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Behavior

कम लागत प्रोटोकॉल पदचिह्न विश्लेषण और चूहों के लिए फांसी बॉक्स परीक्षण के पुराने संयम तनाव लागू

Published: January 23, 2019 doi: 10.3791/59027
Automatic Translation
1, 1
1Division of Biology, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University

Summary

कम लागत पदचिह्न विश्लेषण और फांसी बॉक्स परीक्षण के बाद संयम तनाव से मिलकर प्रोटोकॉल माउस मॉडल के आंदोलन विकारों के मूल्यांकन के लिए उपयोगी है ।

Abstract

चाल अशांति अक्सर आंदोलन विकारों के साथ रोगियों में मनाया जाता है । माउस को आंदोलन विकारों के लिए इस्तेमाल किया मॉडल में, चाल विश्लेषण महत्वपूर्ण व्यवहार परीक्षण के लिए निर्धारित है कि क्या चूहों रोगियों के लक्षणों की नकल है । मोटर घाटे अक्सर तनाव से प्रेरित कर रहे है जब कोई सहज मोटर phenotype माउस मॉडल में मनाया जाता है । इसलिए, चाल विश्लेषण तनाव लदान के बाद माउस मॉडल में मोटर phenotype मूल्यांकन के लिए एक संवेदनशील तरीका होगा । हालांकि, शोधकर्ताओं ने एक महंगी उपकरण की आवश्यकता का सामना करने के लिए मात्रात्मक परिणाम स्वचालित रूप से चाल विश्लेषण से प्राप्त । तनाव के लिए, बिजली के झटके और जबरिया चलने के लिए आवश्यक उपकरणों के बिना सरल तरीके से लोड तनाव वांछनीय है । इसलिए, हम एक सरल और कम लागत कागज और स्याही के साथ पदचिह्न विश्लेषण से मिलकर प्रोटोकॉल परिचय, हैंगिंग बॉक्स परीक्षण मोटर समारोह का मूल्यांकन करने के लिए, और तनाव एक शंकु ट्यूब के साथ संयम से परिभाषित लोड हो रहा है । इस प्रोटोकॉल द्वारा चूहों के मोटर घाटे का सफलतापूर्वक पता लगाया गया ।

Introduction

आंदोलन विकारों तंत्रिका तंत्र की गड़बड़ी के रूप में परिभाषित कर रहे है एक अतिरिक्त या स्वैच्छिक या स्वचालित आंदोलनों की धनाभाव1दिखा । विशेष रूप से, चाल अशांति अक्सर आंदोलन विकारों2,3,4के साथ रोगियों के बीच प्रलेखित है । इसलिए, चाल विश्लेषण आंदोलन विकारों के पशु मॉडलों के सत्यापन के लिए एक उपयुक्त व्यवहार परीक्षण है । चूहों में, स्वचालित चाल विश्लेषण6,7ट्रेडमिल से प्राकृतिक गति5 और समायोज्य गति पर चलने के लिए प्रदर्शन किया गया है । ये विश्लेषण स्वचालित रूप से चाल के मात्रात्मक परिणाम प्रदान करते हैं । एक वैकल्पिक विधि चाल अशांति का पता लगाने के लिए पदचिह्न विश्लेषण कहा जाता है । स्याही के साथ पैर के नीचे के लेबल के बाद, चूहों कागज पर चलते हैं, और पैरों के निशान विश्लेषण कर रहे हैं । शुरू में, वैसलीन और पाउडर चारकोल के पदचिह्न8कल्पना करते थे, और फिर polygraph कागज9 पर स्याही से बदल रहे थे और फोटो कागज10पर फोटो डेवलपर । एक सस्ता और कम विषाक्त अंय तरीकों से स्याही और कागज का उपयोग विधि11तारीख को रहता है । पदचिह्न विश्लेषण कम स्वचालित विश्लेषण5,6,7 के साथ तुलना में महंगा है और प्रचुर मात्रा में अनुसंधान कोष के बिना शोधकर्ताओं के लिए माउस मॉडलों में आंदोलन विकारों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी होगा .

