Method Article

萌芽期ティッシュと胸腺の例を使用してウズラ鶏キメラ器官の形成の分離

DOI:

10.3791/58965

⸱

February 16th, 2019

 , 
1Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa

In This Article

Summary

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この記事は、ex vivo キメラ器官を形成して結合することができますウズラと鶏の胚から純粋な萌芽期ティッシュを分離する方法を提供します。

Abstract

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萌芽期ティッシュを分離する能力は、順番発表発生生物学における主要なプロセスへの明白な貢献を提供しているうずら鶏キメラ システムを確立するための重要なステップだった。

ここにはうずらとマイクロサージェリーとその生物学的特性を維持しながら酵素消化による鶏胚組織を分離するための最適化手法を説明しました。分離後、両種から組織は 48 h. ウズラの in vitro における切片アッセイ、関連付けられて、ニワトリ組織は明瞭な核機能と細胞間クロストークの検討できるように分子マーカーによって差別することができます。異種組織の協会。このアプローチは、したがって、前腸の形成と咽頭の形態形成時に発生するものなど、非常にダイナミックな空間変更と発達過程の複雑な組織の相互作用を研究するための便利なツール内胚葉由来の器官。この実験的アプローチは、胸腺形成の初期段階における上皮・間葉相互作用を最初に開発されました。これは、内胚葉由来の将来胸腺原基と中胚葉由来の間充織であったウズラと鶏の胚から分離。

鶏胚漿尿膜 (CAM) にそれらを移植で臓器を生成する関連組織の容量をさらにテストできます。カムは栄養素を提供し、explanted ティッシュにガス交換をできます。Ovo 開発の 10 日後は、キメラの臓器収穫植で従来の形態学的方法で分析できます。この手順も可能、初期開発 (体外) からの器官形成中に組織固有の貢献を勉強 (ovo 開発) における器官形成の最終段階です。

最後に、改善された分離メソッドも提供します立体的 (3 D) 保持萌芽期ティッシュのティッシュ特定の遺伝子発現パターンの高解像度地形解析も使用できます。

Introduction

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1970 年代初頭のエレガントなウズラ鶏キメラ システムは開発1,2の間に細胞の遊走や細胞間相互作用の役割を理解する新たな道を開くル Douarin によって開発されました。2 種間のセル交換が大幅胚形成、神経系の形成、造血など数多くの発達過程を研究するために使用するとき後で確認を妨げないことを前提に考案されたモデルシステム1。後者の例として取って、造血前駆細胞胸腺上皮原基を植民地化の周期波最初うずら鶏キメラ システム3を使用してを観察されました。そのため胸腺、第三および第四咽頭ポーチ (3/4 pp) の内胚葉の未探査地域機械的および酵素によってから分離されたウズラ (q) 胚体節段階 15-30 [日 (E) 1.5-E2.5].これらの段階は、チキン ハンバーグとハミルトン4 (HH) - 12-17 の段階に対応します。分離のプロシージャは、トリプシン酵素によって添付充から内胚葉を分離するに使用を開始しました。孤立した内胚葉は、E3 E3.5 (HH-ステージ 20 21) でホスト鶏 (c) 胚の somatopleura 領域に移植されました。この異種間充織は器官形成3にも貢献して胸腺上皮の開発に「寛容な」と考えら....

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Protocol

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これらすべての実験動物の世話やセントロ Académico ・ デ ・ メディチーナ ・ デ ・倫理的なガイドラインに従うリスボア。

1. 受精ウズラと鶏の卵孵化

  1. 場所は、3 日間 38 ° C の加湿インキュベーターでウズラ (について) の卵を受精しました。空気室の上向き卵 (卵の鈍い端) を孵化させなさい。
    注: 加湿環境インキュベーターの下に水のコンテナーを配置することによって実現されます。
  2. 38 ° C の加湿インキュベーターで 2.5 日間鶏 (ギャラス) の受精卵を孵化させなさい。水平位置で卵を孵化し、胚の場所を識別するために木炭の部分を使用して上側をマークします。
    注: は、この実験を確立するとき、40 のウズラの卵と鶏の卵を 60 開始します。

2 胚葉胸腺原基の将来のドメインの分離

注: は、無菌状態で水平層流フードと滅菌器具と卵操作手順のための材料を使用します。

  1. 3rdと 4thを含む咽頭アーチ領域として記述されている7,8(3/4PAR) のアーチ、胸腺原基の推定領....

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Results

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プロトコルは、いくつかの細胞および進化の生物学の技術的なアプローチで使用される鳥の萌芽期ティッシュを分離する方法を詳しく説明します。このメソッドは、胸腺形成5の初期段階の間に上皮間葉相互作用を研究する以前採用されました。ここで、図 1と図 2、同様のアプローチを使用して新しい結果が表示されます。

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図 1.遺伝子発現の代表の結果の研究三次元保存を示す推定領域を含む咽頭内胚葉の胸腺原基.......

