Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Alveolaire macrofaag fagocytose en bacteriën mijnen in muizen

Published: March 2, 2019 doi: 10.3791/59088

Summary

Wij rapporteren hier gemeenschappelijke methoden voor het analyseren van de fagocytische functie van lymfkliertest alveolaire macrofagen en bacteriële klaring van de Long. Deze methoden bestuderen in vitro fagocytose van fluoresceïne isothiocyanaat kralen en in vivo fagocytose van Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Ook beschrijven we een methode voor het ontruimen van P. aeruginosa bij muizen.

Abstract

Alveolaire macrofagen (AMs) bewaken de alveolaire ruimte van de longen. Fagocytose door AMs speelt een cruciale rol in de verdediging tegen invasie ziekteverwekkers, het verwijderen van dode cellen of lichaamsvreemde deeltjes, en in de resolutie van de inflammatoire reacties en weefsel remodeling, verwerkt die worden bemiddeld door verschillende oppervlakte receptoren van de AMs. Hier, rapporteren we methoden voor de analyse van de fagocytische functie van AMs met behulp van in vitro en in vivo tests en experimentele strategieën om te differentiëren tussen de patroon erkenning receptor - aanvulling receptor- en Fc gamma receptor-gemedieerde fagocytose. Tot slot bespreken we een methode om te stellen en een model van de longontsteking P. aeruginosa bij muizen te beoordelen van bacteriële goedkeuring in vivo karakteriseren. Deze testen vormen de meest voorkomende methoden te evalueren AM functies en kunnen ook worden gebruikt om te studeren macrofaag functie en bacteriële mijnen in andere organen.

Introduction

AMs zijn de grote resident fagocyten in de longblaasjes in de rust stadium en één van de belangrijke spelers van aangeboren immuunresponsen door de erkenning en de internalisering van de geïnhaleerde ziekteverwekkers en lichaamsvreemde deeltjes1,2. Er werd gemeld dat AMs essentieel voor de snelle goedkeuring van de vele pulmonaire ziekteverwekkers zoals P. aeruginosa en Klebsiella longontsteking3,4, zijn dus een tekort aan AM fagocytose vaak in respiratoire resulteert infecties, zoals acute longontsteking, waardoor hogere mortaliteit en morbiditeit tarieven.

AMs ook aangeboren inflammatoire reacties in de longen door de productie van cytokines en chemokines zoals TNF-α en IL-1β, welke Overspraak met andere cellen van de alveolaire milieu te produceren chemokines en werven van inflammatoire neutrofiele granulocyten, monocyten, starten en adaptieve immune cellen in de longen5. Bijvoorbeeld, helpt IL-1β, geproduceerd door AMs om de vrijlating van de neutrofiele chemokine CXCL8 van epitheliale cellen6prime. Bovendien, AMs bijdragen aan de fagocytose van apoptotic polymorfonucleaire leukocyten (PMNs), niet van die leidt tot de aanhoudende lekkage van intracellular enzymen uit PMNs het omgevende weefsel, wat resulteert in weefselschade en langdurige ontsteking 7 , 8 , 9.

Fagocytose door de AMs is bemiddeld door een directe erkenning van pathogen-geassocieerde moleculaire patronen aan het oppervlak van de ziekteverwekker door de patroon erkenning receptoren (PRRs) van de AMs of door de binding van opsonized pathogenen met immuun effector receptoren van de AMs 10. voor het laatste, AMs herkent de doelstellingen opsonized met immunoglobuline (IgG) via hun Fcγ receptoren (FcγR) of de ziekteverwekkers bekleed met aanvulling fragmenten, C3b en C3bi, door hun aanvulling receptoren (CR),11. Onder aanvulling receptoren, de CR van de immunoglobuline superfamilie (CRIg) wordt selectief uitgedrukt in weefsel macrofagen12, en een recente bevinding benadrukte de rol van de CRIg in AM fagocytose in het kader van P. aeruginosa longontsteking 13.

