Summary
간단한 ATP 측정 분석 결과 및 라이브/죽은 방법 얼룩 계량 ceftriaxone 치료 후 Neisseria gonorrhoeae 생존을 시각화 하 사용 되었다. 이 프로토콜 검사 어떤 항생제의 항균 효과를 확장할 수 있습니다 고 박테리아 biofilms에서 항생제의 최소 억제 농도 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Abstract
항생제 내성 Neisseria gonorrhoeae (GC)의 출현은 세계적인 건강 위협이 고 치료 하지 못하는 개인을 식별 하는 필요를 강조. 이 그램 음성 박테리아는 인간에서 독점적으로 임 질을 발생합니다. 감염, 동안 양식 집계 biofilms 하 수 있다. 최소 억제 농도 (MIC) 테스트 항생제 자화 율을 결정 하 고 적절 한 치료를 정의 하기 위해 사용 됩니다. 그러나, vivo에서 박멸 및 실험실 결과 관계의 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. GC 집계 항생제 자화 율에 영향을 미치는 방법과 집계 크기와 항생제 자화 율 사이의 관계를 표시를 검사 하는 방법 개발 되었다. 때 GC 집계, 그들은 더 죽이 항생제에 저항력이, 센터에서 박테리아와 함께 주변에 그 보다 더 나은 ceftriaxone 치료를 생존. 데이터 표시 N. gonorrhoeae 집계 표준 한 천 격판덮개 기반 마이크 메서드를 사용 하 여 반영 되지 않습니다 ceftriaxone의 민감성을 줄일 수 있습니다. 이 연구에 사용 되는 방법은 연구자 임상 관련 조건 하에서 세균 자화 율 테스트를 수 있습니다.
Introduction
임 질은 일반적인 성병 감염 (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), 그람 음성 diplococcal 박테리아는이 질병의 원인이 되는 대리인. 생식 기 감염의 증상 통증 배 뇨, 일반화 된 생식 기 통증, 그리고 요도 방전 하는 동안 발생할 수 있습니다. 감염이 종종 무 증상2,3,,45, 이며 이로써 확장된 식민. 그들은 유기 체의 전송을 촉진 가능성이 있고이 골반 염증 성 질환 (PID) 등의 합병증으로 이어질 수 있습니다 gonococcal 감염 (DGI)6전파 이러한 치료 감염 주요 건강 관심사는. 항생제 내성 임 질은 중요 한 공중 위생 위기와 증가 사회경제적 부담7. Cephalosporins 감소 민감성 ceftriaxone8azithromycin 또는 doxycycline 결합 듀얼 치료에서 단일 항생제 치료 처방 변경 결과입니다. Ceftriaxone 및 azithromycin9,10, 함께 무 증상 감염의 증가 실패 임 질 치료 실패를 이해 하기 위한 필요를 강조 한다.
한 천 희석 및 디스크 확산 테스트를 포함 하 여 최소 억제 농도 (MIC) 테스트는 항생제에 저항을 식별에 대 한 표준 의학 시험으로 사용 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 마이크 테스트 세균성 항 생 저항 vivo에서 반영 하는 경우에 명확 하지 않습니다. 항생제의 살 균 농도의 박테리아의 생존에 기여 하는 박테리아 biofilms의 형성: 마이크 테스트 하는 것은이 효과11을 감지할 수. GC는12점 막 표면 biofilms을 형성할 수 있다, 때문에 우리가 가설 그 항생제 자화 율 집계 내 개별 GC에서 본 다른 것. 또한, 연구 3 상 가변 표면 분자, Pili, 불투명도 관련 단백질 (Opa), 및 lipooligosaccharides (로스), 규제 간 박테리아 상호 작용, 다른 크기의 집계13, 으로 이어질 14 , 15. 항생제 저항에 이러한 구성의 기여 적절 한 방법의 부족으로 검사 하지.