फांसी बॉक्स परीक्षण चार पैर तार पिंजरे ढक्कन12 और तार मेष स्क्रीन13का उपयोग कर परीक्षण फांसी का एक प्रकार है । बॉक्स एक केंद्र पट्टी के साथ बॉक्स के शीर्ष पर घूर्णन योग्य मेष ढक्कन के साथ एक उपकरण है । चाल विश्लेषण के अलावा, परीक्षण महंगा और आसानी से किया जा सकता है । इसलिए, हम फांसी बॉक्स परीक्षण आयोजित की पकड़ शक्ति और संतुलन का मूल्यांकन करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में पदचिह्न विश्लेषण के अलावा ।

तनाव आंदोलन विकारों14,15के लक्षण लाती है । मोटर घाटे अक्सर कई पुरानी तनाव से प्रेरित भी जब कोई सहज मोटर phenotype एक आंदोलन विकार के माउस मॉडल में मनाया जाता है16,17,18। संयम चूहों में तनाव लदान के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है, क्योंकि पशु शारीरिक रूप से19 नुकसान नहीं है और लागत कम समर्पित तंत्र के साथ बिजली के झटके के रूप में अंय तरीकों के साथ तुलना में है और एक ट्रेडमिल के उपयोग के साथ चलने को मजबूर । एक ट्यूब, जो एक छिद्रित ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एक माउस को परिष्कृत द्वारा किया जाता है द्वारा संयम, तार जाल छलनी, टेप अंग के रूप में अंय तरीकों की तुलना में आसान है, और धुंध के साथ जानवर के लपेटकर (20की समीक्षा की) । इस पत्र में, हम पदचिह्न विश्लेषण और एक ट्यूब द्वारा संयम के बाद फांसी बॉक्स परीक्षण के प्रोटोकॉल संक्षेप । इस प्रोटोकॉल हमें सहज मोटर phenotype बिना आंदोलन विकारों के माउस मॉडल का उपयोग करने में मदद मिलेगी ।

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Protocol

सभी पशु प्रयोग एक मानवीय तरीके से आयोजित किया गया । जीची चिकित्सा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु प्रयोग समिति ने अध्ययन को मंजूरी दे दी । अध्ययन में पशु प्रयोग के लिए संस्थागत विनियमन और जापान के MEXT के क्षेत्राधिकार के अंतर्गत शैक्षिक अनुसंधान संस्थानों में पशु प्रयोग और संबंधित गतिविधियों के समुचित संचालन के लिए मौलिक दिशानिर्देश के अनुसार आयोजित किया गया था । इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए चूहों को पहले21बताया गया है ।

1. हैंगिंग बॉक्स टेस्ट

  1. प्रत्येक माउस के वजन रिकॉर्ड । व्यक्तिगत भेदभाव (जैसे, एक लाइन, डबल लाइनों, और ट्रिपल लाइनों) के लिए कलम अंकन द्वारा पूंछ निशान ।
    नोट: वृद्धि curves सामांय स्वास्थ्य22के एक सूचकांक के लिए उपयोग किया जाता है ।
  2. व्यवहारिक परीक्षण से पहले चूहों को प्रायोगिक कक्ष में कम से 30 मिनट तक रखें । फांसी बॉक्स, जो एक स्पष्ट बॉक्स (25 x 25 x ४० सेमी3) के शीर्ष पर एक घूर्णन जाल ढक्कन के साथ होते है सेट (चित्रा 1) । मेष ढक्कन एक केंद्रीय बार इतना है कि शीर्ष १८० डिग्री से फ़्लिप किया जाता है के साथ घुमाया जा सकता है ।
  3. जाल ढक्कन के केंद्र में एक चूहा रखो । ध्यान से नीचे की ओर जाल ढक्कन बारी ।
  4. मेष ढक्कन से गिर विलंबता (फांसी समय) माउस के उपाय ।
    नोट: माउस 5 मिनट के भीतर गिर नहीं है, तो 5 मिनट के रूप में विलंबता रिकॉर्ड.
  5. घर के पिंजरे में चूहे को लौटें । हर परीक्षण के बाद ७०% इथेनॉल के साथ हैंगिंग बॉक्स को साफ करें ।

