Alveolaire macrofaag fagocytose en bacteriën mijnen in muizen

Summary

Wij rapporteren hier gemeenschappelijke methoden voor het analyseren van de fagocytische functie van lymfkliertest alveolaire macrofagen en bacteriële klaring van de Long. Deze methoden bestuderen in vitro fagocytose van fluoresceïne isothiocyanaat kralen en in vivo fagocytose van Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Ook beschrijven we een methode voor het ontruimen van P. aeruginosa bij muizen.

Abstract

Alveolaire macrofagen (AMs) bewaken de alveolaire ruimte van de longen. Fagocytose door AMs speelt een cruciale rol in de verdediging tegen invasie ziekteverwekkers, het verwijderen van dode cellen of lichaamsvreemde deeltjes, en in de resolutie van de inflammatoire reacties en weefsel remodeling, verwerkt die worden bemiddeld door verschillende oppervlakte receptoren van de AMs. Hier, rapporteren we methoden voor de analyse van de fagocytische functie van AMs met behulp van in vitro en in vivo tests en experimentele strategieën om te differentiëren tussen de patroon erkenning receptor - aanvulling receptor- en Fc gamma receptor-gemedieerde fagocytose. Tot slot bespreken we een methode om te stellen en een model van de longontsteking P. aeruginosa bij muizen te beoordelen van bacteriële goedkeuring in vivo karakteriseren. Deze testen vormen de meest voorkomende methoden te evalueren AM functies en kunnen ook worden gebruikt om te studeren macrofaag functie en bacteriële mijnen in andere organen.

Introduction

AMs zijn de grote resident fagocyten in de longblaasjes in de rust stadium en één van de belangrijke spelers van aangeboren immuunresponsen door de erkenning en de internalisering van de geïnhaleerde ziekteverwekkers en lichaamsvreemde deeltjes^1,2. Er werd gemeld dat AMs essentieel voor de snelle goedkeuring van de vele pulmonaire ziekteverwekkers zoals P. aeruginosa en Klebsiella longontsteking^3,4, zijn dus een tekort aan AM fagocytose vaak in respiratoire resulteert infecties, zoals acute longontsteking, waardoor hogere mortaliteit en morbiditeit tarieven.

AMs ook aangeboren inflammatoire reacties in de longen door de productie van cytokines en chemokines zoals TNF-α en IL-1β, welke Overspraak met andere cellen van de alveolaire milieu te produceren chemokines en werven van inflammatoire neutrofiele granulocyten, monocyten, starten en adaptieve immune cellen in de longen⁵. Bijvoorbeeld, helpt IL-1β, geproduceerd door AMs om de vrijlating van de neutrofiele chemokine CXCL8 van epitheliale cellen⁶prime. Bovendien, AMs bijdragen aan de fagocytose van apoptotic polymorfonucleaire leukocyten (PMNs), niet van die leidt tot de aanhoudende lekkage van intracellular enzymen uit PMNs het omgevende weefsel, wat resulteert in weefselschade en langdurige ontsteking ^{7 , 8 , 9}.

Fagocytose door de AMs is bemiddeld door een directe erkenning van pathogen-geassocieerde moleculaire patronen aan het oppervlak van de ziekteverwekker door de patroon erkenning receptoren (PRRs) van de AMs of door de binding van opsonized pathogenen met immuun effector receptoren van de AMs ¹⁰. voor het laatste, AMs herkent de doelstellingen opsonized met immunoglobuline (IgG) via hun Fcγ receptoren (FcγR) of de ziekteverwekkers bekleed met aanvulling fragmenten, C3b en C3bi, door hun aanvulling receptoren (CR),¹¹. Onder aanvulling receptoren, de CR van de immunoglobuline superfamilie (CRIg) wordt selectief uitgedrukt in weefsel macrofagen¹², en een recente bevinding benadrukte de rol van de CRIg in AM fagocytose in het kader van P. aeruginosa longontsteking ¹³.

Veel originele studies methoden gebruiken om te evalueren van de macrofaag fagocytose om te beschrijven van de moleculaire mechanismen van macrofaag functie^14,15. Methoden zoals in vivo fagocytose vereisen echter een precieze kwantificering van fagocytose. Hier, we vatten een gedetailleerde methodologie voor zowel in vitro en in vivo fagocytose met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-glazen kralen en P. aeruginosa groen fluorescente proteïne (GFP), respectievelijk. Verder, verklaren wij de methode van differentiëren tussen PRR-, CR- en FcγR-gemedieerde fagocytose. Tot slot melden wij een methode te karakteriseren van bacteriële mijnen in muis met betrekking tot P. aeruginosa longontsteking.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Oost-Virginia Medical School.