현재, biofilm 박멸을 측정 하기 위해 여러 가지 방법이 있다. 가장 널리 사용 되는 양적 방법 크리스탈 바이올렛16얼룩을 사용 하 여 바이오 매스의 변화를 측정 하는 것입니다. 그러나, 방법 중요 한 실험적인 조작 실험 반복17에서 잠재적으로 오류를 생성할 수 있는 필요 합니다. 여기에 사용 되는 라이브/죽은 착 방법 라이브 하 고 죽은 박테리아와 그들의 분포는 biofilm 내의 시각화 수 있습니다. 그러나, biofilm 구조의 염료 침투를 감소 시키는 물리적 장벽으로 발생할 수 있습니다. 따라서, 그룹 내에서 라이브/죽은 박테리아를 계량 하는 얼룩 작은 biofilms 또는 그것의 선구자-microcolonies 또는 집계로 제한 됩니다. 다른 방법을, 한 천 희석 및 디스크 확산 테스트를 포함 하 여 집단의 효과 측정할 수 없습니다. 것 필요 모두를 측정할 수 있는 정량적 분석 결과 박테리아 생활과 그들의 분포를 시각화 항생제 노출, 이상적인 방법 집계에서 GC 민감성을 검사 합니다.
여기에 설명 된 절차는 ATP 사용률 측정 결합 및 라이브/죽은 얼룩을 양적 분석 결과 항생제의 집계에서 GC 민감성을 시각적으로 검사.
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Protocol
1. 일반적인 유지 보수의 GC 변종
- N. gonorrhoeae 긴장 행진 1% GCK agar에 켈로그18 (표 1, 표 2) 냉장고 주식에서 보충 하 고 5% CO2 16-18 헤 사용 MS11 단계 변수 Opa (MS11Opa +), 아니 Opa (MS11ΔOpa), 표현에 대 한 37 ° C를 품 어 또는 잘린된 로스 (MS11ΔLgtE)입니다.
- 신중 하 게 부정적인 pili (어두운 가장자리 없이 식민지) 또는 양성 (어두운 가장자리 식민지) 식민지 식민지 형태학19 해 가벼운 현미경 및 새로운 GCK 플레이트에 연속 사용에 따라 각 스트레인에서 선택 합니다.
- 사용 하기 전에 16-18 h 5% CO2 와 37 ° C에서 품 어.
2. 생존 GC 집계의 정량화
- 메 마른 주걱을 사용 하 여 GC를 수집 합니다. 면봉 접시에서 GC와 미리 데워 국물 (GCP, 표 3)에 다시 중단 GC 1%와 4.2% NaHCO3 켈로그 솔루션18보충. 분 광 광도 법을 사용 하 여 650의 파장에서 nm (1의 OD650 ~ 109 CFU/mL x 1 =) 중단된 박테리아의 농도 결정 하.
- ~ 1 × 10로 GC의 농도 조정8 CFU/mL.
- 96 잘 접시의 우물으로 조정 GC 중지 99 µ L를 추가 합니다.
- 박테리아 수 있도록 5% CO2 와 37 ℃에서 6 h에 대 한 접시를 품 어 집계에.
- 추가 1 µ L의 직렬 희석된 ceftriaxone (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2 µ g/mL) 각 우물에. 치료 컨트롤 역할을 일부 우물을 남겨 주세요.
- 5% CO2와 37 ℃에서 24 h에 대 한 접시를 품 어.
- 3 번에 5 144 W에서 s 및 20 kHz에 대 한 각 잘 정지 sonicate
- 각 잘으로 100 µ L 상용 ATP 이용 발광 시 약의 추가, 최대 플라스틱-그리고 3 번, 아래로 5% CO2와 37 ° C에서 15 분 동안 품 어.
- 신중 하 게 96-잘 검은 microplate에 새로운 우물에 각 우물에서 혼합물의 150 µ L를 전송 하 고 거품을 도입 방지.
- 각 560에서의 흡 광도 측정 nm 플레이트 리더를 사용 하 여.
- 직렬 ceftriaxone 치료 후 치료 우물에서 독서를 얻은 독서의 비율에 의해 생존 율을 계산 합니다.
3. 라이브/죽은 GC의의 형광 현미경 분석
- 메 마른 주걱을 사용 하 여 GC를 수집 합니다. 접시에서 면봉 GC와 미리 따뜻하게 GCP 미디어 플러스 1%에서 GC 다시 중단 켈로그 보충.
