האנדודרם המכילה השטח הרב, שעורר של rudiment הרתי (האנדודרם 3/4PP) על-ידי עיכול אנזימטי עם pancreatin.
- בעזרת מלקחיים דק, מרית, העברת 3/4PAR צלחת זכוכית שלושה רבעים מלא pancreatin קר (8 מ"ג/מ"ל; 1:3 דילול של 25 מ"ג/מ"ל עם PBS קר).
- תקופת דגירה של h 1 על הקרח לעיכול אנזימטיות.
הערה: הזמן של עיכול אנזימטי תלוי של השלב של פיתוח (טבלה 1). - מקם את צלחת זכוכית תחת stereomicroscope (40 x-60 x הגדלה) כדי לבודד את האנדודרם מ 3/4PAR.
הערה: לשמור על כל המשטחים ופתרונות קר במהלך הליך זה. לשנות פתרון pancreatin קר חדש אם לוקח הרבה זמן לנתח את הרקמות (> 15 דקות). בתור מקור תאורה, להשתמש נוריות ה-LED שילב את stereomicroscope או את סיבים אופטיים, בהתחשב בעומס החום מוגבלת. - כדי לבודד את האנדודרם מן הרקמות הסובבות, להשתמש microscalpels פלדת אל-חלד שני מחזיקי ה-pin.
הערה: השתמש microscalpels בקוטר בין 0.1 מ מ ו- 0.2 מ מ ניקל pin מחזיקי בקוטר פתיחת הלסת של 0 מ"מ עד 1 מ מ.- תחילה להסיר את שפופרת פגמים בתעלה והמזודרם מחובר המשטח הגבי של האנדודרם לועי.
- עם הצד הגבי למעלה, בזהירות לנתק, להסיר את מזנכימה בין הקשתות לועי ולחשוף את שקיות הקאה. בצע הליך זה משני צידי 3/4PAR.
- הסר את הצינור הלב את מזנכימה סביב השיטה הקדמי.
- עם הצד הבטני למעלה, לחתוך את האאקטודרם של 2nd , קשתות לועי 3rd , הסר בזהירות את מזנכימה המצורפת השיטה. חזור על הליך זה בצד השני של 3/4PAR. בשלב זה תחילתו בלוטת התריס צריכים להיות גלויים.
- הסר את כל התאים mesenchymal שנותרו המצורפת את האנדודרם לועי עם microscalpels שני.
- עושים חתך חציה בין את 2nd 3rd עמודים, בריא את האנדודרם לועי המכיל את 3rd ו- 4 שקיותth מהחלק הקדמי של האנדודרם נתקל תחילתו בלוטת התריס ו 2nd שקית הקאה.
- בעזרת מלקחיים דק, מרית, העברת האנדודרם 3/4PP מבודדים צלחת זכוכית שלושה רבעים מלא 100% קר עוברית שור סרום (FBS).
- שמור את צלחת זכוכית עם הרקמות מבודד על קרח במהלך הכנת assay במבחנה. לחלופין, הרקמות מבודד יכול להישמר three-dimensionally, ניתח באתרו על ביטוי גנים.
3. בידוד של עוף somatopleura והמזודרם
הערה: בצע ביצה מניפולציה שגרות בתנאים סטריליים באמצעות תא אופקי למינארי, בכלים סטיריליים וחומרים.
- הסר את השטח עובריים המכיל את והמזודרם somatopleura ברמה של somites 19-24 (ss19-24).
- הסר את ביצת תרנגולת החממה לאחר 2.5 ימי דגירה.
- עם מספריים מעוגלים, לפתוח חור קטן במעטפת. הוספת מחט, תשאף 2 מ של אלבומין עם מזרק 10 מ"ל להוריד נפח אלבומין בתוך הביצה ולמנוע נזק של העובר (ממוקם מתחת האזור המסומן של המעטפת). למחוק את aspirated אלבומין.
- חתך מעגלי חור (עד שני-שלישים של פני השטח העליונים) באזור המסומן של המעטפת באמצעות מספריים מעוגלים.
- לחתוך את הקרום vitelline מבחוץ כלי extraembryonic תוך החזקת העובר עם מלקחיים דק.
- תחת stereomicroscope, מקום העובר ב- 100 מ מ צלחת פטרי עם בסיס שחור המכילה 10 מ"ל של PBS קר.
הערה: השתמש stereomicroscope מנקודה זו ואילך עבור הגדלה הדרגתית של כירורגיים. - השתמש ארבע סיכות חרק דק כדי להחזיק את העובר בתחתית הצלחת. מניחים את הסיכות על אזור extraembryonic ויוצרים צורת ריבוע.
- לבצע שני חתכים בין somites 19 ו 24 באופן רוחבי לציר העובר. חוצים כל הטריטוריה העובר, באמצעות מספריים העין wecker.