1. fluorescerende kralen fagocytose

1. Euthanaseren van de muisknop (C57BL/6J, 6 weken oud, vrouwelijke) door CO₂ verstikking per IACUC protocollen voor de ethische euthanasie van dieren.
2. Leg de muis belly-up op een bord van de dissectie bedekt met papieren handdoeken. Pins zijn poten naar beneden met haar ledematen spread-eagle en haak een tekenreeks krachtens haar voortanden te trekken van haar hoofd terug, zodat de luchtpijp is rechtstreeks geplaatst en niveau.
3. Natte keel, borst en buik met 70% ethanol te ontsmetten en te voorkomen dat de vacht kleven aan de tools van de muis.
4. Met behulp van reguliere pincet, trek de huid op de middellijn van het lichaam, en snijd met een chirurgische schaar van de middellijn naar de top van de keel.
5. Met het botte uiteinde van standaard chirurgische scharen, zorgvuldig opzijschuiven van de spier- en bindweefsel bij de keel en voorjaar schaar (microscissors) gebruiken om de luchtpijp bloot te stellen.
6. Een ring van kraakbeen met de pincet greep zorgvuldig maken een kleine snede (~1.5 mm), met behulp van microscissors, op het gezicht van de hartkamer van de luchtpijp en invoegen van een canule 18 G in de luchtpijp.
7. Zachtjes lavage 3 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 1 mL tegelijkertijd. Telkens wanneer zachtjes trekken de vloeistof in de spuit en reinfuse het terug in de Long, 3 x achter elkaar. Na het verzamelen van de BALF, cervicale dislocatie om euthanasie uit te voeren. De verzamelde PBS (~2.8 mL), oftewel bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF), overbrengen in een buis, centrifuge op 1.000 x g gedurende 10 minuten, en het verzamelen van de pellet. Voeg 1 mL verse PBS aan de buis en centrifuge bij 1.000 x g gedurende 10 minuten voor het wassen van het puin en verzamelen de Ingehuld alveolaire macrofagen.
8. Resuspendeer de pellet in 2 mL zuiver Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 10% nonheat-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) en cultuur primaire alveolaire macrofagen in de dezelfde media voor 2 dagen op een glazen-bodem schotel bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer.
9. De oude media gecombineerd, wassen met PBS 1 mL en voeg toe 2 mL verse media. Voeg FITC kralen (carboxylate latex kralen, 2 µm in diameter, 50 kralen/cel) en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer.
10. Uitgebreid wassen met PBS (1 mL tegelijk, voor een totaal van vijf wasbeurten) te verwijderen van extracellulaire kralen. Willekeurig beeld van 100 cellen en cellen met intracellulaire kralen tellen (488 nm).
    Opmerking: Phagocytic indexen zijn het aantal geconsumeerde kralen gedeeld door het totale aantal macrofagen; het percentage fagocytische cellen is het getal van de macrofagen die ten minste één parel gedeeld door het totale aantal macrofagen¹⁶inslikken.
    1. Uitwijkmogelijkheid, na een 1 uur incubatie met kralen, wassen van de cellen met 3 mL PBS en verwerken voor stroom cytometry voor de kwantificering van fagocytose. Op dezelfde manier verwerken als AMs kralen als onbevlekt cellen of cellen. Berekenen de percentage-positiviteit en betekenen van de intensiteit van de fluorescentie, softwarematig stroom cytometry, door deze opties te selecteren in de software.

2. FcγR - en CR-gemedieerde fagocytose

1. Incubeer voor de opsonization, 2 x 10⁸ schapen rode bloedcellen (SRBCs) met 50 µL konijn anti-SRBC-IgM of 50 µL konijn anti-SRBC-IgG gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur¹¹.
2. Incubeer IgM-opsonized SRBCs met 50 µL van C5-deficiënte (C5D) menselijk serum gedurende 30 minuten bij 37 ° C om op te lossen de aanvulling fragmenten C3b en C3bi op IgM beklede SRBCs.
3. Zaad lymfkliertest macrofaag cellen (MH-S cellen) (10.000 cellen per putje) in een 96-wells-plaat en 's nachts om een samenloop van ~ 70% uit te broeden. Voeg 100 µL van 1 x 10⁷/mL opsonized SRBCs aan elk putje van MH-S cellen en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Wash unbound SRBCs zeer snel (~ 1 min) met 100 µL van ammoniumchloride-kalium (ACK) lysis-buffermengsel.
4. Lyse de cellen met 0,1% SDS en voeg 50 µL van 2,7-diaminofluorene (DAF) met 3% waterstofperoxide en 6 M ureum. Meet de extinctie van de vorming van hemoglobine-gekatalyseerde fluoreen blauw op 620 nm.
5. Bepaal het aantal SRBCs met behulp van een standaard curve op 620 nm extinctie waarden met een bekende aantal SRBCs. Evenzo proces MH-S cellen geïncubeerd met nonopsonized SRBCs om te gebruiken als negatieve controles.