Veel originele studies methoden gebruiken om te evalueren van de macrofaag fagocytose om te beschrijven van de moleculaire mechanismen van macrofaag functie14,15. Methoden zoals in vivo fagocytose vereisen echter een precieze kwantificering van fagocytose. Hier, we vatten een gedetailleerde methodologie voor zowel in vitro en in vivo fagocytose met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-glazen kralen en P. aeruginosa groen fluorescente proteïne (GFP), respectievelijk. Verder, verklaren wij de methode van differentiëren tussen PRR-, CR- en FcγR-gemedieerde fagocytose. Tot slot melden wij een methode te karakteriseren van bacteriële mijnen in muis met betrekking tot P. aeruginosa longontsteking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Oost-Virginia Medical School.

1. fluorescerende kralen fagocytose

  1. Euthanaseren van de muisknop (C57BL/6J, 6 weken oud, vrouwelijke) door CO2 verstikking per IACUC protocollen voor de ethische euthanasie van dieren.
  2. Leg de muis belly-up op een bord van de dissectie bedekt met papieren handdoeken. Pins zijn poten naar beneden met haar ledematen spread-eagle en haak een tekenreeks krachtens haar voortanden te trekken van haar hoofd terug, zodat de luchtpijp is rechtstreeks geplaatst en niveau.
  3. Natte keel, borst en buik met 70% ethanol te ontsmetten en te voorkomen dat de vacht kleven aan de tools van de muis.
  4. Met behulp van reguliere pincet, trek de huid op de middellijn van het lichaam, en snijd met een chirurgische schaar van de middellijn naar de top van de keel.
  5. Met het botte uiteinde van standaard chirurgische scharen, zorgvuldig opzijschuiven van de spier- en bindweefsel bij de keel en voorjaar schaar (microscissors) gebruiken om de luchtpijp bloot te stellen.
  6. Een ring van kraakbeen met de pincet greep zorgvuldig maken een kleine snede (~1.5 mm), met behulp van microscissors, op het gezicht van de hartkamer van de luchtpijp en invoegen van een canule 18 G in de luchtpijp.
  7. Zachtjes lavage 3 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 1 mL tegelijkertijd. Telkens wanneer zachtjes trekken de vloeistof in de spuit en reinfuse het terug in de Long, 3 x achter elkaar. Na het verzamelen van de BALF, cervicale dislocatie om euthanasie uit te voeren. De verzamelde PBS (~2.8 mL), oftewel bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF), overbrengen in een buis, centrifuge op 1.000 x g gedurende 10 minuten, en het verzamelen van de pellet. Voeg 1 mL verse PBS aan de buis en centrifuge bij 1.000 x g gedurende 10 minuten voor het wassen van het puin en verzamelen de Ingehuld alveolaire macrofagen.
  8. Resuspendeer de pellet in 2 mL zuiver Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 10% nonheat-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) en cultuur primaire alveolaire macrofagen in de dezelfde media voor 2 dagen op een glazen-bodem schotel bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer.
  9. De oude media gecombineerd, wassen met PBS 1 mL en voeg toe 2 mL verse media. Voeg FITC kralen (carboxylate latex kralen, 2 µm in diameter, 50 kralen/cel) en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer.
  10. Uitgebreid wassen met PBS (1 mL tegelijk, voor een totaal van vijf wasbeurten) te verwijderen van extracellulaire kralen. Willekeurig beeld van 100 cellen en cellen met intracellulaire kralen tellen (488 nm).
    Opmerking: Phagocytic indexen zijn het aantal geconsumeerde kralen gedeeld door het totale aantal macrofagen; het percentage fagocytische cellen is het getal van de macrofagen die ten minste één parel gedeeld door het totale aantal macrofagen16inslikken.
    1. Uitwijkmogelijkheid, na een 1 uur incubatie met kralen, wassen van de cellen met 3 mL PBS en verwerken voor stroom cytometry voor de kwantificering van fagocytose. Op dezelfde manier verwerken als AMs kralen als onbevlekt cellen of cellen. Berekenen de percentage-positiviteit en betekenen van de intensiteit van de fluorescentie, softwarematig stroom cytometry, door deze opties te selecteren in de software.