- 650의 파장에서 분 광 광도 법으로 박테리아의 수를 결정 nm ~ 1 x 10 GC의 농도 조정 하 고7 CFU/mL.
- 8 잘 coverslip 아래쪽 챔버에 198 µ L로 GC 중지를 추가 합니다.
- 집계 형성 수 있도록 5% CO2 와 37 ℃에서 6 h는 챔버를 품 어.
- 각 잘 각 집계 조건 내에 ceftriaxone (100 µ g/mL 또는 다양 한 희석)의 2 µ L를 추가 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 원하는 시간에 품 어.
- 각 우물에 라이브/죽은 얼룩 솔루션 혼합물의 0.6 µ L을 추가 하 고 5% CO2와 37 ° C에서 20 분 동안 품 어.
- Confocal 현미경 (동등한 현미경은 사용할 수 있습니다)를 사용 하 여 Z-시리즈 이미지를 취득 합니다.
- ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 GC 집계와 라이브-에-죽은 각 집계에 얼룩의 형광 강도 비율 (FIR)의 크기의 측정에 대 한 이미지를 분석 합니다.
4. 이미지 분석
- 세균의 크기 추정
- ImageJ 열고 ImageJ 메뉴 모음에는 raw 이미지 파일을 드래그 하 여 이미지를 엽니다.
- ImageJ 메뉴 막대에서 프리 핸드 라인 을 클릭 하 고 이미지에서 각 집단의 영역 원형.
- 클릭 분석 | 측정 ImageJ 메뉴 표시줄에서.
- 지역 열 아래에서 새 창에 번호를 가져올.
- 집계의 라이브-에-죽은 비율의 정량화
- ImageJ 열고 ImageJ 메뉴 모음에는 raw 이미지 파일을 드래그 하 여 이미지를 엽니다.
- 클릭 분석 | 설정 측정 ImageJ 메뉴 표시줄에서.
- 팝업 창에서 통합된 밀도 확인 하 고 확인을 클릭 합니다.
- 이미지 클릭 | 컬러 | 도구 채널 메뉴 막대에 있는 선택 색상.
- 채널 1 라이브 박테리아 얼룩에 대 한 형광으로 확인 합니다.
- ImageJ 메뉴 막대에서 프리 핸드 라인 을 클릭 하 고 각 집단의 영역 원형.
- 클릭 분석 | 측정 ImageJ 메뉴 표시줄에서.
- IntDen 열 수를 가져옵니다.
- 죽은 세균성 얼룩에 대 한 형광으로 채널 2 를 확인 합니다. 4.2.6-4.2.8 단계를 반복 합니다.
- 숫자 단계의 4.2.8 단계의 4.2.9 숫자로 나누어 살고 죽은 비율을 얻을.
- 통계 분석
- GraphPad Prism 열고 원하는 열에 ImageJ에서 얻은 번호를 입력 합니다.
- 분석 을 클릭 하 고 열 분석에서 t 테스트 를 선택 합니다.
- 비교에 대 한 원하는 열을 확인 하 고 확인을 클릭 합니다.
- 분석 창에서 P-값을 구할.
- 단계 4.3.3에서에서 XY 분석 에서 선형 회귀 를 선택합니다
- R-광장 및 분석 창에서 P-값 을 가져옵니다.
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Representative Results
두 가지 방법을 사용 했다: ATP 사용률 분석 결과 및 라이브/죽은 얼룩 분석 결과. 결과 결합 하거나 개별적으로 항생제 치료 후 집계 내 세균 생존을 검토를 위해 사용 될 수 있습니다 합니다. ATP 사용률 분석 결과 미 균 biofilms20,21에서 정확 하 게 실행 가능한 박테리아를 측정 하기 위해 표시 되었습니다. 여기, MS11Opa + 필 + 스트레인 항생제 자화 율에서 GC 집계의 역할 검사 사용 되었다. 비 집계 MS11Opa + 필 +, 집계 MS11Opa + 필 +, 또는 집계 및 다음 쥡니다 MS11Opa + 필에 의해 중단 + 직렬 희석 ceftriaxone 및 ATP 수준 측정 (그림 1A)로 치료 했다. 비교 백분율 생존와 항생제 치료를 하지 않고, 미리 집계 GC 했다 동등한 ceftriaxone (한 천 희석 테스트 ( 에서에서 마이크의 0.015 µ g/mL 이상으로 비 집계 또는 집계 중단 GC 보다 상당히 높은 생존 표 4)). MS11Opa + 필-, MS11ΔOpa 또는 MS11ΔLgtE 같은 한 천 희석 마이크 (표 4), 양식 작은 집계 하지만, 했다 검사 고 MS11Opa + 필 + (그림 1B)에 비해. MS11Opa + 필 +, 형성 하는 큰 집계, 돌연변이 체 긴장 보다 ceftriaxone 치료와 함께 더 높은 ATP 수준을 했다.