2. पदचिह्न विश्लेषण

नोट: फांसी बॉक्स परीक्षण के बाद, पदचिह्न विश्लेषण करते हैं ।

  1. सेट अप पार्षद रनवे (चित्र 2a) ।
    1. सफेद कागज का एक टुकड़ा (२९.७ सेमी x ४२ सेमी x ०.०९ mm) longitudinally बराबर चौड़ाई के तीन लंबाई में काट । तालिका पर सफेद कागज (९.९ cm x ४२ cm) का एक टुकड़ा सेट करें ।
    2. कागज के बाहर के छोर पर डार्क गोल बॉक्स रखो । अंय बक्से रखो (लगभग कागज के रूप में एक ही लंबाई) रनवे के दोनों किनारों पर दीवारों के साथ, चूहों के भागने को रोकने ।
    3. अलग पेट्री व्यंजन (व्यास में ३५ मिमी) में काली स्याही और लाल स्याही रखो ।
  2. प्रशिक्षण सत्र ।
    नोट: केवल 4 सप्ताह की आयु में प्रशिक्षण सत्र निष्पादित करें ।
    1. कागज के समीपस्थ अंत पर एक माउस रखो (लक्ष्य बॉक्स की ओर सिर का सामना) । लक्ष्य बॉक्स के लिए समीपस्थ अंत से माउस चलने दें । लक्ष्य बॉक्स से माउस निकालें । यदि माउस कागज पर बंद हो जाता है, धीरे से उंगली से लक्ष्य बॉक्स के लिए माउस धक्का ।
    2. forelimbs के आंदोलन को सीमित करने के लिए अंगूठे और तर्जनी के बीच scruff लोभी द्वारा माउस पकड़ो । फिर, पीठ और अंगूठे की गेंद और अंय उंगलियों के बीच पूंछ समझ hindlimbs के आंदोलन को सीमित करने के लिए ।
      नोट: कपड़ों पर स्याही के दाग में एक माउस परिणामों की अपर्याप्त होल्डिंग ।
    3. लाल स्याही में forelimbs के नीचे और hindlimbs के नीचे से काली स्याही में विसर्जित कर दिया । तुरंत कागज के समीपस्थ अंत पर माउस डाल (लक्ष्य बॉक्स की ओर सिर का सामना) । लक्ष्य बॉक्स के लिए समीपस्थ अंत से माउस चलने दें । यदि माउस कागज पर बंद हो जाता है, धीरे से उंगली से लक्ष्य बॉक्स के लिए माउस धक्का ।
    4. लक्ष्य बॉक्स से माउस निकालें । परीक्षण सत्र पर जाएं ।
  3. परीक्षण सत्र ।
    1. प्रशिक्षण सत्र के बाद, सफेद कागज की एक नई काट टुकड़ा के साथ पैरों के निशान के लिए रनवे की स्थापना की ।
    2. forelimbs के आंदोलन को सीमित करने के लिए अंगूठे और तर्जनी के बीच scruff लोभी द्वारा माउस पकड़ो । फिर, पीठ और अंगूठे की गेंद और अंय उंगलियों के बीच पूंछ समझ hindlimbs के आंदोलन को सीमित करने के लिए ।
    3. लाल स्याही में forelimbs के नीचे और hindlimbs के नीचे से काली स्याही में विसर्जित कर दिया । तुरंत कागज के समीपस्थ छोर पर माउस रख दिया । लक्ष्य बॉक्स के लिए समीपस्थ अंत से माउस चलने दें ।
      नोट: क्योंकि चूहों अंधेरे को पसंद करते हैं, घूमना माउस के रूप में steadier अंधेरे लक्ष्य बॉक्स दृष्टिकोण हो जाता है । यदि माउस कागज पर बंद हो जाता है, धीरे से उंगली से लक्ष्य बॉक्स के लिए माउस धक्का । उसके बाद, यदि विश्वसनीय पदचिह्न विश्लेषण के लिए प्राप्त नहीं कर रहे हैं (चरण २.४ देखें । विवरण के लिए पैरों के निशान का विश्लेषण) माउस बंद कर दिया है, क्योंकि परीक्षण सत्र का पुनर्प्रयास करें ।
    4. लक्ष्य बॉक्स से माउस घर के पिंजरे में लौटें । प्रत्येक परीक्षण सत्र के बाद ७०% इथेनॉल के साथ लक्ष्य बॉक्स साफ । हवा-पैर छपे कागज को सुखाकर.
  4. पैरों के निशान का विश्लेषण
    1. प्रत्येक पैरामीटर के तीन माप प्राप्त करें (forelimbs और hindlimbs की छलाँग लंबाई, सामने और हिंद आधार चौड़ाई, forelimb और hindlimb के बीच ओवरलैप, चित्र बी-ए) पैर से एक शासक के साथ मुद्रित कागज.
      नोट: क्योंकि समीपस्थ और बाहर के पैरों के निशान अक्सर रोक या चल रहा है, क्योंकि बड़े बदलाव दिखाने के पैरों के निशान के एक स्थिर चाल पैटर्न के साथ भाग का चयन करें । पैर मुद्रित कागज के मध्य भाग आमतौर पर विश्लेषण के लिए उपयुक्त हो जाएगा ।
      1. छलाँग लंबाई के लिए, पंजा (जैसे, पंजा पैड या पैर के अंगूठे) के एक ही भागों के बीच दूरी को मापने ।
      2. सामने बेस चौड़ाई के लिए, लगातार सही (या बाएं) सामने पैरों के निशान के बीच एक लाइन ड्रा । फिर, बाएँ (या दाएँ) सही (या बाएँ) पदचिह्नों के बीच खींची रेखा के सामने पदचिह्न के पैड से ऊर्ध्वाधर लाइन की लंबाई को मापने.
      3. हिंद आधार चौड़ाई के लिए, लगातार सही (या बाएं) हिंद पैरों के निशान के बीच एक लाइन ड्रा । फिर, बाएं (या दाएं) के पैड से ऊर्ध्वाधर रेखा की लंबाई मापने सही (या बाएं) पैरों के निशान के बीच तैयार की रेखा को हिंद पदचिह्न ।
      4. ओवरलैप के लिए, बाएँ (या दाएँ) सामने और हिंद पैरों के निशान के पैड के बीच की दूरी को मापने.
    2. प्रत्येक व्यक्ति के लिए तीन माप औसत । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रत्येक पैरामीटर के व्यक्तिगत औसत का उपयोग करें ।
      1. प्रगति की लंबाई के लिए, छोड़ दिया और सही प्रगति के व्यक्तिगत औसत के औसत का उपयोग करें ।
      2. प्रगति की लंबाई के विषमता के लिए, बाएँ अंग और सही अंग छलाँग लंबाई के व्यक्तिगत औसत के बीच अंतर का निरपेक्ष मूल्य का उपयोग करें.
      3. अंय मापदंडों के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए (फ्रंट बेस चौड़ाई, हिंद आधार चौड़ाई, और ओवरलैप), व्यक्तिगत औसत सीधे उपयोग करें ।

3. संयम तनाव लोड हो रहा है

  1. संयम ट्यूबों की तैयारी ।
    1. 16 छेद (व्यास में लगभग 2 मिमी) एक ५० मिलीलीटर में शंकु ट्यूब (30 मिमी व्यास x ११५ मिमी में लंबाई में) के साथ पैमाने पर निशान (5, 10, 15, 20, 25, 30, ३५, ४० मिलीलीटर) और स्क्वायर ड्रिल (चित्रा 3) द्वारा प्रत्येक पैमाने पर निशान की पीठ । ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब की नोक पर एक छेद बनाने के लिए बंद टिप काटने से सांस लेने के लिए (व्यास में लगभग 5 मिमी) । एक छेद करें (व्यास में लगभग 4 मिमी) ट्यूब कैप में चूहों की पूंछ गुजरती है.
  2. तनाव लोड हो रहा है
    1. चूहों को प्रयोगात्मक कक्ष में रखें ।
    2. अंगूठे और तर्जनी के बीच scruff को पकड़कर एक चूहा पकड़ो । सिर से संयम ट्यूब में माउस दर्ज करें । टोपी में छेद के माध्यम से पूंछ गुजरती हैं । कैप बंद करें ।
      नोट: forelimb आंदोलन को सीमित करें, क्योंकि चूहों forelimbs द्वारा ट्यूब में प्रवेश अस्वीकार ।
    3. कमरे के तापमान पर एक मेज पर 2 घंटे के लिए संलग्न माउस रखो । संयम ट्यूब से माउस निकालें और घर के पिंजरे में वापस लौटें ।
      नोट: संयम ट्यूबों एक धोने और शुष्क के बाद फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है ।

4. प्रायोगिक अनुसूची (चित्रा 4):

  1. फांसी बॉक्स परीक्षण और उम्र के 4 सप्ताह में एक ही दिन पर पदचिह्न विश्लेषण प्रदर्शन (चरण 1 देखें. हैंगिंग बॉक्स परीक्षण और चरण 2 । पदचिह्न विश्लेषण विवरण के लिए) सभी चूहों पर ' तनाव समूह ' और एक ' गैर तनाव समूह ' में समूहीकरण से पहले एक आधारभूत माप के रूप में ।
    नोट: के बारे में 8-10 चूहों में 2-3 कूड़े एक प्रयोग में उपयोग करने के लिए उपयुक्त हो सकता है. उंर के 4 सप्ताह में पदचिह्न विश्लेषण प्रशिक्षण और परीक्षण सत्र के होते हैं ।
  2. अनियमित चूहों एक ' तनाव समूह ' और एक ' गैर तनाव समूह ' में विभाजित ।
    नोट: जब चूहों कई कूड़े से मिलकर उपयोग किया जाता है, दोनों समूहों में समान रूप से विभाजित littermates । प्रत्येक समूह में संख्या के बारे में 4-5 चूहे होते हैं ।
  3. लागू करें संयम तनाव ' तनाव समूह ' के लिए 6 बार दो सप्ताह के पाठ्यक्रम पर (चरण 3 देखें । संयम तनाव लोड हो रहा है विवरण के लिए) ।
    नोट: संयम के 6 बार हर दो सप्ताह लागू कर रहे हैं, एक फांसी बॉक्स परीक्षण और उंर के 6-12 सप्ताह से पदचिह्न विश्लेषण के बाद । फांसी बॉक्स परीक्षण और पदचिह्न विश्लेषण के परीक्षण के दिन संयम तनाव को लागू न करें ।
  4. फांसी बॉक्स परीक्षण और पदचिह्न विश्लेषण के 6, 8, 10, और उंर के 12 सप्ताह में एक ही दिन पर परीक्षण सत्र प्रदर्शन ।

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Representative Results

Atp1a3 (Atp1a3+/−) के heterozygous नर चूहे जो तेजी से शुरुआत दुस्तानता पार्किंसंस और वाइल्ड-टाइप littermates के लिए माउस मॉडल हैं, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए थे । Atp1a3+/− उम्र के 4 हफ्तों में जंगली प्रकार की तुलना में forelimb और hindlimb की काफी कम छलाँग लंबाई (चित्रा 5 ए और चित्रा 5B, खुला सर्कल और स्क्वायर) दिखाया । ' तनावग्रस्त ' Atp1a3+/− ' गैर-तनावग्रस्त ' Atp1a3+/− 8 सप्ताह की आयु (चित्र 5 ए और चित्रा 5B, बंद और खुले सर्कल) से दोनों अंगों की काफी कम छलाँग लंबाई दिखाई दी । दोनों अंगों की छलाँग लंबाई के असीमितता सभी उम्र में चूहों के सभी समूहों में काफी अलग नहीं थे (चित्रा 5C और चित्रा 5d). सामने का आधार और दोनों अंगों के ओवरलैप भी सभी उंर में सभी समूहों में समान थे (चित्रा 5E, जी, एच) । हिंद बेस में काफी व्यापक था ' पर जोर दिया ' Atp1a3+/− कि उंर के 10 सप्ताह में ' पर जोर दिया ' जंगली प्रकार चूहों में (चित्रा 5F, बंद सर्कल और वर्ग) । इस प्रकार, संयम तनाव के कारण मोटर घाटे (शॉर्ट डग और वाइड बेस) की Atp1a3+/

फांसी बॉक्स परीक्षण के पदचिह्न विश्लेषण के परीक्षण के दिन पर पकड़ शक्ति और संतुलन का मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शन किया गया । हैंगिंग टाइम में कोई महत्वपूर्ण अंतर 4 से 10 सप्ताह पुराने चूहों (चित्रा 6) में मनाया गया । उम्र के 12 हफ्तों में, ' तनाव ' जंगली प्रकार के चूहों की फांसी के समय काफी अधिक था कि अन्य समूहों (चित्रा 6, बंद वर्ग) की तुलना में अब । संयम तनाव लंबे समय तक जंगली-प्रकार चूहों में लटका है, लेकिन Atp1a3 में नहीं +/ इस प्रकार Atp1a3+/− के मोटर घाटे को संयमित तनाव द्वारा जंगली प्रकार के चूहों से अलग किया गया ।

शरीर के वजन के सामांय स्वास्थ्य22के एक सूचकांक है । हम फांसी बॉक्स परीक्षण और पदचिह्न विश्लेषण के परीक्षण के दिन चूहों के शरीर के वजन मापा, और सभी उम्र में चूहों के सभी समूहों में कोई महत्वपूर्ण अंतर देखा गया (चित्रा 7). इस प्रकार संयम तनाव ने चूहों के सामान्य स्वास्थ्य को प्रभावित नहीं किया ।