2. FcγR - en CR-gemedieerde fagocytose

  1. Incubeer voor de opsonization, 2 x 108 schapen rode bloedcellen (SRBCs) met 50 µL konijn anti-SRBC-IgM of 50 µL konijn anti-SRBC-IgG gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur11.
  2. Incubeer IgM-opsonized SRBCs met 50 µL van C5-deficiënte (C5D) menselijk serum gedurende 30 minuten bij 37 ° C om op te lossen de aanvulling fragmenten C3b en C3bi op IgM beklede SRBCs.
  3. Zaad lymfkliertest macrofaag cellen (MH-S cellen) (10.000 cellen per putje) in een 96-wells-plaat en 's nachts om een samenloop van ~ 70% uit te broeden. Voeg 100 µL van 1 x 107/mL opsonized SRBCs aan elk putje van MH-S cellen en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Wash unbound SRBCs zeer snel (~ 1 min) met 100 µL van ammoniumchloride-kalium (ACK) lysis-buffermengsel.
  4. Lyse de cellen met 0,1% SDS en voeg 50 µL van 2,7-diaminofluorene (DAF) met 3% waterstofperoxide en 6 M ureum. Meet de extinctie van de vorming van hemoglobine-gekatalyseerde fluoreen blauw op 620 nm.
  5. Bepaal het aantal SRBCs met behulp van een standaard curve op 620 nm extinctie waarden met een bekende aantal SRBCs. Evenzo proces MH-S cellen geïncubeerd met nonopsonized SRBCs om te gebruiken als negatieve controles.

3. PRR-gemedieerde fagocytose

  1. Volg stappen 1.1-1.9 voor de isolatie en het kweken van de muis primaire alveolaire macrofagen.
  2. Na 2 dagen, verwijder het medium, wassen van de cellen met 1 mL PBS en voeg 500 µL van verse medium met Alexa Fluor-488-geconjugeerd zymosan-A bioparticles (100 deeltjes/schotel).
  3. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Stop de fagocytose door 500 µL van ijskoude PBS toe te voegen.
  4. Wassen van de cellen uitgebreid met PBS (1 mL tegelijk, voor een totaal van vijf wasbeurten). Het herstellen van de cellen met de 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Spoel de cellen uitgebreid met PBS (1 mL tegelijk, voor een totaal van vijf wasbeurten) en houden van de cellen in 500 µL van PBS.
  6. Afbeelding van de cellen onder de differentiële interferentie contrast en een fluorescerende kanaal op 488 nm. AMs zymosan-A bioparticles met tellen en bepalen van het percentage van fagocytose.

4. in Vivo fagocytose door alveolaire macrofagen

Opmerking: P. aeruginosa GFP worden geënt op een plaat nutriëntagar en Incubeer de plaat bij 37 ° C's nachts. Op de volgende dag, de één kolonie aan nutriënten Bouillon 2 mL beënten en groeien de bacteriën bij 37° C's nachts.

  1. De volgende dag, anesthetize muizen met een intraperitoneale toediening van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine. Juiste afstomping via een gebrek aan respons op de teen snuifje bevestigen.
  2. Leg de muis op een plat bord met een elastiekje over de bovenste snijtanden en plaats deze in de positie van een semirecumbent (45°) met het ventrale oppervlak en de tribune naar boven gericht. De tong met gebogen pincet, gedeeltelijk worden ingetrokken. Met behulp van een microsprayer, intratracheally 50 µL (5 x 106 kolonie-vormende eenheden [CFU])17 van P. aeruginosa GFP in de longen van de narcose muizen beheren.
  3. Na 1 h van besmetting, stappen 1.1-1,7.
  4. Resuspendeer de cellen in PBS en cytocentrifuge hen (1.000 x g, 1 minuut bij kamertemperatuur) op een glasplaatje.
  5. Differentieel vlek de cytospin dia's voor alveolaire macrofagen en neutrofielen lymfocyten, volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Willekeurig selecteren 100 AMs, tellen de AMs met intracellulaire bacteriën en bepalen van het percentage van fagocytose.