라이브/죽은 얼룩은 여러 biofilm/집계 관련 연구22,23에 사용 되었습니다. 집계의 효과 결정, 사전 집계 MS11Opa + 필 + 또는 ceftriaxone 없이 치료 되었고 몇 군데를. 그러면 시각화 (이 정해질 수 있습니다)와 항생제 치료 (그림 2A-2 패널 왼쪽) 후 라이브 및 죽은 GC의 분포. 반면 라이브 GC (녹색) 주로 ceftriaxone 치료의 핵심에 위치 하 고 있었다 죽은 박테리아 (레드) 크게 외부 층에 위치 했다. 이 절차는 MS11Opa + 필으로 수행 되었다-, MS11ΔOpa 또는 MS11ΔLgtE, 조사 집계 크기와 생존 율 (그림 2A). MS11Opa + 필 + 가장 큰 형태와 MS11Opa + 필 표시 했다-작은 집계 (그림 2A, B). MS11Opa + 필 + 집계 코어 계층에 아직도 살아 있었다 반면 MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + 필의 작은 느슨한 집계에서 GC-, MS11ΔLgtEPil + 죽 었 고 (그림 2A, C). 크기와 생존을 바탕으로, 상관 관계 그래프 집계 크기와 항생제 생존 (그림 2D)의 관계를 검사를 그릴 수 있습니다.
표 1: GCK 천 배지 1 L에 대 한 제조 법.
표 2: 100 x 켈로그의 보충의 1 L에 대 한 제조 법.
표 3: GCP 세균성 성장 매체의 1 L에 대 한 제조 법.
표 4: 최소 억제 농도의 GC 변종 ceftriaxone 치료. MS11Opa + 필 +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE, 및 MS11Opa + 필-성장 하 고 GCP에 중단 했다. 한 천 희석 시험 직렬 농도로 ceftriaxone 0.0016-에서 수행한 다음 0.25 µ g/mL.
그림 1 : Ceftriaxone 치료 ATP 사용률 분석 결과에서 집계 된 GC의 생존 율의 대표적인 데이터. (A) 생존 사전 집계, 사전 6 h에 대 한 집계 또는 MS11Opa + 필 집계 6 h 6 헤 (B) 생존 율 비교에 대 한 사전 집계 후 방해 없이 + MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + MS11Opa + 필 + 서 스 펜 션의 비교 평가 필-또는 MS11ΔLgtEPil +입니다. 표시는 평균 값 (±SD)에서 얻은 3 개의 독립적인 실험. p < 0.001; p < 0.01; p < 0.05입니다. 이 그림은 이전에 게시 24 고 허가 함께 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Ceftriaxone 치료에서 집계 내 라이브/죽은 박테리아 분포의 대표적인 데이터. (A) 사전 집계 MS11Opa + 필 +, MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + 필-, 또는 MS11ΔLgtEPil + 중 2 h. 집계 가능한 (녹색) 및 죽은 (레드) GC 시각화를 묻은 다음 있었고 함께 시각 1 µ g/mL ceftriaxone의 유무에 인 큐베이 팅 공초점 형광으로 현미경 눈금 막대: 50 µ m. 이미지 (B) 집계 크기에 대 한 다음 분석 했다 고 죽은 라이브 GC 및 (D) 상관 관계 그래프의 (C) 비율 다음 만들었습니다. 표시는 평균 값 (SD)에서 얻은 3 개의 독립적인 실험의 > 40 이미지. p < 0.001; p < 0.01; p < 0.05입니다. 이 그림은 이전에 게시 24고 허가 함께 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
박테리아는 인체 감염 시 biofilms을 형성할 수 있다. 전통적인 마이크 테스트는 biofilm에서 박테리아를 박멸 하는 데 필요한 농도 반영 되지 않을 수 있습니다. biofilm에 항균 효과 테스트 하려면 방법 biofilm 바이오 매스를 기반으로 CFUs 도금 biofilm 구조의 영향으로 인해 잘못 된 될 수 있습니다. 예를 들어 도금 방법은는 biofilm 중단 될 수 있습니다 하는 경우 작동 합니다. 따라서, 얻은 CFU 실행 가능한 박테리아의 실제 번호 보다 낮은 수 있습니다. 그러나 머릿속 죽은 및 라이브 박테리아는 biofilm 내의 측정 biofilm 내의 박테리아의 생존에 대 한 설립 되었습니다,, 구조와 biofilm의 밀도 따라 얼룩이 지는 실패할 수 있습니다는 biofilm에 침투 하 여 발생 한 부정확 하 고 과소 평가 생존 속도입니다.