3. PRR-gemedieerde fagocytose

1. Volg stappen 1.1-1.9 voor de isolatie en het kweken van de muis primaire alveolaire macrofagen.
2. Na 2 dagen, verwijder het medium, wassen van de cellen met 1 mL PBS en voeg 500 µL van verse medium met Alexa Fluor-488-geconjugeerd zymosan-A bioparticles (100 deeltjes/schotel).
3. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Stop de fagocytose door 500 µL van ijskoude PBS toe te voegen.
4. Wassen van de cellen uitgebreid met PBS (1 mL tegelijk, voor een totaal van vijf wasbeurten). Het herstellen van de cellen met de 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
5. Spoel de cellen uitgebreid met PBS (1 mL tegelijk, voor een totaal van vijf wasbeurten) en houden van de cellen in 500 µL van PBS.
6. Afbeelding van de cellen onder de differentiële interferentie contrast en een fluorescerende kanaal op 488 nm. AMs zymosan-A bioparticles met tellen en bepalen van het percentage van fagocytose.

4. in Vivo fagocytose door alveolaire macrofagen

Opmerking: P. aeruginosa GFP worden geënt op een plaat nutriëntagar en Incubeer de plaat bij 37 ° C's nachts. Op de volgende dag, de één kolonie aan nutriënten Bouillon 2 mL beënten en groeien de bacteriën bij 37° C's nachts.

1. De volgende dag, anesthetize muizen met een intraperitoneale toediening van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine. Juiste afstomping via een gebrek aan respons op de teen snuifje bevestigen.
2. Leg de muis op een plat bord met een elastiekje over de bovenste snijtanden en plaats deze in de positie van een semirecumbent (45°) met het ventrale oppervlak en de tribune naar boven gericht. De tong met gebogen pincet, gedeeltelijk worden ingetrokken. Met behulp van een microsprayer, intratracheally 50 µL (5 x 10⁶ kolonie-vormende eenheden [CFU])¹⁷ van P. aeruginosa GFP in de longen van de narcose muizen beheren.
3. Na 1 h van besmetting, stappen 1.1-1,7.
4. Resuspendeer de cellen in PBS en cytocentrifuge hen (1.000 x g, 1 minuut bij kamertemperatuur) op een glasplaatje.
5. Differentieel vlek de cytospin dia's voor alveolaire macrofagen en neutrofielen lymfocyten, volgens de instructies van de fabrikant.
6. Willekeurig selecteren 100 AMs, tellen de AMs met intracellulaire bacteriën en bepalen van het percentage van fagocytose.

5. in Vivo bacteriën met behulp van Clearance P. aeruginosa

1. P. aeruginosa op een P. aeruginosa isolatie agarplaat beënten en incuberen de plaat bij 37 ° C's nachts. De één kolonie lysogenie Bouillon (LB) 2 mL beënten en groeien de bacteriën bij 37° C's nachts. De CFU, met de volgende formule worden berekend.
   
   CFU/mL (aantal kolonies x verdunningsfactor) = / volume van de cultuur-plaat.
   
   De cultuur met PBS te krijgen de gewenste CFU/mL verdund.
2. In proef 1, intratracheally injecteren een subletale dosis ~2.5 x 10⁵ CFU/mL P. aeruginosa narcose wild-type (WT) en TRIM72^KO muizen, zoals in stap 4.2. Meten van het lichaamsgewicht dagelijks voor 6 dagen.
3. In proef 2, door een tweede dosis van P. aeruginosa (5 x 10⁵ van CFU/mL) te injecteren in de muizen die overleefde in trial 1 en meten van het lichaamsgewicht voor 4 dagen.
4. In proef 3, gebruik van een andere set van muizen, injecteren WT en TRIM72^KO muizen met een dodelijke dosis (3 x 10⁷ CFU/mL) P. aeruginosa en opnemen van de sterfte binnen 2 dagen na de injectie. Dieren tekenen van ernstige stress zoals significante lichaam gewichtsverlies, zal gebogen rug, anorexia of kortademigheid worden beoordeeld door de behandelende dierenartsen. Onbehandelbaar dieren zullen onmiddellijk worden opgeofferd.
5. Bij dood of na euthanasie op dag 2 na de injectie, verzamelen het gehele longweefsel voor de kwantificering van de Long bacteriële lasten op piek infectie.
6. Testen van de Long bacteriële last, 200 µL van normale zout toevoegen aan de weefsels van de longen en meng ze, met behulp van een eerder geteste instelling op een elektronische homogenizer die volledig het longweefsel verstoort zonder verbreking van de bacteriën. Het totale volume van de Long homogenaat naar 1 mL en plaat 100 µL van Long lysate op Pseudomonas isolatie agar platen in 10-fold seriële verdunningen.
7. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur en tellen de bacteriële kolonies en controleer de kve per hele Long.

6. statistische analyse

1. Gebruik van de Student t-test om te bepalen van de statistische significantie van het verschil tussen de twee groepen. Overwegen een verschil statistisch significant wanneer p < 0.05. Alle gegevens worden gepresenteerd zoals betekent ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM).

Results

We voor het eerst uitgevoerd het experiment te analyseren van fagocytose door muis primaire AMs. In alle analyses vergeleken we AMs geïsoleerd van WT en TRIM72^KO muizen. Zoals blijkt uit Figuur 1A, onthuld fluorescentie microscopie dat fagocytose van FITC-glasparels door muis primaire AMs treedt op na 1 uur incubatie. Figuur 1 B toont de analyse van fagocytose door stroom cytometry. De...

Discussion

Tijdens het uitvoeren van een gas uitwisseling functie, confronteert de Long hardnekkig lichaamsvreemde deeltjes, pathogenen en allergenen. AMs zijn de eerste verdedigingslinie uit hoofde van hun belangrijkste functie, namelijk fagocytose. AMs ook coördineren met andere immuuncellen in het vernietigen van de ziekteverwekkers en in de resolutie van de ontsteking. Hier, beschreven we methoden voor de beoordeling van specifiek fagocytose door AMs geïsoleerd van de muis Long. Het protocol gepresenteerd in dit manuscript verk...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-G Naald	Nipro Medical	CI+1832-2C	Moleculair biologie kwaliteit
2,7-diaminofluoreen (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Moleculair biologie kwaliteit
70% Ethanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Analytische kwaliteit
96-wells plaat	Corning	3603	Celbiologie kwaliteit
ACK lyseringsbuffer	Life Technologies	A10492	Moleculair biologie kwaliteit
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle	Thermofisher Scientific	Z23373	Moleculair biologie kwaliteit
C5-deficiënt serum	Sigma-Aldrich	C1163	Biochemisch reagens
Centrifuge	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Issue 11
DMEM Celkweekmedium	Gibco	11995-065	Celbiologie kwaliteit
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Celbiologie kwaliteit
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Forceps	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Geschikt voor dissectie van laboratoriumdieren
FITC-gecarboxyleerde latexbeadles	Sigma-Aldrich	L4530	Celbiologie kwaliteit
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Geschikt voor celinfectie assays
Glazen bodemschaal	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Celbiologie kwaliteit
Hogedrukspuit	Penn-Century	FMJ-250	Geschikt voor gebruik bij laboratoriumdieren
Homogenisator	Omni International	TH-01
Waterstofperoxide	Sigma-Aldrich	H1009	Analytische kwaliteit
Omgekeerde fluorescentiemicroscoop	Olympus	IX73
Ketamine Hydrochloride	Hospira	CA-2904	Farmaceutische kwaliteit
Shandon Kwik-Diff Kleurstof	Thermofisher Scientific	9990700	Celbiologie kwaliteit
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Moleculair biologie kwaliteit
LB Bouillon	Fisher Scientific	BP1427	Moleculair biologie kwaliteit
MicroSprayer Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Geschikt voor gebruik bij laboratoriumdieren
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagenskwaliteit
PBS	Gibco	20012-027	Celbiologie kwaliteit
konijn anti-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Geschikt voor immuno-assays
konijn anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Geschikt voor immuno-assays
Schaar	Miltex	5-2	Geschikt voor dissectie van laboratoriumdieren
Kleine dieren laryngoscoop	Penn-Century	LS-2	Geschikt voor gebruik bij laboratoriumdieren
Natrium Dodecyl Sulfaat (SDS)	BioRad	1610301	Analytische kwaliteit
Vedermes (Med)	Fine Science Tools	15012-12	Geschikt voor dissectie van laboratoriumdieren
Vedermes (klein)	Fine Science Tools	91500-09	Geschikt voor dissectie van laboratoriumdieren
schapen rode bloedcellen (SRBCs)	MP Biomedicals	55876	Gewassen, geconserveerde SRBCs
Urea	Sigma-Aldrich	U5378	Moleculair biologie kwaliteit
Xylazine	Akorn Animal Health	59399-110-20	Farmaceutische kwaliteit