5. in Vivo bacteriën met behulp van Clearance P. aeruginosa

  1. P. aeruginosa op een P. aeruginosa isolatie agarplaat beënten en incuberen de plaat bij 37 ° C's nachts. De één kolonie lysogenie Bouillon (LB) 2 mL beënten en groeien de bacteriën bij 37° C's nachts. De CFU, met de volgende formule worden berekend.

    CFU/mL (aantal kolonies x verdunningsfactor) = / volume van de cultuur-plaat.

    De cultuur met PBS te krijgen de gewenste CFU/mL verdund.
  2. In proef 1, intratracheally injecteren een subletale dosis ~2.5 x 105 CFU/mL P. aeruginosa narcose wild-type (WT) en TRIM72KO muizen, zoals in stap 4.2. Meten van het lichaamsgewicht dagelijks voor 6 dagen.
  3. In proef 2, door een tweede dosis van P. aeruginosa (5 x 105 van CFU/mL) te injecteren in de muizen die overleefde in trial 1 en meten van het lichaamsgewicht voor 4 dagen.
  4. In proef 3, gebruik van een andere set van muizen, injecteren WT en TRIM72KO muizen met een dodelijke dosis (3 x 107 CFU/mL) P. aeruginosa en opnemen van de sterfte binnen 2 dagen na de injectie. Dieren tekenen van ernstige stress zoals significante lichaam gewichtsverlies, zal gebogen rug, anorexia of kortademigheid worden beoordeeld door de behandelende dierenartsen. Onbehandelbaar dieren zullen onmiddellijk worden opgeofferd.
  5. Bij dood of na euthanasie op dag 2 na de injectie, verzamelen het gehele longweefsel voor de kwantificering van de Long bacteriële lasten op piek infectie.
  6. Testen van de Long bacteriële last, 200 µL van normale zout toevoegen aan de weefsels van de longen en meng ze, met behulp van een eerder geteste instelling op een elektronische homogenizer die volledig het longweefsel verstoort zonder verbreking van de bacteriën. Het totale volume van de Long homogenaat naar 1 mL en plaat 100 µL van Long lysate op Pseudomonas isolatie agar platen in 10-fold seriële verdunningen.
  7. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur en tellen de bacteriële kolonies en controleer de kve per hele Long.

6. statistische analyse

  1. Gebruik van de Student t-test om te bepalen van de statistische significantie van het verschil tussen de twee groepen. Overwegen een verschil statistisch significant wanneer p < 0.05. Alle gegevens worden gepresenteerd zoals betekent ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We voor het eerst uitgevoerd het experiment te analyseren van fagocytose door muis primaire AMs. In alle analyses vergeleken we AMs geïsoleerd van WT en TRIM72KO muizen. Zoals blijkt uit Figuur 1A, onthuld fluorescentie microscopie dat fagocytose van FITC-glasparels door muis primaire AMs treedt op na 1 uur incubatie. Figuur 1 B toont de analyse van fagocytose door stroom cytometry. De kwantificering van fagocytose gemeten door microscopie en stroom cytometry is vertegenwoordigd in Figuur 1C en Figuur 1D, respectievelijk. FcγR - en CR-gemedieerde fagocytose door MH-S cellen wordt weergegeven in Figuur 2en Figuur 2B toont de kwantificering. Deze resultaten tonen aan dat de uitdrukking van TRIM72 in cellen van de MH-S in een meer dan vijfvoudige daling in aanvulling fagocytose resulteerden. Representatieve beelden van Alexa Fluor-488-geconjugeerd zymosan-A particle inname door primaire AMs geïsoleerd van WT of TRIM72KO muizen zijn afgebeeld in Figuur 2C, en de kwantificering is voorgesteld in Figuur 2D . In vivo fagocytose resultaat wordt weergegeven in Figuur 3. Figuur 3 A toont differentiële kleuring identificeren van de aanwezigheid van AMs, neutrofielen, en lymfocyten en fagocytische cellen van GFP+ . Het percentage BALF cellen en de kwantificering van fagocytose is vertegenwoordigd in Figuur 3B en Figuur 3C, respectievelijk. Het percentage van het verlies van het gewicht van het lichaam in muizen na toediening van een dosis subletale P. aeruginosa intratracheale is weergegeven in figuur 4A, en het percentage van de overleving van muizen op dag 2 na een dodelijke dosis van P. aeruginosa is aangegeven in figuur 4B. Figuur 4 C toont een scatterplot voor de gehele-lung bacteriële last bij overlijden of op dag 2 na de P. aeruginosa infectie in muizen.