Figure 1
चित्रा 1: एक घूर्णन जाल ढक्कन के साथ बॉक्स उपकरण हैंगिंग । एक चूहा जाल ढक्कन के केंद्र में रखा गया था, और फिर जाल ढक्कन ऊपर की ओर मुड़ गया था । जाल ढक्कन से माउस के पतन विलंबता मापा जा करने के लिए है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: पदचिह्न विश्लेषण । (क) पदचिह्न विश्लेषण के लिए रनवे । एक पैर से पेंट माउस (forelimbs: लाल स्याही; hindlimbs: काली स्याही) को समीपस्थ छोर से लक्ष्य बॉक्स तक चलने की अनुमति दी गई थी । (ख) पदचिह्न और मापदंडों की माप की प्रतिनिधि छवि । प्रत्येक पैरामीटर के तीन माप (forelimb और hindlimb छलाँग लंबाई, सामने की चौड़ाई और हिंद बेस, forelimb और hindlimb के बीच ओवरलैप) पैर मुद्रित कागज से प्राप्त किए गए थे. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: छिद्रित ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब द्वारा संयम तनाव । संयम ट्यूब सांस लेने के लिए एक छेद है, पूंछ गुजर के लिए एक छेद है, और हवा संचलन के लिए 16 छेद । माउस ट्यूब में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए रखा गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: फांसी बॉक्स परीक्षण के प्रयोगात्मक अनुसूची और जीर्ण संयम तनाव लोड हो रहा है के साथ पदचिह्न विश्लेषण । पदचिह्न विश्लेषण और फांसी बॉक्स परीक्षण उंर के 4 सप्ताह में प्रदर्शन किया गया । फिर, चूहों ' तनाव ' और ' गैर तनाव ' समूहों में विभाजित किया गया । ' तनावग्रस्त ' समूह के लिए संयमित तनाव को 12 सप्ताह की आयु तक 2 सप्ताह में 6 बार लागू किया गया । दोनों समूहों के लिए, पदचिह्न विश्लेषण और फांसी बॉक्स परीक्षण 2 सप्ताह की उंर के 12 सप्ताह तक प्रति एक बार प्रदर्शन किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: पदचिह्न विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम । पदचिह्न विश्लेषण 4 सप्ताह पुराने Atp1a3+/− (a3) और वंय-प्रकार (wt) चूहों (N = 19 और 17, क्रमशः) के साथ किया गया था । फिर, Atp1a3+/− और जंगली-प्रकार के चूहों को ' तनावग्रस्त ' और ' गैर-तनावग्रस्त ' समूहों में विभक्त किया गया । पदचिह्न विश्लेषण के लिए आयोजित किया गया था ' गैर तनाव ' Atp1a3+/−, ' गैर-तनावग्रस्त ' वन्य-प्रकार, ' तनावग्रस्त ' Atp1a3+/−, और ' जोर दिया ' जंगली-प्रकार चूहों से 6-12 आयु के सप्ताह (खुला हलकों, n = 9; खुला वर्ग, n = 8; ठोस हलकों , N = 10; ठोस चौकों, N = 9, क्रमशः) । (क) डग लम्बाई की forelimb. (ख) hindlimb की छलाँग लम्बाई. (ग) विषमता की forelimb छलाँग लंबाई. (घ) विषमता की hindlimb छलाँग लंबाई. (ङ) forelimbs के बीच चौड़ाई । (च) hindlimbs के बीच चौड़ाई । (G) बाएं forelimb और hindlimb के बीच ओवरलैप । (ज) दाएँ forelimb और hindlimb के बीच ओवरलैप. डेटा मतलब ± एसडी कर रहे हैं । सांख्यिकीय विश्लेषण (टीपरीक्षण के लिए 4 सप्ताह पुराने चूहों और pairwise टीपरीक्षण के लिए होल्म समायोजन विधि के साथ 6-12 सप्ताह पुराने चूहों) आर23द्वारा प्रदर्शन किया गया. # p < .05, for ' गैर-तनावग्रस्त ' Atp1a3+/− और ' गैर-तनावग्रस्त ' जंगली प्रकार के चूहे. * p < .05, for ' मुलांवर ' Atp1a3+/− और ' तनावग्रस्त ' जंगली किस्म के चूहे । + p < .05, ' गैर-तनावग्रस्त ' और ' तनावग्रस्त ' Atp1a3+/− चूहों के लिए । चित्र 5 ए -एफ Elsevier की अनुमति के साथ संदर्भ18 से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: फांसी बॉक्स परीक्षण के प्रतिनिधि परिणाम. हैंगिंग बॉक्स परीक्षण 4 सप्ताह की आयु में Atp1a3+/− (a3) और वाइल्ड-टाइप (wt) चूहों के साथ किया गया था । फिर, Atp1a3+/− और जंगली-प्रकार के चूहों को ' तनावग्रस्त ' और ' गैर-तनावग्रस्त ' समूहों में विभक्त किया गया । हैंगिंग टाइम ऑफ़ 4-वीक-ओल्ड Atp1a3+/− (ओपन सर्कल्स, n = 19) और वंय-प्रकार (खुला चौकों, एन = 17) चूहों और 6-12 के हैंगिंग समय-सप्ताह पुराने ' गैर तनाव ' Atp1a3+/− (खुले हलकों, एन = 9), ' गैर तनाव ' जंगली प्रकार (खुले चौकों , n = 8), ' तनावग्रस्त ' Atp1a3+/− (ठोस वृत्त, N = 10), और ' तनावग्रस्त ' वाइल्ड-टाइप (ठोस चौकोर, N = 9) चूहों को लघुगणकीय पैमाने पर प्लॉट किया गया । डेटा मतलब ± एसडी कर रहे हैं । सांख्यिकीय विश्लेषण (टीपरीक्षण के लिए 4 सप्ताह पुराने चूहों और pairwise टीपरीक्षण के लिए होल्म समायोजन विधि के साथ 6-12 सप्ताह पुराने चूहों) आर23द्वारा प्रदर्शन किया गया. * p < .05, for ' मुलांवर ' Atp1a3+/− और ' तनावग्रस्त ' जंगली किस्म के चूहे । $ p < .05, ' गैर-तनावग्रस्त ' और ' तनावग्रस्त ' जंगली प्रकार के चूहों के लिए । + p < .05, for ' गैर-तनावग्रस्त ' Atp1a3+/− और ' तनावग्रस्त ' जंगली प्रकार के चूहे । डेटा को Elsevier की अनुमति से संदर्भ18 से पुनर्मुद्रित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: विकास घटता के प्रतिनिधि परिणाम। Atp1a3+/− (a3) और वाइल्ड-टाइप (wt) चूहों की आयु के 4 सप्ताह (खुले हलकों, n = 19; खुले वर्ग, n = 17, क्रमशः) में शरीर भार मापा गया । फिर, Atp1a3+/− और जंगली-प्रकार के चूहों को ' तनावग्रस्त ' और ' गैर-तनावग्रस्त ' समूहों में विभक्त किया गया । ' गैर-तनावग्रस्त ' Atp1a3+/− (खुली वृत्तियों की आयु के 6 और 12 सप्ताह के बीच शरीर का भार, n = 9), ' गैर-तनावग्रस्त ' जंगली-प्रकार (खुला वर्ग, N = 8), ' तनावग्रस्त ' Atp1a3+/− (ठोस हलकों, N = 10), और ' तनाव ' जंगली प्रकार (ठोस चौकोर, N = 9) चूहों को मापा गया । डेटा मतलब ± एसडी कर रहे हैं । सांख्यिकीय विश्लेषण (टीपरीक्षण के लिए 4 सप्ताह पुराने चूहों और pairwise टीपरीक्षण के लिए होल्म समायोजन विधि के साथ 6-12 सप्ताह पुराने चूहों) आर23द्वारा प्रदर्शन किया गया. चित्रा 7 Elsevier की अनुमति के साथ संदर्भ18 से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