- שחרר, ss19-24, אזור העובר, על-ידי חיתוך קצוות עובריים שולית.
- לשאוב ss19-24 רקמות והעברתן ל צלחת זכוכית שלושה רבעים מלא PBS קר באמצעות פיפטה פסטר סטרילי של 2 מ.
- לבודד את והמזודרם הלטראלי מאזור somatopleura (ss19-24) על ידי עיכול אנזימטי עם pancreatin (8 מ"ג/מ"ל; 1:3 דילול של 25 מ"ג/מ"ל עם PBS קר).
- בעזרת מרית, מלקחיים דק, העברת רקמות ss19-24 לכוס מגישים שלושה רבעים מלא עם פתרון pancreatin קר.
- תקופת דגירה של 30 דקות על הקרח לעיכול אנזימטיות.
- תחת stereomicroscope, לבודד את והמזודרם מן הרקמות הסובבות באמצעות שתי microscalpels של בעל.
הערה: לשמור על כל המשטחים ופתרונות קר במהלך הליך זה. לשנות פתרון pancreatin קר חדש אם לוקח הרבה זמן לנתח את הרקמות (> 10 דקות.). בתור מקור תאורה, להשתמש נוריות ה-LED שילב את stereomicroscope או את סיבים אופטיים, בהתחשב בעומס החום מוגבלת. - במהלך והמזודרם בידוד, הסר תחילה את האאקטודרם על פני השטח ואחריו ניתוק זהיר של רקמות splancnopleura ממוקם ventrally.
- שחרר את והמזודרם הימנית של somatopleura על ידי חיתוך זה בתנועה מקבילה כדי הצינור העצבי.
- חזור על ההפרדה והמזודרם של הצד השמאלי של העובר.
הערה: ודא להאט תנועות microscalpel במהלך הליך זה. החלבונים מטריקס במיוחד הסלולר חשוף לדבוק רקמות, מכשירים למניעת תנועות זורמות. - בעזרת מלקחיים דק, מרית העברת והמזודרם מבודדים צלחת זכוכית שלושה רבעים מלא FBS קר.
- שמור את צלחת זכוכית עם הרקמות מבודד על קרח במהלך הכנת assay במבחנה.
4. במבחנה organotypic assay: אגודת heterospecific שליו האנדודרם 3/4PP, והמזודרם somatopleura עוף
- להכין את המדיום תרבות RPMI-1640 בינונית בתוספת 10% FBS ו 1%-עט/סטרפ-3,-5.
- מקום רשת מתכת 35 מ מ צלחת פטרי עם 5 מ של תרבות בינוני.
הערה: להסיר את עודף של נוזלים עד לרמת השטח בינוני עם החלק העליון של הרשת. - בעזרת מלקחיים דק, טבלו ממברנה מסנן המדיום תרבות ולאחר מכן מקם אותו בראש הרשת כדי לקבל משטח אחד במגע עם האוויר.
הערה: רבע האזור ממברנה (בקוטר 13 מ מ) מספיקה עבור שיוך רקמות. - תחת stereomicroscope, עמית הרקמות מבודד על המסנן ממברנה. קודם להעביר את האנדודרם 3/4PP (שלב 2) מתוך קערה זכוכית על-ידי הזזה עדין עם העזרה של השתלת כפית (או מרית) ורזה מלקחיים. חזור על הליך זה עבור והמזודרם מבודדים (שלב 3).
הערה: עם העזרה של microscalpel, מערבבים את רקמות כדי למקסם את השיוך שלו. - בזהירות מקום הרקמות המשויך חממה humidified ב 37 ° C עם 5% CO2 בשביל לרקמות בתרבית ה 48 יכול להיות הושתל על גבי קרום chorioallantoic (CAM).
הערה: איברים חוץ רחמי-צורה קאם היה בעבר מפורט8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול מפרט שיטה לבודד רקמות מתחלקים העופות כדי לשמש מספר גישות טכניות ביולוגיה תאית וההתפתחותי. שיטה זו הועסק בעבר ללמוד אינטראקציות אפיתל mesenchymal במהלך השלבים המוקדמים של היווצרות בלוטת התימוס5. במסמך זה, תוצאות חדשות מוצגות באיור 1 , איור 2, באמצעות גישות דומות.
איור 1 . נציג התוצאות של ביטוי גנים המחקר של three-dimensionally נשמר האנדודרם לועי המכיל את השטח הרב, שעורר של תחילתו התימוס. ייצוג סכמטי של המנגנון לועי, האנדודרם מבודד המכיל את 2PP, 3PP, 4PP (ב cE3.5 או qE3) (A). כולה-הר היברידיזציה עם BMP7 (B), סוניק הקיפוד (C) של האנדודרם מבודד-cE3.5. אותות חזקים הכלאה של BMP7, סוניק הקיפוד הצביע על-ידי ראשי חץ לבן בהאנדודרם 2PP, 3PP (B) מרכזי טיפונת (C), בהתאמה. A, קדמי; לסה נ, עוף יום עובריים; L, משמאל; P, אחורי; עמודים, שקית הקאה; qE, שליו יום עובריים; R, נכון. גודל ברים, 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 1 הוא שרטוט סכמטי של האנדודרם מבודד מן הלוע qE3 (, cE3.5) (איור 1 א') לבין ביטוי באתרו של שני גנים הקשורים האנדודרם, סוניק הקיפוד11,12 BMP713 בתוך הרקמה מבודד. ההליכים היברידיזציה כולה-הר בוצעו כפי שתואר לעיל5,7. הביטוי של BMP7 היה זוהה את האנדודרם 2PP ו 3PP ו נשלל מן הלוע המרכזית 4PP (בדיקה היה בחביבות המסופקים על ידי אליזבת לבעל) (איור 1B). לעומת זאת, סוניק הקיפוד היה זוהה את האנדודרם של הלוע המרכזי, נכללו את שקיות7 (איור 1 C).
איור 2 . התוצאות נציג של ex-vivo היווצרות האיברים chimeric. ייצוג סכמטי של הגישה ניסיוני המשמש לפתח שליו-עוף chimeric thymi (א). בקצרה, האנדודרם 3/4PP שליו מבודד (qE3) היה הקשורים במבחנה עם עוף somatopleura והמזודרם (cE2.5) במשך 48 שעות. לאחר מכן, הרקמות 48 שעות תרבותי היו הושתל על קאם (cE8), מותר לפתח ovo עוד עשרה ימים. קטעים טורי של קאם-derived explants (B-G) נותחו על ידי היסטולוגיה קונבנציונאלי (B ו- C) ו אימונוהיסטוכימיה (D G). ב B ו- C (גבוה יותר ההגדלה של B), השקופית הוכתם H & א ב- D ו- E (גבוה יותר הגדלה של D), השקופית immunodetected עם נוגדנים QCPN, counterstained עם hematoxylin של גיל. ב- F ו- G (גבוה יותר הגדלה של F), השקופית immunodetected עם נוגדן אנטי-פאן CK, counterstained עם hematoxylin של גיל. ראשי חץ שחור הצבע immunostaining חום חזק של QCPN (E), פאן CK (G). לפרטים רכישת תמונות, ראה טבלה של חומרים . Ca, הסחוס; Ep, אפיתל; עמודים, שקית הקאה; סום, שריר חלק. גודל ברים: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 מציג הנבחנים: השתמשו לפתח ex-vivo שליו-עוף chimeric איברים. האגודה heterospecific של רקמות גדלו במבחנה במשך 48 שעות ולאחריו בפיתוח ovo למשך 10 ימים (איור 2 א). Thymi שהוקמה ב explants קאם-derived זוהו על ידי היסטולוגיה קונבנציונלי. בלוטת התימוס הציג תכוניות מורפולוגיות נורמלי עם תאים לשד ואת קליפת המוח מפותח (איור 2B, ג). טורי חלקים explants טופלו נוסף עבור immunocytochemistry (איור דו-ממדי- G), כפי שמתואר5,7. MAb שליו QCPN - perinuclear (איור דו-ממדי, E) של פאן אנטי cytokeratin (CK) (איור 2F, G) נוגדנים שימשו סמני שלוים (תלויי מין) בתאי אפיתל, בהתאמה. בלוטת התימוס chimeric הראה QCPN+ לתאי האפיתל הרתי (איור דו-ממדי, E), אדריכלות רשתי (איור 2F, G) וכן קולוניזציה על-ידי תאי הלימפה (נולד ב- QCPN) ממוצא התורם (עוף).
| רקמה מבודדת | שלב פיתוח | ריכוז | טמפרטורה | תקופת דגירה |
| האנדודרם הלוע | q. E2 - E2.5 | 8 מ"ג/מ"ל | על הקרח | 45 – 60 דקות. |
| ג. E2.5 - E3 | ||||
| q E3 | 8 מ"ג/מ"ל | על הקרח | 60 - 90 דקות. | |
| c E3.5 | ||||
| q E4 | 8 מ"ג/מ"ל | על הקרח | 90 דקות. | |
| c E4.5 | ||||
| Somatopleura והמזודרם | q. E2 - E2.5 | 8 מ"ג/מ"ל | על הקרח | 30 – 50 דקות. |
| ג. E2.5 - E3 | ||||
| c, עוף; E, ביום עובריים; . קיו, שליו. | ||||
טבלה 1: תנאים של עיכול אנזימטי במהלך בידוד הרקמות עובריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך בידוד מתחלקים מפורט כאן היה חל שיפור טכניקות הקודם כדי לייצר עוברי תרנגולת-שליו chimeric הקשרים ביולוגיים שונים-3,-5,-6.
גישה זו מתאימה לבודד רקמות עובריים טהור ללא צורך מניפולציה גנטית או השימוש של רקמות ספציפיות סמנים, שלעיתים קרובות לא נקבע, להגביל את השימוש במודלים מהונדסים. זה יכול לשמש כדי ללמוד אינטראקציות אפיתל mesenchymal במהלך הפיתוח, עם היכולת לבודד את רקמות טהור להיות הגורם המגביל. למשל, התקדמות פיתוח, רקמות להיות עבה יותר, יותר קומפקטי וצרף רקמות שכנות אחרות כך הפירוד שלהם קשה יותר. הליך בידוד זה, לכן, מצוייה בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות, כלומר מאוחר organogenesis.
שיטה זו היא ייחודית ללמוד ביטוי גנים ברקמות עובריים נשמר ב- 3D. כדי להבטיח את התקינות-3D של רקמות מבודד, כלים, חומרים ופתרונות יש לשמור בטמפרטורות נמוכות לאורך כל התהליך.
רקמת microdissection ההליך הוא גם שלב קריטי המסתמך, לא רק על הקמת זהיר התנאים ניסיוני (כמו טמפרטורה משך עיכול אנזימטי, כמו למשל ב טבלה 1), אלא גם על הדרכה מעשית גוזלת זמן. הליך זה דורש אימון וסבלנות. אם המפעיל מאבד את ההפניות של אזור ניסויים, הפחתת ההגדלה סטריאוסקופ (20 x) יספק הבחנה הכוללת אשר יסייעו ההחלטה הצעד הבא.
ה 48 בשלב חוץ גופית הוקמה כדי לקדם באינטראקציה תאית בין רקמות עובריים שונים, תוך ovo בתוך הרקמה גדלה מצלמת תומך פיתוח ארוכת טווח, היווצרות האיברים chimeric של האגודה heterospecific של רקמות 5. השיוכים רקמות במבחנה עלול להתגבר על כמה מגבלות של מניפולציות ויוו. למשל, מנהל מקומי של תרופות או גורמי גדילה (באמצעות חרוזים) באזורים של העובר אינה נגישה אחרת ויוו, ניתן בקלות לבצע שימוש בגישה זו במבחנה. זה הוכיח בעבר לחקות אינטראקציות רקמות מקומיות במהלך איברים-צורה אזור לועי5.
קציר explants גדל ב- CAM-5,-7,-8 הוא פחות זמן רב והוא שיטה פשוטה כדי לעקוב אחר explants לעומת שיטות איסוף רקמות הושתל על גבי הקיר הגוף של עוברי chimeric3. בנוסף, מצלמת יכול להיות מושתלים עם תאים ורקמות ממינים אחרים שאינם העופות, זה שימש בהצלחה בהקשרים ניסיוני במספר, של התפתחות סרטן14,15. לדוגמה, וזמינותו מצלמת הוחל בעבר מחקרים עכברים-לתוך-עוף xenografts16 , משמש לעתים קרובות כדי לבדוק את קיבולת פולשנית של תאים אנושיים גידולים15.
לאחרונה, המחקר אלגנטי עם האדם-לתוך-עוף xenograft אומתה העובר עוף כמודל לבדוק ולחקור את ההתפתחות האנושית המוקדמת17. בעתיד, זה יהיה מעניין לחקור את המתודולוגיה והאירועים המתוארים באמצעות שיוך בין זנים של רקמות, אשר עשויים לספק גישות נוספות העכבר על מחקרים התפתחותיים בבני אדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים על איזבל Alcobia על קריאה ביקורתית של כתב היד, מריו אפונשו הקריינות וידאו וכדי Vitor Proa מן השירות היסטולוגיה של ה-e Histologia דה אינסטיטוטו Biologia לעשות Desenvolvimento, Faculdade דה רפואה de Lisboa. Universidade de Lisboa, לקבלת תמיכה טכנית. אנחנו חבים במיוחד פאולו Caeiro, הוגו סילבה מ Unidade דה audiovisuais (יחידת אורקולי), Faculdade דה רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa על מחויבותם מצטיינים לייצור של וידאו זה. אנו להכיר לייקה מיקרוסיסטמס בחביבות לספק סטריאוסקופ מצויד עם מערכת וידאו, כדי Interaves - שימור אורח אגרו-Pecuária, s. A משתמשינו שליו מופרית ביצים. עבודה זו נתמכה על ידי דה Faculdade רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