Figure 1
Figuur 1 : Fagocytose in muis primaire alveolaire macrofagen. (A) representatieve beelden van lage versus hoge phagocytic indexen met primaire AMs bevattende groene fluorescent bolletjes (links); representatieve afbeeldingen tonen van lage en hoge percentages van fagocytische AMs. Pijlen: lage phagocytic index AMs; pijlpunten: hoge phagocytic index AMs. De schaal bar = 25 µm voor de linker twee beelden en 50 µm voor de recht twee beelden. (B) vertegenwoordiger flow cytometry detectie van phagocytizing cellen in neen-beads control, WT + kralen en TRIM72KO + kralen AMs. De bars-define de kraal-bevattende celpopulatie (in procenten) en de intensiteit van de gemiddelde fluorescence (MFI's). (C) statistieken van de gemiddelde phagocytic-index en het percentage fagocytische AMs in WT en TRIM72KO AMs; n = 5 voor beide groepen *p < 0.05. (D) statistieken van cytometry van de flow MFI en het percentage van FITC+ cellen in WT en TRIM72KO AMs; n = 3 voor beide groepen *p < 0.05. Dit cijfer is herdrukt met toestemming van de American Thoracic Society-13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : FcγR - en CR-gemedieerde fagocytose. (A) representatieve beelden van opsonized schapen rode bloedcellen (SRBCs) fagocytose door MH-S cellen. De pijlen wijzen naar bepaalde SRBCs. De schaal bar = 25 µm. (B) Quantification van de SRBCs fagocytose door cellen van de MH-S overexpressing TRIM72 (TRIM72OE) in aanwezigheid van (FcγR-gemedieerde fagocytose) IgG of IgM (CR-gemedieerde fagocytose); n = 6 voor elke groep, *p < 0,05 en **p < 0.005 vergeleken met WT controle. (C) representatieve beelden van Alexa Fluor-488-geconjugeerd zymosan deeltje inname door primaire AMs geïsoleerd van WT of TRIM72KO muizen. De pijlen in het deelvenster A en B geven zymosan + cellen. De schaal bar = 50 µm. (D) statistische resultaten van het percentage van zymosan-bevattende AMs; n = 3 voor elke groep, p > 0,05. Dit cijfer is herdrukt met toestemming van de American Thoracic Society-13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: In vivo fagocytose van P. aeruginosa GFP. (A) representatieve beelden bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF) cel cytospin dia's uit WT TRIM72KO muizen en 1 h na de injectie van P. aeruginosa GFP. Kwik-Diff kleuring identificeert AMs (grote, ronde cellen) en neutrofielen; GFP identificeert fagocytische cellen (witte pijlen) en GFP+ differentiële interferentie contrast (DIC) identificeert verinnerlijkte GFP bacteriën (zwarte pijlen) in am. De schaal balken = 50 µm. (B) kwantificering van het percentage van AMs en neutrofielen in BALF van WT TRIM72KO muizen en 1 h na de injectie van P. aeruginosa . (C) kwantificering van het percentage voor fagocytische AMs in WT en TRIM72KO muizen; n = 3 voor elke groep, *p < 0.05. De gegevens worden gepresenteerd zoals (± SEM) betekenen. Dit cijfer is herdrukt met toestemming van de American Thoracic Society-13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Goedkeuring van de In vivo bacteriën met behulp van P. aeruginosa (P.A.). (A) het percentage van het verlies van het gewicht (BW) van het lichaam van naïeve WT en TRIM72KO muizen na de eerste intraperitoneale injectie van 2.5 x 105 CFU/mL PAO1 (een klinische isolaat van P. aeruginosa); n = 13 voor WT (zwarte vierkantjes), n = 8 voor TRIM72KO (rode cirkels), *p < 0,05, **p < 0.005 vergeleken met PM (B) het percentage van overleven op dag 2 na de 3 x 107 CFU/mL P. aeruginosa intraperitoneale injectie; n = 10 voor WT (effen zwarte cirkels) en TRIM72KO (effen rode vierkantjes), *p < 0.05 voor WT versus TRIM72KO groepen. (C) A scatterplot van de gehele-lung bacteriële last op dag 2 van de P. aeruginosa injectie in WT en TRIM72KO. De grijze stippellijn geeft de ingespoten bacteriële dosis; ↑ aanwijst muizen die gestorven zijn. Voor WT versus TRIM72KO groepen, p < 0.05. Dit cijfer is herdrukt met toestemming van de American Thoracic Society-13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tijdens het uitvoeren van een gas uitwisseling functie, confronteert de Long hardnekkig lichaamsvreemde deeltjes, pathogenen en allergenen. AMs zijn de eerste verdedigingslinie uit hoofde van hun belangrijkste functie, namelijk fagocytose. AMs ook coördineren met andere immuuncellen in het vernietigen van de ziekteverwekkers en in de resolutie van de ontsteking. Hier, beschreven we methoden voor de beoordeling van specifiek fagocytose door AMs geïsoleerd van de muis Long. Het protocol gepresenteerd in dit manuscript verklaart een gedetailleerde studie van fagocytose zowel in vivo en in vitro, die ook kan worden gebruikt om de macrofaag functie en bacteriële mijnen in andere organen te studeren.