पदचिह्न विश्लेषण और फांसी बॉक्स परीक्षण चूहों की मोटर समारोह के लिए सरल और सस्ती व्यवहार परीक्षण कर रहे हैं । इन परीक्षणों के द्वारा कई माउस मॉडलों में neurobehavioral phenotypes सफलतापूर्वक पाया गया है । उदाहरण के लिए, पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस24में छोटा डग लंबाई, गतिभंग में विषम प्रगति की लंबाई में वृद्धि-telangiectasia25, Huntington की बीमारी में ओवरलैप की लंबाई में वृद्धि26 और दुस्तानता27, और गतिभंग में चौड़ा आधार28,29, Angelman सिंड्रोम30 और दुस्तानता31 पदचिह्न विश्लेषण द्वारा प्रदर्शन किया गया । साथ ही, छोटे हैंगिंग समय से उस पर नियंत्रण चूहे Duchenne पेशी dystrophy३२के माउस मॉडल में मनाया गया था । इस प्रकार, दोनों परीक्षण इस पत्र में वर्णित चूहों की मोटर रोग के मूल्यांकन के लिए उपयोगी होगा ।

इस प्रोटोकॉल के एक महत्वपूर्ण कदम के लिए तेज पैरों के निशान प्राप्त है । सूखने से बचने के लिए स्याही में पैरों के नीचे की ओर विसर्जित करने के तुरंत बाद कागज पर माउस डालना बहुत जरूरी है । यह एक कम समय में विसर्जित कदम (कदम 2.2.3 और 2.3.3) खत्म करने के लिए आवश्यक है । पदचिह्न विश्लेषण के इस प्रोटोकॉल का एक नुकसान यह है कि प्राप्त मापदंडों सरल लोगों कि लौकिक जानकारी (जैसे, चाल चक्र और प्रत्येक पैर के कदम अनुक्रम की अवधि) और शारीरिक जानकारी शामिल नहीं है तक ही सीमित है (जैसे, के दबाव स्पर्श के आधार पर संवेदनशील एलईडी पैनल) पदचिह्न । जब लौकिक और भौतिक जानकारी की आवश्यकता है, एक स्वचालित चाल विश्लेषण उपकरण का उपयोग किया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, चाल पैटर्न के लौकिक जानकारी उच्च गति कैमरा३३द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । एक और नुकसान यह है कि पैर पर मानकों को मापने मुद्रित कागज स्वचालित चाल विश्लेषण से अधिक श्रमसाध्य है । भविष्य के आवेदन के लिए, पैर मुद्रित कागज से semiautomated या स्वचालित डेटा संग्रह के लिए एक कार्यक्रम के विकास के प्रयास व्यय को मापने के मापदंडों को कम करने के लिए आवश्यक हो जाएगा ।

तनाव लोड हो रहा है, के लिए कुल संख्या और सत्र प्रति अवधि इस प्रोटोकॉल में विभिंन किया जा सकता है । संयम तनाव विभिन्न अवधियों और अनुप्रयोगों की संख्या के साथ आयोजित किया गया है (जैसे, एकल के लिए 5 मिनट३४, एकल के लिए 24 h३५, 12 ज x 5 सत्र३६, और 6 एच एक्स 31 सत्र३७, रेफरी में समीक्षा की. 20). हमारे ज्ञान के लिए, कोई व्यवस्थित अध्ययन चूहों की मोटर समारोह पर कुल संख्या और सत्र प्रति अवधि के प्रभाव से संबंधित है । खुले मैदान में चूहों की गतिविधि 1 एच३८ या 2 एच के एकल तनाव लदान से प्रभावित है, लेकिन नहीं है कि 15 मिनट19के द्वारा । तनाव लोड हो रहा है की लंबी अवधि के गंभीर मोटर घाटे के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । तनाव लोड हो रहा है की संख्या के लिए, चूहों के रुख से अधिक व्यापक हो जाता है कि गैर तनाव चूहों की ३६ बार के बाद तनाव लोड हो रहा है (1 घंटे साप्ताहिक), लेकिन नहीं के बाद 30 बार३९. जीर्ण संयम तनाव (31 लगातार दिनों के लिए प्रति दिन 6 घंटे) पार्किंसंस रोग३७के माउस मॉडल में rotarod प्रदर्शन बढ़ जाती है । हमारे परिणामों ने ' तनावग्रस्त ' Atp1a3 के हैंगिंग टाइम को दिखाया +/− चूहों की तुलना में कम हो गया ' तनाव ' जंगली प्रकार चूहों के 24 बार के बाद तनाव लोड हो रहा है (उम्र के 12 सप्ताह में), लेकिन नहीं 18 बार या उससे कम के बाद (4, 6, 8, और उंर के 10 सप्ताह) । इसलिए, दोहराया तनाव लदान चूहों में कुछ मोटर घाटे की प्रेरण के लिए आवश्यक है, हालांकि एक एकल या कई बार तनाव लदान के शुरू से एक लंबी अवधि के बाद मोटर घाटे की प्रेरण बाहर रखा जा सकता है । जब चूहों इस प्रोटोकॉल में एक neurobehavioral phenotype नहीं दिखा, सिफारिश की कुल संख्या और प्रति सत्र तनाव लोड करने की अवधि को बढ़ाने के लिए है । इसके विपरीत, जब चूहों एक एकल या तनाव लोड हो रहा है, अवधि और संख्या के कई बार से चाल विषमता दिखाने के लिए कम किया जा सकता है ।

अंत में, चलने और फांसी के प्रदर्शन भावनात्मक व्यवहार अक्षर (जैसे, चिंता और गतिविधि) मोटर रोग के उन लोगों के अलावा अंय से प्रभावित किया जा सकता है । उच्च चिंता और सक्रियता के साथ चूहों अक्सर लक्ष्य बॉक्स के लिए (चलने के बजाय) चला । अवसाद की तरह व्यवहार दिखा चूहों अक्सर बंद हो जाता है के साथ चल सकता है । इसलिए, एक ंयायपालिका पदचिह्न पैटर्न मोटर घाटे की वजह से नहीं हो सकता है । इस प्रकार, केवल मोटर घाटे से उत्पन्न चाल विषमता की पुष्टि करने के लिए, भावनात्मक विशेषताओं का मूल्यांकन करने वाले अतिरिक्त परीक्षण प्रदर्शन (गतिविधि: ओपन फील्ड टेस्ट; चिंता: ओपन फील्ड और ऊंचा प्लस भूलभुलैया परीक्षण; अवसाद की तरह व्यवहार: मजबूर तैरना परीक्षण) के बाद इस प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित पहले18 उचित है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम JSPS (जापान सोसायटी विज्ञान के संवर्धन के लिए) KAKENHI (अनुदान में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता सी), अनुदान संख्या 18K07373 (H.S.) और निजी विश्वविद्यालयों के लिए सब्सिडी द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanging box O’hara & Co. http://ohara-time.co.jp/products/wire-hanging-test/
Marking pen ZEBRA MO-120-MC-BK
Goal box O’hara & Co. http://ohara-time.co.jp/products/balanced-beam-test/ Accessory for apparatus of balanced beam test
Boxes O’hara & Co. - Side wall of runway
Black ink Shin-asahi -
Red ink Maruyamakogyo BC-6
Disposable Petri Dish Corning 351008 Petri dishes (35 mm in diameter)
Askul Multipaper Super White J Monochrome A3 Askul 701-712 White paper (29.7 cm x 42 cm x 0.09mm)
50 mL Conical tube Corning 430829
Square drill KAKURI Corporation DIY FACTORY (K32-0313)

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Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost Protocol of Footprint Analysis and Hanging Box Test for Mice Applied the Chronic Restraint Stress. J. Vis. Exp. (143), e59027, doi:10.3791/59027 (2019).

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