Assay ATP-מדידה פשוטה של חיים/מתים מכתים שיטת שימשו כדי לכמת והמחש Neisseria gonorrhoeae הישרדות לאחר הטיפול עם צפטריאקסון. פרוטוקול זה ניתן להרחיב לבחון את ההשפעות מיקרוביאלית של כל אנטיביוטיקה, ניתן להשתמש כדי להגדיר את הריכוז המעכב מינימלי של אנטיביוטיקה biofilms חיידקי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בחינה כמותית של רגישות לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae ATP-ניצול אגרגטים באמצעות מבחני מסחרי, חי/מת מכתים
במאמר זה
סיכום
תקציר
הופעתה של עמידים לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae (GC) איום בריאותי ברחבי העולם, מדגיש את הצורך לזהות אנשים נכשלים טיפול. חיידק גראם שליליים זה גורם זיבה באופן בלעדי אצל בני אדם. במהלך זיהום, הוא מסוגל טופס אגרגטים ו/או biofilms. הבדיקה הריכוז המעכב המינימלי (MIC) משמש כדי לקבוע את הרגישות לאנטיביוטיקה וכדי להגדיר את הטיפול המתאים. עם זאת, המנגנון של בהשמדה ויוו ויחסה תוצאות מעבדה לא ידועים. פותחה שיטה זה בוחן כיצד GC צבירת משפיע על רגישות לאנטיביוטיקה ואת מציגה את הקשר בין גודל צבירה של רגישות לאנטיביוטיקה. כאשר הצבירה GC, הם עמידים יותר בפני אנטיביוטיקה להרוג, עם חיידקים במרכז ששרדו צפטריאקסון טיפול טובים יותר מאלו בפריפריה. הנתונים מצביעים כי צבירת gonorrhoeae ש יכול להפחית את הרגישות צפטריאקסון, אשר אינה משתקפת באמצעות השיטות מיקרופון המבוסס על צלחת אגר רגיל. השיטה שבה נעשה שימוש במחקר זה יאפשר לחוקרים לבדוק את הרגישות בקטריאלי בתנאים הרלוונטית קלינית.
מבוא
זיבה היא שנפוצה במגע מיני זיהום (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), diplococcal חיידק גראם שליליים, הוא סוכן סיבתי של המחלה. סימפטומים של זיהום הגניטלי עלולה לגרום לכאב במהלך מתן שתן מוכללת מכאבים באברי המין, הפרשות השופכה. זיהום לעיתים קרובות ללא תסמינים2,3,4,5, זה מאפשר קולוניזציה המורחבת. זיהומים אלה ללא טיפול הם דאגה בריאות קשות, הן בעלות פוטנציאל כדי להקל על שידור של האורגניזם, זה יכול לגרום לסיבוכים כגון מחלה דלקתית של האגן (PID), והופץ על ידי זיבה הזיהום (DGI)6. זיבה עמידים לאנט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
תחזוקה כללית של זנים GC
- פסים gonorrhoeae ש זנים על אגר חוזרת עם 1% קלוג תוספי תזונה18 (טבלה 1, בטבלה 2) ממניות מקפיא, דגירה 37 ° C עם 5% CO2 במשך 16-18 ח' שימוש MS11 לבטא משתנה-שלב Opa (MS11Opa +), לא אופה (MS11ΔOpa), או לוס קטום (MS11ΔLgtE).
- בזהירות לבחור pili שלילי (המושבה ללא קצה כהה) או חיובית (המושבה עם קצה כהה) מושבות מהמאמץ כל מבוסס על המושבה מורפולוגיה19 באמצעות מיקרוסקופ אור ויבתר פס על גבי צלחת חוזרת חדשה.
- דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 16-18 שעות לפני השימוש.
2. הכדאיות כימות של הצטברויות של GC
- ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שתי שיטות הועסקו: assay ניצול של ATP ואת וזמינותו מוכתמים חי/מת. התוצאות ניתן להיות משולב או בנפרד המשמש לבחינת הישרדות חיידקי בתוך אגרגטים לאחר טיפול אנטיביוטי. ATP הניצול וזמינותו הוכח כדי למדוד במדויק קיימא חיידקים S. aureus biofilms20,21. כאן, פיל + MS11Opa + זן שימש לבחון את התפקיד של צבירת GC רגישות לאנטיביוטיקה. Non-המצטברים MS11Opa + פיל +, MS11Opa צבור + פיל +, או המצטברים, ואז ע י sonication MS11Opa + לפיל + שטו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
חיידקים יכולים ליצור biofilms במהלך זיהום של הגוף האנושי. בדיקת מיקרופון מסורתיות אינן משקפות בהכרח את הריכוז הדרוש כדי למגר חיידקים ממבנה biofilm. כדי לבדוק את ההשפעות antimicrobials על ממבנה biofilm, שיטות בהתבסס על biofilm ביומסה, כמו גם plating CFUs יכול להיות מוטעים עקב ההשפעה של מבנה biofilm. לדוגמה, שיטת ציפוי פועלת רק אם biofilm עלולות להפגע. לפיכך, CFU שהושג עשוי להיות נמוך יותר מאשר מספר חיידקים מעשית בפועל. להמחיש חיידקים מתים וחיים בתוך biofilm הוקמו למדידת ההישרדות של החיידקים בתוך biofilm, עם זאת, בהתאם מבנ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של המכון הלאומי לבריאות D.C.S., W.S. AI123340. ל', סי-וו. וו, איי. סי., והסתייעות E.N. ב חלק/להשתתף בתוכנית "בשנה הראשונה חדשנות & מחקר ניסיון" ממומן על ידי אוניברסיטת מרילנד. התורמים שחיים היה אין תפקיד לימוד עיצוב, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם, או אופן ההכנה של כתב היד. אנו להכיר UMD CBMG הדמיה הליבה עבור כל הניסויים מיקרוסקופ.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 100x קלוגס | |||
| אגר | ארצות הברית ביולוגי | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC בסיס בינוני | BD | 228950 | |
| ברזל חנקתי, נולאהידרט | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| גלוקוז | תרמו פישר מדעי | BP350-1 | |
| L-גלוטמין אבקה גבישית | פישר סיינטיפיק | BP379-100 | |
| BacLight צביעה חיה/מתה | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae זן | מסופק באדיבות על ידי ד"ר הרמן שניידר, המכון הצבאי וולטר ריד עבור מחקר | ||
| אשלגן פוספט דו-בסיסי (K2HPO4)Fisher | Scientific | P290-500 | |
| אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| פרוטאוז פפטון | BD Biosciences | 211693 | |
| נתרן כלורי (NaCl) | פישר סיינטיפיק | S671-10 | |
| עמילן מסיס | סיגמא-אולדריץ' | S9765 | |
| תיאמין פירופוספט | סיגמא-אולדריץ' | C8754-5G | |
| ציוד | |||
| צלחות פטרי | VWR | 25384-302 | |
| 8 בארות כיסויתא תחתון | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| צלחות תרבית רקמה 96 בארות | קורנינג, ארון | 3370 | |
| (NU-425-600 Class II, קולט אדים למינארי זרימה ביולוגית) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 חממת | פישר סיינטיפיק | דגם 3530 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד בתא הדמיה חי | Leica | SP5X | |
| Corning 96 באר מיקרופלטת פוליסטירן שחורה | תאורת קורנינג | 3904 | |
| גלומקס | קצות פיפטה Promega | E6521 | |
| (0.1-10 ומיקרו; L) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| קצות פיפטה (1000 ומיקרו; L) | VWR | 83007-382 | |
| קצות פיפטה (200 ומיקרו; L) | VWR | 53509-007 | |
| ספקטרופוטומטר Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| צינורות חרוטיים סטריליים 15 מ"ל | VWR | 21008-216 | |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים (1.7 מ"ל) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| אפליקטורים סטריליים עם קצה פוליאסטר | פישר סיינטיפיק | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | שווה ערך ל-9110001 |
מקורות
- CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorr....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