De beschreven in vitro fagocytose berust op de eenvoudige gedachte van serum-behandelde FITC kralen aan het broeden of opsonized SRBCs met gekweekte AMs tot fagocytose. Deze methode omvat stappen van uitgebreide wassen en de lysis van nonphagocytized RBC te verminderen van de achtergrond. Wees voorzichtig niet om de zelfklevend AMs los te maken. De wassen stap waarbij ACK lysis van de oplossing moet gebeuren binnen 1 min, als een langere wassen tijd leidt tot de lysis van de macrofagen.

Bovendien, in de beeldvorming analyse gekenmerkt we zowel het percentage phagocytizing cellen en de phagocytic-index te krijgen een uitgebreid overzicht van de functie van de fagocytose AM. Wij hebben ook de methode om te differentiëren tussen PRR-, FcγR- en CR-gemedieerde fagocytose in de lymfkliertest macrofaag MH-S cellijn uitgelegd. In combinatie met genetische modulatie is deze stap handig wanneer probeert te krijgen mechanistische inzichten over de specifieke fagocytose traject dat werd beïnvloed door de doelgroep genetische manipulatie.

Eerdere rapporten beschreven methoden om te evalueren van de bacteriële opname; de bekendste methode is de gentamicine bescherming assay14. In het protocol hier gepresenteerd, hebben we ook een beeldvorming methode voor het meten van in vivo fagocytose aangetoond. Er zijn een paar belangrijke factoren, waardoor deze methode beter in vergelijking met de eerder gepubliceerde methoden. De hier beschreven methode omvat een intratracheale injectie van P. aeruginosa GFP gevolgd door differentiële kleuring van BALF cellen. Deze methode wijst het gebruik van fluorescerend bacteriën, die helpt bij het identificeren van de geconsumeerde bacteriën binnen de fagocyten. De differentiële kleuring van BALF cellen helpt bovendien specifiek onderscheid de fagocytische capaciteit van AMs uit andere immune cellen in de omgeving van in vivo en evalueren van de relatieve bijdrage van verschillende fagocyten wissen de bacterietelling ladingen uit de longen. Een kleine beperking van deze methode is dat er een zorgvuldige intratracheale administratie om te voorkomen dat de variabiliteit tussen de muizen.