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Discussion

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以下萌芽期ティッシュの隔離プロシージャは、異なる生物学的文脈3,5,6うずら鶏キメラ胚を作り出すための前の技術から改善されました。

この方法は、遺伝子操作や決定、遺伝子組み換え動物モデルの使用を制限することが多い、組織特異マーカーの使用を必要とせず純粋な萌芽期ティッシュの分離に適しています。それは、制限要因である純粋な組織を分離する能力を持つ、開発時に上皮間葉相互作用を研究する使用ことができます。例えば、開発が進むにつれて、組織はより厚くよりコンパクトになるし、彼らの分離が難しくなるように他の隣接組織に添付します。この分離手順適していません、したがって、すなわち後半器官の開発の後の段階です。

このメソッドは、3 D 保存萌芽期ティッシュの遺伝子発現を研究に固有です。隔離されたティッシュの 3 D 整合性を確保するには、機器、材料・ ソリューシ.......

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Disclosures

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著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

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著者は原稿の批判的読解のイザベル Alcobia に感謝していますビデオ ナレーションの Mário エンリケスとセルバンテス ・ デ ・ Histologia e Biologia の組織サービスからビトー プロアは Desenvolvimento、Faculdade ・ デ ・ メディチーナ ・ デ ・ リスボアテクニカル サポートのためのパラナ ・ デ ・ リスボア。Faculdade ・ デ ・ Unidade ・ デ ・ audiovisuais (視聴覚ユニット) からサンパウロ Caeiro とヒューゴ ・ シルバに特にお世話になっておりますメディチーナ ・ デ ・ リスボア、このビデオの生産への顕著なコミットメントのパラナ ・ デ ・ リスボア。我々 は親切提供するビデオ システムと Interaves を装備した堅実ライカマイクロシス テムズ株式会社を認める - Sociedade 農業 Pecuária、ウズラに貢献してくれて S.A 受精卵。この作品は、Faculdade ・ デ ・によって支えられたメディチーナ ・ デ ・ リスボア、パラナ de Lisboa (FMUL)。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
鶏の受精卵(Gallus gallus)ポルトガル、鶏場 
ウズラの受精卵 (Coturnix coturnix)、インタラーブスバードファーム 
15 mL PP遠心分離管コーニング430052
50 mL PP遠心分離管コーニング430290
60 x 20 mm パイレックス皿デュラングループ21 755 41
100 x 20 mm パイレックス皿デュラングループ21 755 48
金属グリッドグッドフェローズ細かいメッシュ  ステンレス鋼グリッド
メンブレンフィルターミリポアDTTP013000.6 mm イソポア メンブレン フィルター
シャーレ 35 x 10 mmSigma-AldrichP5112 
スーパーマーケットの60 x 30 mmパイレックスボウル(小型) 
100 x 50 mmパイレックスボウル(大サイズ) 
トランスファーピペットSamco Scientific, Thermo Fisher Scientific2041S2 mL プラスチックピペット
ガラスパスツールピペットNormax5426015
透明プラスチックテープ 
サイトケラチン(パン、酸性および塩基性、I型およびII型サイトケラチン)、クローンLu-5BMA BiomedicalsT-1302
Fetal Bovine SerumInvitrogen、Thermo Fisher ScientificStandart FBS
PancreatinSigma-AldrichP-3292メーカーの指示に従って25 mg / mL溶液を調製します。分注前に遠心分離機とろ過を行い、-20°Cで保存します。数年。
パラホルムアルデヒドSigma-AldrichP6148
ペニシリン-ストレプトマイシンInvitrogen, Thermo Fisher Scientific15140-122
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)GIBCO, Thermo Fisher Scientific10010023
QCPN antibodyDevelopmental Studies Hybridoma BankQCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement GIBCO、サーモフィッシャーサイエンティフィック61870010
Bluesil RTV141A/B シリコーンエラストマー 1.1Kg キットELKEM/シルミドRH141001KGペトリ皿のバックベースを準備するには
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-30 細い鉗子
極細ボンハサミ、湾曲ファインサイエンスツール14085-08湾曲ハサミ
昆虫ピン ファインサイエンスツール26001-300.3 mm ステンレス製ピン
マイクロスパチュラ ファインサイエンスツール10087-12移植スプーン
ミヌーティアンピンファインサイエンスツール26002-200.2 mm ステンレス製マイクロメス
ミヌーティアンピンファインサイエンスツール26002-100.1 mm ステンレス製マイクロメス
モリア ニッケルメッキピンホルダーファインサイエンスツール26016-12ニッケルメッキピンホルダー
モリア穴あきスプーンファインサイエンスツール10370-17スキマー
ウェッカー アイ シザーファイン サイエンス ツール15010-11
カメラライカ マイクロシステムズ MC170 HD
顕微鏡ライカマイクロシステムズ DM2500
ナノズーマー S360デジタル スライドスキャナー 浜松ホトニクスC13220-01
ステレオスコープライカマイクロシステムズ ライカM80
ピントバール養ポルトガルスーパーマーケットのスーパーマーケットの

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
  2. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to t....

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