여기 방법의 치료 후 세균 생존을 측정 하는 양적 및 시각화 분석 결과 사용 합니다. 이 방법의 장점은 실제 감염에서 본 것에 가까운 환경에서 세균 생존 측정. 비 집계 및 집계 박테리아 사이의 생존 율 차이 생체 외에서 마이크 vivo에서 마이크와 상관 관계가 있는지 확인 하기 위해 우리 것을 허용할 것 이다.
ATP 생산을 측정, ATP 사용률 분석 결과 양적 집계의 생존을 측정할 수 있습니다. 분석 결과 더 민감한 고 항생제 농도, 다른 유사한 분석 실험에 비해 작은 차이 사이 생존을 분화 할 수 있다. 그러나,이 분석 결과의 높은 감도 때문에 세균성 세포 세포의 용 해의 보증은 중요 합니다. 따라서, 쥡니다 단계 사용 되었다. 또한,이 방법은 세균 생존 때문에 많은 양의 ATP 세균성 ATP 수준 마스크 수 호스트 세포 생산 vivo에서 측정을 사용할 수 없습니다. 또한, 호스트 세포의 박테리아 상호 작용 수 있습니다 세균 ATP 생산에 영향을. 이 분석 결과 사용 하 여 안료로 박테리아에 안료는 읽기를 방해할 수로 제한 수 있습니다.
라이브/죽은 얼룩 biofilm 연구에서 널리 사용 되었습니다. 그러나, 착 색 염료의 침투는 코어 얼룩이 지지 않을 수 있습니다 반면만 바깥쪽 박테리아, 얼룩 수 있습니다. 따라서, 그것은 단지 시각화 하지만 하지 정량화, 염료의 고르지 못한 배급 때문에 사용할 수 있습니다. 우리이 얼룩에 대 한 작은 집계를 사용 하 고이 분석 결과 계량 집계 내 전체 세균 생존 하는 데 사용할 수 있습니다 입증. 또한, 부정과 긍정적인 컨트롤 다른 박테리아에 대 한 염료의 농도 조정 하기 위해 필요 합니다.
함께 마이크 프로토콜, ATP 사용률 분석 결과 및 라이브/죽은 얼룩 양적 및 시각적으로 뿐만 아니라 다른 세균 집계25,26 N.gonorrhoeae 를 분석 하는 효과적인 방법으로 사용할 수 있습니다. 결합 된 프로토콜의 응용 프로그램 박테리아 biofilms에 따라 마약 검사에서의 다양 한 사용과 함께 질병 형성의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다. 이 메서드는 vivo에서 항생제의 마이크 더 정확 하 게 반영 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 D.C.S.를 되었다 AI123340 건강의 국립 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다. L.-C.W., jw 메리어트, 교류, E.N. 부분/메릴랜드 대학에 의해 투자 하는 "첫 해 혁신 및 연구 경험" 프로그램에 참여에 지원 했다. Funders 게시, 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 또는 원고 준비에 전혀 역할을 했다. 우리는 모든 현미경 실험을 위한 UMD CBMG 이미징 코어를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
References
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