Verder, we hebben uitgelegd de methode om vast te stellen van een goedkeuring van de bacteriën P. aeruginosa bij muizen in de context van longontsteking. Karakteriseren deze methode, wij het lichaam gewichtsverlies en de sterfte na de toediening van de intratracheale van P. aeruginosa bepaald en gebruikt een kwantitatieve test om te bepalen van de last van de bacteriën Long. Sterfte is een belangrijke parameter voor het beoordelen van de uitgebreide immuunrespons van het lichaam. We Long monsters van dit experiment gebruikt ter beoordeling van bacteriële belasting. Bacteriële belasting kan echter ook worden bepaald uit Long monsters geoogst binnen 48u na van de niet-letale dosis van bacteriële injectie. Het succes van de bepaling zal worden bepaald door een standaardisatie van de timing van de injectie, de kwaliteit van het pathogene agens en de dosis van injectie, en het optimaliseren van een homogenisering-methode die volledig de longen verstoort zonder verbreking van de bacteriële celmembraan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk wordt ondersteund door de toekenning van R01HL116826 aan X. Zhao.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18-G Needle Nipro Medical  CI+1832-2C Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF) Sigma-Aldrich D17106 Molecular Biology grade
70% Ethanol Decon Labs Inc. 18C27B Analytical grade
96-well plate Corning 3603 Cell Biology grade
ACK lysis buffer Life Technologies A10492 Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle Thermofisher Scientific Z23373 Molecular Biology grade
C5 deficient serum  Sigma-Aldrich C1163 Biochemical reagent
Centrifuge Labnet International C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher Scientific A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media Gibco 11995-065 Cell Biology grade
FBS Atlanta Biologicals S11550 Cell Biology grade
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Flow Jo Software FlowJo, LLC
Forceps Dumont 0508-SS/45-PS-1 Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads Sigma-Aldrich L4530 Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa ATCC 101045GFP Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish MatTek Corp. P35G-0.170-14-C Cell Biology grade
High-Pressure Syringe Penn-Century FMJ-250 Suitable for laboratory animal use
Homogenizer Omni International TH-01
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope Olympus IX73
Ketamine Hydrochloride Hospira CA-2904 Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains Thermofisher Scientific 9990700 Cell Biology grade
LB Agar Fisher Scientific BP1425 Molecular Biology grade
LB Broth Fisher Scientific BP1427 Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer Penn-Century IA-1C Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Reagent grade
PBS Gibco 20012-027 Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG  MP Biomedicals 55806 Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM  Cedarline Laboratories CL9000-M Suitable for immuno-assays
Scissors Miltex 5-2 Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope Penn-Century LS-2 Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) BioRad 1610301 Analytical grade
Spring Scissors (Med) Fine Science Tools 15012-12 Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small) Fine Science Tools 91500-09 Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)  MP Biomedicals 55876 Washed, preserved SRBCs
Urea Sigma-Aldrich U5378 Molecular Biology grade
Xylazine  Akorn Animal Health 59399-110-20 Pharmaceutical grade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
  2. Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
  3. Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
  4. Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
  5. Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
  6. Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
  7. Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
  8. Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
  9. Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
  10. Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
  11. Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).
  12. He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
  13. Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
  14. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  15. Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
  16. Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
  17. Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).

Tags

Immunologie en infecties probleem 145 alveolaire macrofagen fagocytose goedkeuring van in vitro in vivo bacteriële longontsteking
Alveolaire macrofaag fagocytose en bacteriën mijnen in muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nagre, N., Cong, X., Pearson, A. C., More

Nagre, N., Cong, X., Pearson, A. C., Zhao, X. Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice. J. Vis. Exp. (145), e59088, doi:10.3791/59088 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter