Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a quantificação de alvo sequencial e não específico de análise de compostos fluorados na água por espectrometria de massa. Esta metodologia proporciona níveis quantitativos de compostos conhecidos fluorochemical e identifica produtos químicos desconhecidos em amostras relacionadas com estimativas semi-quantitativa de sua abundância.
Abstract
Histórico e emergentes por- e substâncias polyfluoroalkyl (PFASs) tem atraído interesse significativo das agências públicas e o governo do local aos níveis federais. A evolução contínua de químicas PFAS apresenta um desafio para o monitoramento ambiental, onde o desenvolvimento contínuo dos métodos direcionados necessariamente defasagens a descoberta de novos compostos químicos. Há uma necessidade, portanto, ter metodologias prospectivas que podem detectar compostos emergentes e inesperados, monitorar estas espécies ao longo do tempo e resolver detalhes de sua estrutura química para permitir futuras funcionam na saúde humana. Para este fim, não específico de análise por espectrometria de massa de alta resolução oferece uma abordagem de deteção de base ampla que pode ser combinada com quase qualquer esquema de preparação de amostra e fornece recursos significativos para identificação de compostos após a detecção. Aqui, descrevemos um método de concentração de amostra de extração de fase sólida (SPE) com base ajustado para cadeia mais curta e mais químicos PFAS hidrofílicos, tais como por ácidos de éter fluorados e perfluorooctanossulfonatos e descrever a análise de amostras preparadas desta forma em modos de alvo e não específico. Alvo métodos fornecem quantificação superior quando normas de referência estão disponíveis, mas são intrinsecamente limitadas aos compostos esperados ao realizar a análise. Em contraste, uma abordagem não-alvo pode identificar a presença de compostos inesperados e fornecer algumas informações sobre sua estrutura química. Informações sobre características químicas podem ser usadas para correlacionar compostos por locais de amostra e rastrear abundância e ocorrência ao longo do tempo.
Introduction
A classe de por- e substâncias polyfluoroalkyl (PFASs) são poluentes orgânicos persistentes com preocupação significativa da saúde pública. O ácido de compostos específicos perfluorooctanoico (PFOA) e perfluorooctanesulfonate (PFOS) têm níveis de Consultivo de saúde água potável definidos pelo EPA1,2 e sua grande produção de E.U. cessou na década de 20003,4 . Para obter uma compreensão significativa para as propriedades de PFAS materiais no produto têxtil e consumidor fabricação de esferas, centenas, se não milhares, de alternativas químicas PFAS foram desenvolvidos para preencher nichos de produtos, incluindo substituições para o preterido compostos5,6,7,8. Há um curso preciso monitorar os níveis ambientais de ácidos carboxílicos de cadeia reta perfluorados e sulfonates tais PFOS e PFOA sua série homóloga relacionado, mas emergentes compostos químicos não são cobertos pelo métodos estabelecidos, tais como EPA Método 5379 e frequentemente falta de padrões analíticos para análise de alvo tradicional. A intenção do presente protocolo, portanto, é duplo. Ele fornece um caminho para a análise de LC-MS/MS alvo de espécies fluorochemical em água, desde que existam padrões analíticos e detalha a integração perfeita de uma abordagem não-alvo, de alta resolução espectrometria de massa base para análise de dados Isso permite a detecção de compostos desconhecidos ou inesperados nas mesmas amostras.
Extração de fase sólida (SPE) é uma técnica estabelecida para a limpeza de amostra e a concentração com aplicações em muitos analitos e amostra matrizes10,11. Para a análise PFAS, múltiplas fases de retentivas sólidas, incluindo não-polares, acrescida polar, e colunas de troca iônica têm sido utilizados para diferentes extensões para subclasses de fluorados espécies em uma grande variedade de matrizes9,12, 13,14,15,16. Avanços na análise de amostras SPE usando configurações on-line extremamente aumentam a taxa de transferência da abordagem e melhorar a reprodutibilidade de manipulação de amostra, mas o processo fundamental permanece consistente17. Também foram feitos alguns esforços para remover a concentração off-line da SPE usando injeções de grande volume, mas estes requerem modificações para a cromatografia que colocá-los fora da esfera de análise casual18,19 . Nossa análise de amostra usa uma fase retentiva de troca (cera) polímeros ânion fraco completamente separar materiais ácidos PFAS os contaminantes orgânicos tradicionais e alcançar fatores de concentração de amostra substancial. Esta fase de cera é importante para capturar os ácidos perfluorados de cadeia curta como o sulfonato de perfluorobutane (PFBS) ou éteres perfluorados tais como ácido de dímero de óxido de hexafluoropropylene (HFPO-DA), que são mais polares do que o perfluorados legado de cadeia mais longo espécie de20,21. Como tem havido uma mudança significativa no sentido de cadeias mais curtas fluorados e inclusão de éter em recente PFAS química5, esta selecção de fase permite a recuperação mais completa de novos compostos para análise de MS.
Quantificação de LC-MS/MS alvo usando autenticado padrões e isótopo estável rotulado padrões internos fornece um nível incomparável de especificidade e sensibilidade para a análise quantitativa. Enquanto essa abordagem é desejável em muitas situações, é impraticável para todo-demasiado-comum situações em análise. Alvo de abordagens funcionam apenas para espécies que são esperados na amostra, e quais métodos foram estabelecidos anteriormente. Para compostos novos e emergentes, esta abordagem é incapaz de detectar até mesmo espécies que possam ser de interesse, independentemente da sua química ou concentração, e espectrómetros de massa de baixa resolução são quase incapazes de fornecer informações suficientes para fazer inequívocas atribuições químicas de compostos desconhecidos. Consequentemente, o campo de análise não específico tenha surgido, alavancando o poder de espectrómetros de massa modernos de alta resolução para analisar amostras sem uma hipótese pressupunha e atribuir retroactivamente produtos químicos para características detectáveis na amostra. Esta abordagem tem sido amplamente utilizada nos campos da biologia22,23,24 e ciência ambiental25,26,27 em numerosas classes de produtos químicos. Produtos químicos perfluorados são particularmente simples de identificar esse método devido a seus padrões massa espectrais, e centenas de compostos têm sido descritas em apenas o passado poucos anos5,28.
O protocolo discutido aqui destina-se a alinhar a quantificação de LC-MS/MS PFAS alvo com a necessidade de identificar e monitorar semi-quantitativamente emergentes compostos de interesse. A fase SPE seleção e técnicas de preparação de amostra se destinam a garantir a captura dos ácidos PFAS emergentes mais hidrófilas da água e pode ser mais adequado para a mais longa cadeia polimérica espécies e não-iônicos. Além disso, os dados gerados pela análise não específico serão densos e de alta dimensionalidade, que exige o uso de software de análise de dados. Tais pacotes de software são frequentemente fornecedor específico e exigem modificação para operar entre plataformas de instrumento. Sempre que possível, o processo de análise tem sido descrito de forma genérica e alternativas de fonte aberta/freeware são referenciadas, mas a eficiência e a precisão de qualquer abordagem de software devem ser avaliados numa base individual.
Protocol
1. coleta de amostras de água
- Preparação de estoques padrão PFAS
- Prepare uma mistura padrão de PFAS em metanol contendo qualquer alvo compostos de interesse (por exemplo, PFOA, PFOS, HFPO-DA) a 1 ng / µ l. Esta é a mistura de PFAS nativo. As misturas preparadas comercialmente também estão disponíveis (ou seja, PFAC Mix A e B Mix).
- Prepare uma mistura padrão contendo o isótopo estável correspondente rotulado compostos PFAS (SIL) (por exemplo, 13C4- PFOA, 13C8- PFOS, 13C3- HFPO-DA) no 1 ng / µ l. Esta é a mistura de PFAS é. As misturas preparadas comercialmente também estão disponíveis (ou seja, mistura de MPAFC A e B Mix).
Nota: Se uma versão SIL de PFAS o alvo não estiver disponível, um substituto com comprimento de cadeia e estrutura semelhante pode ser usado (por exemplo, 13C2- PFHxA para HFPO-DA)
- Preparação de campo em branco (FB), amostras de Spike em branco (SB)
- Preencher dois, polipropileno limpa de alta densidade (PEAD) ou garrafas de polipropileno (PP), com 1.000 mL de laboratório deionizada (DI), conhecido por ser livre de PFAS.
Atenção: Materiais PFAS frequentemente têm indefinida de toxicidade e/ou carcinogenicidade. Deve ter cuidado para evitar a exposição oral ou pele aos padrões ou soluções conservadas em estoque. - Adicione uma quantidade da mistura padrão de PFAS para uma das garrafas em uma concentração final equivalente para as concentrações de amostra esperado (por exemplo, 100 ng/L). Este é o Spike em branco (SB).
- Adicione 5 mL de ácido nítrico em 35% conservante para o Spike em branco.
- Transporte tanto amostra SB e o bilirrrubina campo em branco para o local de amostragem como controles.
- Preencher dois, polipropileno limpa de alta densidade (PEAD) ou garrafas de polipropileno (PP), com 1.000 mL de laboratório deionizada (DI), conhecido por ser livre de PFAS.
- Amostragem de campo
Nota: A coletor de amostra deve usar luvas de nitrilo e amostra de fluxo sistemas sempre que possível. Amostras de torneira devem fluir e equilibrar-se antes da amostragem (2-3 min).- Colete 500-1.000 mL de água no local do campo em um frasco limpo de PEAD ou PP.
- Adicione 5 mL de ácido nítrico em 35% conservante para garrafas de amostra e o campo em branco.
Cuidado: o ácido nítrico é corrosivo e um oxidizer forte
2. extração da amostra
Nota: PFAS são persistentes e ubíquos. Garantir que todos os solventes são de classe a mais elevada e foram analisados por contaminação de PFAS nível baixa. Enxague cuidadosamente todos os equipamentos de laboratório utilizados na elaboração de normas antes de preparar as amostras e espaços em branco.
- Pré-tratamento da amostra
- Despeje um separado de cada amostra, previamente limpo 1L HDPE graduado cilindro e registro o volume exato.
- Adicionar 10 mL de metanol no frasco de amostra esvaziado, tampá-lo e agitar bem para enxaguar PFAS adsorvida no interior da garrafa.
- Volte a amostra de água medidos no frasco enxaguado com o enxágue metanólica.
- Curva padrão para quantificação
- Oito, encher garrafas de PEAD/PP de L 1 com água livre de PFAS.
- Selecione oito concentrações uniformemente espaçadas, cobrindo o intervalo desejado de quantificação. Por exemplo: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750 e 1.000 ng/L para uma escala de 10-1.000 ng/L.
- Adicionar uma quantidade de mistura PFAS nativo para cada garrafa para produzir as concentrações finais de PFAS em 2.2.2 (por exemplo, 100 µ l PFAS Mix A para 1L de água DI = 100 ng/L).
- Adição de padrão interna
Nota: A adição de isótopo estável rotulado de padrão interno (IS) é necessária somente se resultados quantitativos são desejados além de análise não específico.- Adicione a mistura de PFAS é de cada amostra em uma concentração de aproximação do ponto médio da curva de calibração (por exemplo, 250 µ l de mistura é PFAS = 250 ng/L)
- Filtração
- Filtre amostras através de filtros de fibra de vidro GF/A (47 mm, tamanho de poro 1,6 µm) sob vácuo suave para um balão de vácuo HDPE 1L previamente limpo.
- Se partículas permanece na garrafa, enxágue com água deionizada adicional no filtro. Retorne a água filtrada para o frasco da amostra ou uma nova embalagem para extração de fase sólida.
- Extração de fase sólida (SPE)
Nota: Concentração de cartucho descrita aqui usa uma bomba de pistão de fluxo constante. Métodos alternativos de concentração usando um distribuidor vácuo20 ou usando uma configuração de17 SPE-LC-MS on-line são possíveis mas não discutidas.- Condição de um cartucho de troca (cera) ânion fraco com 25 mL de metanol.
- Condição do cartucho de cera com um adicional 25 mL de água desionizada.
- Bomba posição desenhar tubulação em garrafas de amostra filtrada e rotular os cartuchos SPE com nomes correspondentes da amostra.
- Bomba de 500 mL de água de amostra através do cartucho em uma taxa de fluxo constante de 10 mL/min (total de 500 mL), descartando o escoamento de líquido para desperdiçar.
Nota: Volumes maiores ou menores podem ser concentrados dependendo da concentração esperada de amostra. - Remova o cartucho da bomba de pistão para a eluição.
Nota: Se concentrando amostras adicionais usando a mesma bomba, a bomba de pistão deve ser lavada com 25 mL de metanol antes de instalar o próximo cartucho para equilibração. - Transferir o cartucho SPE para um distribuidor de vácuo e equipar com reservatório de vidro externo.
- Liberar o cartucho SPE com 4 mL de 25mm, tampão de acetato de sódio 4.0 pH sob vácuo suave. Descarte a fluir. Cartucho de SPE lavar com 4 mL de metanol neutro.
Nota: Neutro de lava fração pode ser coletada se específico não iônicos polares analitos são esperados. Caso contrário, descartar resíduos - Coloque um tubo de centrifugação de polipropileno de 15 mL por baixo de cada cartucho SPE para coletar o eluente. Eluir a amostra com 4 mL de hidróxido de amônio 0,1% em metanol.
- Retire o tubo de eluição e reduzir o volume de eluato de 500-1.000 µ l por evaporação sob fluxo de nitrogênio seco num banho de água a temperatura ligeiramente elevada (40 ° C).
- Concentrado amostra extractos podem ser armazenados antes da análise à temperatura ambiente.
- Quantificação de LC-MS/MS alvo
- Diluir 100 µ l de amostra extrair com 300 µ l de tampão de acetato de amônio 2 mM em um frasco de amostra HPLC.
- Calibrar e equilibrar um sistemas HPLC e MS de acordo com as instruções do fabricante.
Nota: Fundo PFAS são comumente detectados devido ao uso de componentes fluoropolímero da maioria dos sistemas de LC e em septos de frasco de amostra. Confirme que os níveis detectáveis lacunas é insignificante antes do uso. Modificação do sistema de LC para substituir componentes de Teflon sugere-se sempre que possível. O uso de uma coluna analítica de "hold-up" adjacente à válvula misturadora de LC também é sugerida29. - Prepare uma lista de trabalho analítica consistindo de curva padrão, exemplos e um replicar adicional da curva padrão para avaliar deriva instrumental na fuga. Uma lista de trabalho de exemplo é mostrada na tabela 1.
- Analise as amostras com LC e MS métodos estabelecidos para a compound(s) alvo de interesse. O gradiente de LC de exemplo é mostrado na tabela 2 e parâmetros de método de MS são mostrados na tabela 3 e tabela 4. Mais discussão detalhada pode ser encontrado no McCord et al.21.
- Gera uma curva padrão de amostras-padrão usando a relação de área do pico do analito para o padrão interno versus a concentração do analito. Gere uma fórmula de regressão quadrática com 1 / x ponderação para concentração previsão9.
- Dosar os analitos alvo em cada amostra utilizando as curvas padrão preparadas e relação de área (área padrão / área) para cada medição.
- Se a concentração excede o intervalo de calibração, dilua a amostra original com água DI cravada com a concentração adequada de IS e extrair novamente para trazer a concentração para o intervalo adequado.
- Coleta de dados non-geográficos de LC-MS/MS
- Diluir 100 µ l de amostra extrair com 300 µ l de tampão de acetato de amônio 2 mM em um frasco de amostra HPLC.
- Calibrar e equilibrar um HPLC e MS de alta resolução, de acordo com as instruções do fabricante.
- Prepare uma lista de trabalho analítica como 2.6.2.
- Usando o software do instrumento, colete dados de LC-MS, com uma ampla varredura MS1 no modo dependente de dados para coletar gradiente MS/MS. exemplo LC na tabela 5. Discussão dos ajustes do instrumento pode ser encontrado em Strynar et al.30 e Newton et al31.
Nota: Para melhor MS/MS análise de dados dependentes de qualidade pode efectuar com uma lista de íon preferencial de um subconjunto dos recursos remanescentes após o processamento de dados em 2.8.1-2.8.8.
- Processamento de dados não-alvo
Nota: A análise de dados pode ser executada com uma ampla gama de software, e esses métodos não refletem o método único, ou melhor, para um conjunto de dados arbitrário. Sempre que possível, etapas fornecem uma descrição genérica que pode ser realizada no software alternativo. Processamento dos dados do exemplo utilizados neste manuscrito foi realizado usando software específico do fornecedor (Software 1 e 2 do Software), conforme detalhado em Newton et al.31.- Realizar a extração de características químicas, usando um dos vários software open source software pacotes32,33 ou fornecedor para identificar massas monoisotópico, tempos de retenção e áreas de pico integrado de química molecular características.
- Em 1 de Software, selecione Adicionar ou remover arquivos de exemplo > Adicionar arquivos e selecione os dados brutos do experimento não específico e, em seguida, bateu Okey.
- No Software 1 Selecione lote recursiva extração > método aberto... para carregar um método preestabelecido, ou editar manualmente as configurações de software. Profinder configurações para extração de características são encontradas na tabela 6.
- Em Software 1, após a extração do recurso, selecione arquivo > exportar como CSV..., arquivo > exportar como CEF..., ou arquivo > exportar como PFA... para processamento adicional. Arquivos da CEF são assumidos para o restante da descrição.
- Em 2 de Software (MPP) criar uma nova experiência com tipo não identificado e o tipo de fluxo de trabalho Assistente de importação de dados e clique em Okey.
- No MPP Selecione arquivos de dados e localize os resultados de Software 1 exportados (CEF ou PFA) para importar; clique em Avançar até que apareçam as opções de Alinhamento de parâmetro .
- No MPP, defina os valores de alinhamento composto para 0,0 (alinhamento já foi executado na extração de características de Software 1, etapa 2.8.1.2) e clique em avançar através dos passos até terminar está disponível.
- Filtre as identificações baseadas na reprodutibilidade analítica. Onde várias amostras estão disponíveis, características devem estar presentes em > 80% do indivíduo Replica e ter um analítico coeficiente de variação (CV) de < 30%
- No selecione MPP Experimental Setup > Agrupamento de experiência e atribuir a cada arquivo raw um grupo correspondente a sua amostra de origem (ou seja, repetições da mesma fonte devem ser do mesmo grupo). Vários grupos podem ser criados correspondentes a variáveis aninhadas (por exemplo, instrumental vs técnicas repetições).
- No selecione MPP Experimental Setup > interpretação criar em seguida, selecione o parâmetro de experimento (i.e., grupo) e clique em Next até terminar está disponível. Isto irá criar uma categoria que futuro filtragem pode operar em.
- No selecione MPP controle de qualidade > filtro de frequência. Definir lista de entidade para Todas as entidades e a interpretação para a amostra Group(non-averaged) criado em 2.8.2.2, em seguida, bateu na próxima.
- Para parâmetros de entrada, defina a retenção da entidade em 80% da amostra pelo menos uma condição e clique em Avançar até terminar está disponível. Nomeie a lista de características de filtrado de frequência
- No selecione MPP controle de qualidade > filtro sobre a variabilidade da amostra. Definir a lista de entidade para as características de filtrado de frequência de 2.8.2.4 e a interpretação de Group(non-averaged), em seguida, bateu próximo.
- Selecione o botão de rádio para Dados brutos e o intervalo de interesse para o coeficiente de variação < 30%. Clique em próxima > terminar e salvar lista como características de filtrado de CV.
- Remover recursos, onde não há amostras tem significativamente maior (> 3 dobra) abundância do que a amostra de campo em branco (FB).
- No selecione MPP análise > dobre mudança. Definir lista de entidade para Características de filtrado de CV e a interpretação para a amostra de que grupo, em seguida, bateu em seguida. Selecione a opção de mudança de dobra de todos contra a condição única e Selecionar condição FB ou o que quer que fosse o nome do grupo para a amostra processada em branco.
- Na tela seguinte, defina o corte dobra-mudança para 3.0 e clicar para o fim dos prompts. Salve a lista como uma Lista filtrada de FC.
- Executar comparações binárias de amostras individuais de interesse contra uma amostra de fundo apropriado (por exemplo, montante vs a jusante de um ponto de origem) para determinar a dobra-alterações para as características químicas individuais.
- No selecione MPP análise > filtro na trama do vulcão. Defina a lista de entidade a Lista filtrada de FC e a interpretação de grupo.
- Para a condição de dobra-mudança par escolhe duas amostras para comparação (por exemplo, emparelhada upstream e downstream amostra) e selecione testar Unpaired de Mann-Whitney.
- Para a análise preliminar, não selecione um valor para vários teste correção na tela seguinte, clicar para a trama do resultado.
- Na tela de resultados, selecione um corte dobra-mudança de 3.0 e um corte de p-valor de 0.1. Em seguida, terminar e exportar a lista como Resultados preliminares.
- Para cada recurso restante após a filtragem, gera previsto formula(s) química do composto espectro de massa e massa exata.
- No MPP, selecione interpretação de resultados > identificação de IDBrowser e a lista de Resultados preliminares da entidade.
- No IDBrowser selecione a identificar todos os compostos usando gerador de fórmula molecular (MFG) como o método de identificação.
- Nas opções de fórmula gerar adicionar F para a coluna de elementos e defina o máximo de 50 e, em seguida, selecione concluir. Após geração de fórmula, selecione salvar e retornar para retornar a MPP.
- No MPP, clique o filtrado e MFG correspondido Entity List e selecione Exportar lista. Salve os resultados.
- Examinar a massa monoisotópico de espécies na lista reduzida característica química significativa para aqueles que contêm defeitos massa indicativos de fluoração; Veja o tipo e Fiehn34.
- Observe a série química contendo motivos comuns de polyfluorination (CF.2 (m/z 49.9968), CF2O (m/z 65.9917), CH2CF2O (m/z 80.0074), etc.) usando um algoritmo de trama ou software de defeito de massa; consulte a seção de discussão, Liu et al.17, Loos et al.35 e Dimzon et al.36.
- Pesquisa fórmulas químicas previstas ou massas neutras contra o banco de dados do painel de EPA química e/ou outros bancos de dados para retornar o potenciais estruturas químicas.
- Abra a ferramenta de pesquisa de lote do EPA Comptox produtos químicos Dashboard (https://comptox.epa.gov/dashboard/dsstoxdb/batch_search) e cole a lista de identificadores (fórmulas ou massas) na caixa de identificador, depois de selecionar o tipo de identificador (i.e., MS-pronto Fórmula ou massa monoisotópico).
- Selecione Download dados químicos... e também selecionar qualquer dados de física/química/toxicologia desejados para potenciais partidas na lista suspensa.
- Usando dados de referência disponíveis e intuição química, remover improváveis partidas da lista potencial de estrutura química para cada fórmula baseada na viabilidade devido à estabilidade química, propriedades físicas, tais como ionizability ou hidrofobicidade, a presença de fabricação de produtos químicos de fontes próximas, etc. Na ausência de dados adicionais, viabilidade espectral pode ser classificada como puramente com base na prevalência de literatura; Ver McEachran et al37.
- Confirmar a estruturas usando padrões disponíveis e/ou alvo de alta resolução MS/MS de fragmentos contra espectros de bancos de dados, em silico espectros teóricos ou curadoria manual de correspondência.
- Realizar a extração de características químicas, usando um dos vários software open source software pacotes32,33 ou fornecedor para identificar massas monoisotópico, tempos de retenção e áreas de pico integrado de química molecular características.
Representative Results
Resultados quantitativos de LC-MS/MS são na forma de íon-cromatogramas para o cromatograma de íons totais (TIC) e os cromatogramas de íons extraídos (EIC) das transições químicos específicos para produtos químicos medidos (Figura 1). A área do pico integrado de uma transição de química está relacionada com a abundância de compostos e pode ser usada para calcular a concentração exacta utilizando uma curva de calibração normalizada para um padrão interno (Figura 2). Plana ou baixa resposta dos analitos individuais indica que o intervalo de calibração está fora do intervalo linear do espectrômetro de massa, ou que o instrumento necessita de ajuste/calibração. Pobre precisão de repetições indica um problema com a injeção de amostra ou cromatografia inconsistente que requer a modificação de parâmetros de LC.
Análise não-alvo, usando uma varredura completa do MS1 produz um TIC para amostras (Figura 3), que permite a geração ad hoc de EICs de íons individuais (Figura 4). Qualquer ponto determinado momento cromatográfica contém sinais para espécies químicas e quando usando um espectrômetro de massa de alta resolução, a impressão digital isotópica do composto. Identificar compostos a partir da digitalização de MS1 é realizada por meio de programação por um algoritmo de pico-colheita usando uma das várias abordagens38,39,40. Colheita de pico produz características químicas com uma massa exata medida e tempo de retenção cromatográfica, bem como o espectro de massa do íon e a área do pico cromatográfico. Normalmente, essas informações são armazenadas em um formato de banco de dados digital para filtragem e tratamento subsequente, mas a natureza dos dados aninhada e interligada pode ser entendida conceitualmente (Figura 5).
A lista de recursos é filtrada para encontrar com um dos vários critérios a ser selecionado para investigação futura de compostos. A primeira e mais simples é a filtragem por defeito de massa (a diferença entre a massa exata de um recurso e sua massa nominal). PFAS compostos têm defeitos de massa negativos (Figura 6) devido à sua preponderância dos átomos de flúor e compostos perfluorados tem defeitos de massa positivos, mas substancialmente menores do que materiais orgânicos homólogas31,34 . Um segundo método de filtragem de etapa é identificar a série homóloga unidades comuns a espécie PFAS, tais como CF2 ou CF2O. identificar estas pode ser feito usando Kendrick massa defeito parcelas17,36, ou pacotes de software, tais como do R nontarget pacote35 (Figura 7).
Após a filtragem, atribuição de identidade química sobre a lista dos altamente diferencialmente observada e/ou provisoriamente por / perfluorados espécie pode começar. Massa exata fornece uma lista relativamente pequena de fórmulas químicas potenciais para correspondência, mas é insuficiente para identificação sem a adição de espectrais correspondentes ao padrão de isótopo do espectro de massa41. De alta resolução MS1 dados, uma ou mais fórmulas químicas putativos são comparadas com a digital isotópica de espectro de massa e marcou (Figura 8). Fórmulas para correspondência podem ser geradas usando ab initio um pool definido de átomos ou pode ser proveniente de uma combinação de literatura relatados compostos e o conteúdo de um ou mais bancos de dados. Os anfitriões nos EPA química Dashboard (https://comptox.epa.gov/dashboard/) uma lista constantemente atualizada de PFAS compostos identificados pela Agência, bem como listas compilada por outras organizações, como o de NORMAN Network42.
Fórmulas químicas podem ser confirmadas, e algumas informações estruturais podem ser recolhidas dos espectros de MS/MS (Figura 9). Estruturas do candidato estão disponíveis a partir de grandes químicos bancos de dados tais como o EPA química painel de instrumentos, Pubchem, o registo CAS, etc. Espectros previstos podem ser gerados ou adquiriram usando uma variedade de programas de fragmentação e atribuído,43 ou espectros de MS/MS podem ser interpretados manualmente.
Uma matriz de dados de exemplo está disponível na informação suplementar, contendo uma matriz de todo recurso de dez amostras (5 contra a corrente, 5 a jusante) coletado montante e a jusante de uma fonte de ponto fluorochemical. Cada linha representa uma característica química com tempo de retenção de associados, massa neutra, espectro de massa e abundância cru para cada amostra. (Tabela suplementar, folha 1). Inicial de filtragem (Tabela suplementar, folha 2) por defeito de massa negativo e significância estatística em um teste-t não pareado entre montante e jusante reduz o número de características químicas "interessantes" para ~ 120. Previu a fórmula química foram Obtida de Agilent IDBrowser e procurou contra o Dashboard de produtos químicos de Comptox EPA, que retornou a possíveis correspondências (Tabela suplementar, folha 3). O "top-hit" para cada fórmula química com base em fontes de dados37 foi atribuído (Tabela suplementar, folha 4). Observe-se que mais de metade dos recursos restantes não tem jogos de alta qualidade. Características identificadas com nenhuma correspondência pode ser o resultado da formação de código-fonte de fragmentação/aduto, atribuição de fórmula pobre, ou a identificação de PFASs não foi encontrado no banco de dados de origem. Interpretação de espectros de cru para validar as atribuições está além do escopo deste manuscrito mas mais informações podem ser encontradas em obras citadas15,30,31,44, 45.
| ID | Nome da amostra | Tipo de amostra | STD Conc | Tubo de ensaio | Método de LC | Método de MS |
| 1 | DB_001 | Em branco | 1:, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 2 | DB_002 | Em branco | 1:, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 3 | DB_003 | Em branco | 1:, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 4 | DB_004 | Em branco | 1:, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 5 | DB_005 | Em branco | 1:, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 6 | FB | Em branco | 1, 2: A | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 7 | 10 std | Padrão | 10 | 1, 3: A | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 8 | 25 std | Padrão | 25 | 1:, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 9 | 50 std | Padrão | 50 | 1:, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 10 | 100 std | Padrão | 100 | 1:, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 11 | 250 std | Padrão | 250 | 1:, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 12 | 500 std | Padrão | 500 | 1:, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 13 | 750 std | Padrão | 750 | 1:B, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 14 | 1000 std | Padrão | 1000 | 1:B, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 15 | DB_006 | Em branco | 1:B, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 16 | SB_DUP1 | Analito | 1:B, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 17 | SB_DUP2 | Analito | 1:B, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 18 | SW Site 03 | Analito | 1:B, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 19 | SW Site 16 | Analito | 1:B, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 20 | Site de SW 30 | Analito | 1:B, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 21 | DB_007 | Analito | 1: C, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 22 | Site de SW 19 | Analito | 1: C, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 23 | SW Site 48 | Analito | 1: C, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 24 | SW Site 49 | Analito | 1: C, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 25 | Site de SW 05 | Analito | 1: C, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 26 | SW Site 47 | Em branco | 1: C, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 27 | DB_008 | Analito | 1: C, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 28 | 19_DUP Site de SW | Analito | 1: C, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 29 | Site de SW 20 | Analito | 1: D, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 30 | Site de SW 21 | Analito | 1: D, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 31 | SW Site 46 | Analito | 1: D, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 32 | SW Site 47 | Analito | 1: D, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 33 | DB_009 | Em branco | 1: D, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 28 | Site de SW 32 | Analito | 1: D, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 29 | Site de SW 50 | Analito | 1: D, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 30 | SW Site 25 | Analito | 1: D, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 31 | 21_DUP Site de SW | Analito | 1, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 32 | SW Site 52 | Analito | 1, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 33 | DB_010 | Em branco | 1, 3 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 34 | FB | Em branco | 1, 2: A | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 35 | 10 std | Padrão | 10 | 1, 3: A | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 36 | 25 std | Padrão | 25 | 1:, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 37 | 50 std | Padrão | 50 | 1:, 5 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 38 | 100 std | Padrão | 100 | 1:, 6 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 39 | 250 std | Padrão | 250 | 1:, 7 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 40 | 500 std | Padrão | 500 | 1:, 8 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 41 | 750 std | Padrão | 750 | 1:B, 1 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 42 | 1000 std | Padrão | 1000 | 1:B, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
| 43 | DB_011 | Em branco | 1:B, 2 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min | |
| 44 | DB_012 | Em branco | 1, 4 | PFAS grad 400uL/min - 9 min executar | PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min |
Tabela 1: Exemplo worklist para alvo de análise e quantificação de PFAS utilizando LC-MS/MS
| Tempo (min) 0 |
% A (acetato de amônio 2,5 mM em 5% MeOH) 90 |
% B (acetato de amônio 2,5 mM em 95% MeOH) 10 |
| 5 | 15 | 85 |
| 5.1 | 0 | 100 |
| 7 | 0 | 100 |
| 7.1 | 90 | 10 |
| 9 | 90 | 10 |
Tabela 2: Gradiente de exemplo para a separação de LC em análise orientada
| Folículo de tensão (kv) | 1,97 |
| Cone de tensão (V) | 15 |
| Extrator de tensão (V) | 3 |
| Lente de RF (V) | 0.3 |
| Temp de fonte | 150 |
| Temp desolvation | 40 |
| Fluxo de gás desolvation (L/hr) | 300 |
| Fluxo de gás do cone (L/hr) | 2 |
Tabela 3: Parâmetros de fonte de ionização para análise orientada
| CMP | Precursor | Produto | Tempo de interrupção | Cone de tensão (V) | Energia de colisão (eV) |
| PFBA | 212.80 | 168.75 | 0.01 | 15 | 10 |
| 13C 4-PFBA É | 216.80 | 171.75 | 0.01 | 15 | 10 |
| PFPeA | 262.85 | 218.75 | 0.01 | 15 | 9 |
| PFBS ° 1 | 298.70 | 79,90 | 0.01 | 40 | 30 |
| PFBS ° 2 | 298.70 | 98.80 | 0.01 | 40 | 28 |
| PFHxA ° 1 | 312.70 | 118.70 | 0.01 | 13 | 21 |
| PFHxA ° 2 | 312.70 | 268.70 | 0.01 | 13 | 10 |
| É 13C 2-PFHxA | 314.75 | 269.75 | 0.01 | 13 | 9 |
| HFPO-DA 1° | 329.16 | 168.90 | 0.01 | 10 | 12 |
| HFPO-DA 2° | 329.16 | 284.90 | 0.01 | 10 | 6 |
| HFPO-DA É O 1° | 332.16 | 168.90 | 0.01 | 10 | 12 |
| HFPO-DA É O 2° | 332.16 | 286.90 | 0.01 | 10 | 6 |
| PFHpA ° 1 | 362.65 | 168.65 | 0.01 | 14 | 17 |
| PFHpA ° 2 | 362.65 | 318.70 | 0.01 | 14 | 10 |
| PFHxS ° 1 | 398.65 | 79,90 | 0.01 | 50 | 38 |
| PFHxS ° 2 | 398.65 | 98.80 | 0.01 | 50 | 32 |
| É 13C 4-PFHxS | 402.65 | 83.90 | 0.01 | 50 | 38 |
| PFOA ° 1 | 412.60 | 168.70 | 0.01 | 15 | 18 |
| PFOA ° 2 | 412.60 | 368.65 | 0.01 | 15 | 11 |
| 13C 4-PFOA É | 416.75 | 371.70 | 0.01 | 15 | 11 |
| PFNA ° 1 | 462.60 | 218.75 | 0.01 | 15 | 17 |
| PFNA ° 2 | 462.60 | 418.60 | 0.01 | 15 | 11 |
| PFNA É | 467.60 | 422.60 | 0.01 | 15 | 11 |
| PFOS ° 1 | 498.65 | 79,90 | 0.01 | 60 | 48 |
| PFOS ° 2 | 498.65 | 98.80 | 0.01 | 60 | 38 |
| 13C 4-PFOS É | 502.60 | 79.70 | 0.01 | 60 | 48 |
| PFDA ° 1 | 512.60 | 218.75 | 0.01 | 16 | 18 |
| PFDA ° 2 | 512.60 | 468.55 | 0.01 | 16 | 12 |
| 13 2 - PFDA É | 514.60 | 469.55 | 0.01 | 16 | 12 |
Tabela 4: Tabela de transição de exemplo e parâmetros de MS/MS para o conteúdo de PFAC-MXA, juntamente com o HFPO-DA
| Tempo (min) |
% A (acetato de amônio 2,5 mM em 5% MeOH) |
% B (acetato de amônio 2,5 mM em 95% MeOH) |
| 0 | 90 | 10 |
| 0,5 | 90 | 10 |
| 3 | 50 | 50 |
| 3.5 | 50 | 50 |
| 5.5 | 40 | 60 |
| 6 | 40 | 60 |
| 7 | 0 | 100 |
| 11 | 0 | 100 |
Tabela 5: Gradiente de exemplo para a separação de LC em análise não específico
| Parâmetro profinder | Valor de ajuste |
| Filtro de altura máxima de extração | 800 contagens |
| Ion(s) permitido | -H / + H |
| Modelo de isótopo de extração de recurso | Moléculas orgânicas comuns |
| Estados de carga permitidos | 2 - Jan |
| Limite de contagem de íon composto | Dois ou mais íons |
| Tolerância de alinhamento RT | 0,40 min + 0,0% |
| Alinhamento de tolerância em massa | 20,00 ppm + 2.0mDa |
| Filtro de altura absoluta de pós-processamento | > = 10000 contagens em uma amostra |
| Pós-processamento MFE Pontuação filtro | > = 75 em uma amostra |
| Algoritmo de integração do pico | 2 ágil |
| Pico integração altura filtro | > = 5000 contagens |
| Encontrar pelo filtro de altura absoluta do íon | > = 7500 contagens em uma amostra |
| Encontrar pelo filtro de Pontuação do íon | > = 50,00 em uma amostra |
Tabela 6: Característica Molecular extração e alinhamento as configurações para o software Profinder. Todos os valores na lista manteve suas configurações padrão para processamento de dados.
| Limiar de abundância do íon | Limiares de recurso | Replicar o limiar (n = 5) | Tempo de execução | Características | Passar o limiar replicar | Passar o limite de CV | Características de 90% das TIC |
| 1 x S/N | 2000 | Nenhum | 8.15 | 987 | 505 | 421 | 91 |
| 2 x S/N | 5000 | Nenhum | 5.02 | 707 | 357 | 313 | 93 |
| 3 x S/N | 10000 | Nenhum | 2.3 | 308 | 249 | 230 | 93 |
| 1 x S/N | 2000 | 100% | 3.3 | 603 | 339 | 297 | 92 |
| 2 x S/N | 35000 | 100% | 1.58 | 310 | 248 | 229 | 93 |
| 3 x S/N | 10000 | 100% | 1.45 | 202 | 190 | 182 | 92 |
Tabela 7: Comparação do tempo de processamento da amostra e as identificações de característica química para os limiares de extração de característica diferente.
Figura 1 : Total cromatograma de íons e íons extraídos cromatogramas para um subconjunto de normas de éter perfluorado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : As curvas de calibração representativo para compostos demonstrando decrescente qualidade de construção de curva analítica. Painel de mais à esquerda indica uma calibração de alta qualidade; Painel médio indica um composto com precisão pobre através de duplicatas de preparação, particularmente nas concentrações mais elevadas; O painel direito indica uma curva com precisão pobre e uma baixa gama dinâmica linear, resultando em uma resposta plana na parte alta de calibração e nenhum sinal detectável na extremidade inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Sobreposto cromatogramas de íons totais (TIC) para águas superficiais extrai coletados o montante e a jusante de um site de produção de fluorochemical. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Extraído do íon cromatogramas (EIC) para todos identificaram características químicas de uma amostra de água de superfície que contém várias classes de fluorochemical. Cada traço de químico é uma cor diferente para diferenciação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Diagrama conceitual de informação crua e previsto para um recurso químico identificado como ácido de dímero de óxido de hexafluoropropylene (HFPO-DA). Características químicas são compiladas a partir da extração do software de dados brutos de medições de MS e conter cromatográficas (por exemplo, tempo de retenção (RT)) e informações de espectrometria de massa. Fórmula prevista, estruturas e identidades químicas são geradas a partir de dados brutos de medição para cada recurso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Trama do defeito de massa para químicas características identificadas em um emissário de fabricação (vermelho, à esquerda) e a água de superfície de referência (azul, certo). Compostos fluorados cair perto e abaixo do tracejado linha zero. Observe a série PFOA/PFOS persistente na amostra de água de superfície de fundo (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Trama de defeito de massa massa vs para não identificadas características químicas de uma amostra de água de superfície com série homóloga identificado e rotulado pelo nontarget pacote R. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : Espectro de massa de um desconhecido características químicas com intensidades isotópicas previstos de três possíveis fórmula química com a mesma monoisotópico Missa Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9 : Espectro de fragmentação de um éter perfluorado composto com anotada fragmento picos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10 : Representação gráfica de filtragem limiares. Da esquerda para a direita, limiar de abundância de íon para espectros de massa característica química, apresentam limiar de abundância para características cromatográficas extraídas e replicar o limiar para a frequência de deteção de característica em um experimento de três vias de injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Preparação e manuseio de amostras
A inclusão de padrões de referência/pico são de suma importância para qualquer análise orientada, como eles fornecem um recuo para verificar a validade analítica. Falta de amostras QC impede qualquer avaliação da precisão dos resultados; a natureza onipresente do fluorochemicals significa que a contaminação oportunidade de amostras de campo, processamento de materiais, ou sistema de LC-MS não é incomum e deve ser contabilizada. Além disso, permite a validação do protocolo independentemente da variação da amostra do dia a dia de processamento, como muitos dos passos podem ser altamente variáveis, particularmente da SPE e etapas de concentração de amostra. A extração de ambos os produtos químicos perfluorados legado e romance pode ser fortemente influenciada pela escolha da fase estacionária para a concentração e os componentes das amostras de fonte, tais como pH e salinidade46. A influência das condições da amostra deve ser considerada se determinadas classes de produtos químicos pefluorinated são de interesse. Esquemas de preparação de amostra alternativa para extratos de água podem ser usadas se a instalação do laboratório está disponível e a análise de dados downstream permanece similar.
Análise de dados direcionados
Para compostos com isótopo estável, combinado rotulado padrões internos e padrões disponíveis, as principais preocupações para análise de dados são instrumental e determinação de limites de deteção do método e intervalos de relatórios adequados podem ser determinados em um base de laboratório-por-laboratório usando abordagens padrão, tais como a relação sinal-ruído de baixo nível padrão picos de47. Na ausência de normas internas correspondentes podem ocorrer erros de efeitos de matriz incompatíveis, e volta-previsão precisa de amostras cravadas pode ser usado para estimar a precisão das medições. Quando a falta de padrões para preparar uma curva, uma estimativa quantitativa de um desconhecido pode ser feita por tratá-la de forma idêntica para um padrão intimamente combinado composta, mas erros na estimativa são da ordem de 10 + dobra com capacidade limitada para quantificar a incerteza, consulte McCord, Newton e Strynar21. Nesses casos, ainda podem ser recolhidos dados de tendência, mas estimativas de concentração são inerentemente não confiáveis.
Análise de dados não específico
Pico escolher configurações têm um impacto substancial no número de características químicas identificadas, mas a qualidade da seleção de recursos é também fortemente impactada. As decisões de interesse na colheita de pico são 1) intensidade das massas individuais a serem incluídos nos espectros, o limiar de abundância do íon 2) a intensidade do cromatograma extraída picos considerados características, a deteção de 3) característica de limiar de abundância de recurso frequência, o limiar de replicar e 4) variação analítica, o limite de CV (Figura 10).
Estabelecendo limiares irrealisticamente baixos para resultados de colheita de pico em um aumento exponencial no tempo de amostra para resolver as características adicionais da abundância cada vez mais baixa (tabela 7). Os filtros de limiar do íon-abundância de massa características espectrais onde bastantes As abundâncias de isótopos individuais não passam do limite. Idealmente seleciona somente para recursos com espectros de MS de qualidade, garantindo que são características químicas muito mais que instrumental ruído e permitindo a previsão de fórmula em processamento a jusante. Um limiar é baseado no ruído instrumental, idealmente pelo menos 3x o limite de ruído para MS1 varreduras. Limiar de abundância de recurso filtros características químicas com base na intensidade ou área do recurso cromatográfica extraído. Esta etapa permite a rejeição dos picos de baixa abundância, que são geralmente de má qualidade cromatográfica, têm altas variâncias ou são o resultado de outro extração software pobres. Um limite adequado deve ser determinado por experiência e por matriz com base em um nível aceitável de geração pobre de recurso (por exemplo, características abaixo a cromatografia inaceitavelmente pobre exposição de limiar). Mais analítica QC pode ser usado para rejeitar recursos a nível cromatográfica com base na identificação inconsistente em repetições analíticas e/ou preparação (limiar replicar) ou baseada na pobre reprodutibilidade de repetições (limiar de CV). Níveis adequados dependem da qualidade do software de integração de pico usado e as entidades químicas sob investigação. Para compostos perfluorados de solúvel em água e protocolos de integração levemente otimizado, recursos devem ser identificados em 80 + % de analítica Replica e CVs são esperados para cair abaixo de 30%, conforme detalhado na seção de métodos.
Os picos detectados de análise não específico não produzir estimativas quantitativas das concentrações dos materiais detectados. Além disso, a identidade do verdadeiras incógnitas pode ser difícil de confirmar porque romance compostos estão ausentes dos bancos de dados publicamente disponíveis. Determinação estrutural romance requer uma análise extensiva com vários métodos e exige conhecimentos especializados em espectrometria de massa e química. No entanto, normalizar as áreas de pico das características químicas pode fornecer estimativas semi-quantitativa das concentrações de incógnitas de espécies conhecidas de21. Se a amostragem consistente e etapas de preparação são empregadas, informações de tendência de tempo para espécies individuais podem ser geradas para monitorar a persistência de um produto químico para o futuro, como a resposta para uma espécie em particular deve ser consistente, exceto por grandes variações da matriz21.
A principal vantagem deste método é a extensibilidade do tratamento para permitir análise orientada e amostra. Enquanto alvo análise fornece informações quantitativas equivalentes ou superiores, que carece grandemente amplitude de análise desejada quando se lida com materiais novos e emergentes, bem como sua relação com materiais de matriz. Aplicação de uma metodologia específica, ou mesmo um suspeito método de triagem com base apenas em materiais conhecidos e limitados de bancos de dados é completamente cego para espécies anteriormente não observados, mesmo que eles podem ter efeitos significativos para a saúde. Como software melhora e bancos de dados tornam-se mais robustos, a precisão de identificação desconhecida irá continuar a aumentar, com uma diminuição concomitante o investimento de tempo e nível de conhecimento necessário para analisar os dados multidimensionais gerados por este abordagem. No entanto, dados gerados atualmente são de significativo valor futuro porque dados bancários permite a análise post-hoc com software recentemente desenvolvido e permite a comparação ao longo do tempo, mesmo que a identidade de um composto detectado é atualmente desconhecida.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os E.U. Agência de proteção ambiental, através de seu escritório de pesquisa e desenvolvimento, financiada e gerida a pesquisa descrita aqui. Este documento foi revisado pela Agência de proteção ambiental dos EUA, escritório de pesquisa e desenvolvimento e aprovado para publicação. As opiniões expressadas neste artigo são as dos autores e não representam necessariamente as opiniões ou políticas da Agência de protecção ambiental dos Estados Unidos. Esta pesquisa foi apoiada em parte por uma entrevista para o programa de pesquisa de pós-doutorado no laboratório nacional de exposição pesquisa administrada pelo Instituto de Oak Ridge, para a ciência e a educação através da DW89992431601 de acordo interinstitucional entre o Departamento de energia dos Estados Unidos e a agência de proteção ambiental dos Estados Unidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acqity ultra-high performance liquid chromatography system | Waters Corporation | Modified with PFCs analysis kit (176001744); equivalent UPLC system is acceptible if PFAS background is checked and confirmed to be low | |
| Ammonium acetate | Fluka | 17836 | Mass spectrometry grade >99% pure |
| Ammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| Balance | Mettler | AB204S | |
| BEH C18 reverse phase UPLC column, 2.1×50 mm, 1.7 μm | Waters Corporation | 186002350 | |
| Dual piston syringe pump | Waters Corporation | SPC10-C | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | ARK2183 | |
| Glass Microfiber Filters | Whatman | 1820-070 | |
| High density polyethelye sample bottle | Nalgene | 2189-0032 | |
| High Resolution Mass Spectrometer | Various | Mass Spectrometer should be capable of providing accurate mass to <10ppm and collecting MS/MS data. Agilent 6530 qTOF and Thermo Fisher Orbitrap Fusion were used in this work | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| Nitric Acid (35% w/w) | Thermo Fisher Scientific | SVCN-5-1 | Can be prepared in house using concentrated nitric acid and reagent water |
| Polypropylene Buchner funnel | ACE Glass | 12557-09 | |
| Polypropylene cenitrfuge tube and cap | BD Falcon | 352096 | |
| Polypropylene Vacuum Flask (1 L) | Nalgene | DS4101-1000 | |
| Quattro Premier XE triple quadrupole mass spectrometer | Waters Corporation | Equivalent triple-quadrupole or better system can be used instead, should provide high sensitivity and stability for targeted analysis | |
| Reagent Water | Any source determined to be PFAS free | ||
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| TurboVap nitrogen evaporator | Caliper Life Sciences | 103198 | Equivalent systems or rotary vacuum evaporator may be used instead |
| Weak anion exchange SPE cartridge (Oasis WAX Plus) | Waters Corporation | 186003519 | |
| Standard Solutions | |||
| 2,3,3,3-Tetrafluoro-2-(1,1,2,2,3,3,3-heptafluoropropoxy)propanoic acid (HFPO-DA) | Wellington | HFPO-DA | |
| Additional targeted compound standards of interest | to be determined based on preliminary analysis and standard availability | ||
| Mass labeled HFPO-DA | Wellington | M2HFPO-DA | |
| Native PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) | Wellington | PFAC-MXA | or PFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest |
| Stable Isotope Labeled PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) | Wellington | MPFAC-MXA | or MPFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest as appropriate for Native PFASs |
| Software | |||
| Mass Profiler Professional | Agilent | Or open source software packages | |
| Profinder | Agilent | Or open source software packages |
References
- Provisional Health Advisories for Perfluorooctanoic Acid (PFOA) and Perfluorooctane Sulfonate (PFOS). United States Environmental Protection Agency. , Washington, DC. (2009).
- Lifetime Health Advisories and Health Effects Support Documents for Perfluorooctanoic Acid and Perfluorooctane Sulfonate. United States Environmental Protection Agency. , Washington DC. 33250-33251 (2016).
- Fact Sheet: 2010/2015 PFOA Stewardship Program. , Available from: https://www.epa.gov/assessing-and-managing-chemicals-under-tsca/fact-sheet-20102015-pfoa-stewardship-program (2006).
- EPA and 3M Announce phase out of PFOS. Environmental Protection Agency. , Available from: https://yosemite.epa.gov/opa/admpress.nsf/0/33aa946e6cb11f35852568e1005246b4 (2000).
- Wang, Z., Cousins, I. T., Scheringer, M., Hungerbühler, K. Fluorinated alternatives to long-chain perfluoroalkyl carboxylic acids (PFCAs), perfluoroalkane sulfonic acids (PFSAs) and their potential precursors. Environment International. 60, 242 (2013).
- Scheringer, M., et al. Helsingør Statement on poly- and perfluorinated alkyl substances (PFASs). Chemosphere. 114, 337-339 (2014).
- Wang, Z., DeWitt, J. C., Higgins, C. P., Cousins, I. T. A Never-Ending Story of Per- and Polyfluoroalkyl Substances (PFASs). Environmental Science & Technology. 51 (5), 2508-2518 (2017).
- Xiao, F., Golovko, S. A., Golovko, M. Y. Identification of novel non-ionic, cationic, zwitterionic, and anionic polyfluoroalkyl substances using UPLC-TOF-MSE high-resolution parent ion search. Analytica Chimica Acta. 988, 41-49 (2017).
- Shoemaker, J., Grimmett, P., Boutin, B. Method 537. Determination of selected perfluorinated alkyl acids in drinking water by solid phase extraction and liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). US Environmental Protection Agency. , Washington, DC. (2009).
- Poole, C. F., Gunatilleka, A. D., Sethuraman, R. Contributions of theory to method development in solid-phase extraction. Journal of Chromatography A. 885 (1), 17-39 (2000).
- Ahrens, L. Polyfluoroalkyl compounds in the aquatic environment: a review of their occurrence and fate. Journal of Environmental Monitoring. 13 (1), 20-31 (2011).
- Higgins, C. P., Field, J. A., Criddle, C. S., Luthy, R. G. Quantitative Determination of Perfluorochemicals in Sediments and Domestic Sludge. Environmental Science & Technology. 39 (11), 3946-3956 (2005).
- Szostek, B., Prickett, K. B., Buck, R. C. Determination of fluorotelomer alcohols by liquid chromatography/tandem mass spectrometry in water. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 20 (19), 2837-2844 (2006).
- Alzaga, R., Bayona, J. M. Determination of perfluorocarboxylic acids in aqueous matrices by ion-pair solid-phase microextraction-in-port derivatization-gas chromatography-negative ion chemical ionization mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1042 (1-2), 155-162 (2004).
- Schaider, L. A., et al. Fluorinated Compounds in U.S. Fast Food Packaging. Environmental Science & Technology Letters. 4 (3), 105-111 (2017).
- Lindstrom, A. B., Strynar, M. J., Libelo, E. L. Polyfluorinated Compounds: Past, Present, and Future. Environmental Science & Technology. 45 (19), 7954 (2011).
- Liu, Y., Pereira, A. D. S., Martin, J. W. Discovery of C5-C17 Poly-and Perfluoroalkyl Substances in Water by In-Line SPE-HPLC-Orbitrap with In-Source Fragmentation Flagging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4260 (2015).
- Backe, W. J., Day, T. C., Field, J. A. Zwitterionic, Cationic, and Anionic Fluorinated Chemicals in Aqueous Film Forming Foam Formulations and Groundwater from U.S. Military Bases by Nonaqueous Large-Volume Injection HPLC-MS/MS. Environmental Science & Technology. 47 (10), 5226-5234 (2013).
- Mazzoni, M., Rusconi, M., Valsecchi, S., Martins, C. P. B., Polesello, S. An on-line solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of perfluoroalkyl acids in drinking and surface waters. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2015, 942016 (2015).
- Li, F., et al. Method development for analysis of short- and long-chain perfluorinated acids in solid matrices. International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 91 (12), 1117-1134 (2011).
- McCord, J., Newton, S., Strynar, M. Validation of quantitative measurements and semi-quantitative estimates of emerging perfluoroethercarboxylic acids (PFECAs) and hexfluoroprolyene oxide acids (HFPOAs). J Chromatoqr A. , (2018).
- Wang, Y., Liu, S., Hu, Y., Li, P., Wan, J. -B. Current state of the art of mass spectrometry-based metabolomics studies - a review focusing on wide coverage, high throughput and easy identification. RSC Advances. 5 (96), 78728-78737 (2015).
- Cajka, T., Fiehn, O. Toward Merging Untargeted and Targeted Methods in Mass Spectrometry-Based Metabolomics and Lipidomics. Analytical Chemistry. 88 (1), 524-545 (2016).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: The case for high resolution and high mass accuracy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Sobus, J. R., et al. Integrating tools for non-targeted analysis research and chemical safety evaluations at the US EPA. Journal of Exposure Science & Environmental Epidemiology. , (2017).
- Bletsou, A. A., Jeon, J., Hollender, J., Archontaki, E., Thomaidis, N. S. Targeted and non-targeted liquid chromatography-mass spectrometric workflows for identification of transformation products of emerging pollutants in the aquatic environment. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 66, 32-44 (2015).
- Viant, M. R., Sommer, U. Mass spectrometry based environmental metabolomics: a primer and review. Metabolomics. 9 (1), 144-158 (2013).
- Xiao, F. Emerging poly- and perfluoroalkyl substances in the aquatic environment: A review of current literature. Water Research. 124, 482-495 (2017).
- Nakayama, S. F., Strynar, M. J., Reiner, J. L., Delinsky, A. D., Lindstrom, A. B. Determination of perfluorinated compounds in the Upper Mississippi River Basin. Environmental Science & Technology. 44 (11), 4103 (2010).
- Strynar, M., et al. Identification of novel perfluoroalkyl ether carboxylic acids (PFECAs) and sulfonic acids (PFESAs) in natural waters using accurate mass time-of-flight mass spectrometry (TOFMS). Environmental Science & Technology. 49 (19), 11622 (2015).
- Newton, S., et al. Novel Polyfluorinated Compounds Identified Using High Resolution Mass Spectrometry Downstream of Manufacturing Facilities near Decatur, Alabama. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1544-1552 (2017).
- Forsberg, E. M., et al. Data processing, multi-omic pathway mapping, and metabolite activity analysis using XCMS Online. Nature Protocols. 13, 633 (2018).
- Sturm, M., et al. OpenMS - An open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9 (1), 163 (2008).
- Kind, T., Fiehn, O. Seven Golden Rules for heuristic filtering of molecular formulas obtained by accurate mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 8, 105-105 (2007).
- Loos, M., Singer, H. Nontargeted homologue series extraction from hyphenated high resolution mass spectrometry data. Journal of Cheminformatics. 9, 12 (2017).
- Dimzon, I. K., et al. High Resolution Mass Spectrometry of Polyfluorinated Polyether-Based Formulation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27, 309 (2016).
- McEachran, A. D., Sobus, J. R., Williams, A. J. Identifying known unknowns using the US EPA's CompTox Chemistry Dashboard. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1729-1735 (2017).
- French, W. R., et al. Wavelet-Based Peak Detection and a New Charge Inference Procedure for MS/MS Implemented in ProteoWizard's msConvert. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1299-1307 (2015).
- Tautenhahn, R., Böttcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9, 504 (2008).
- Rafiei, A., Sleno, L. Comparison of peak-picking workflows for untargeted liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry metabolomics data analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (1), 119-127 (2015).
- Kind, T., Fiehn, O. Metabolomic database annotations via query of elemental compositions: Mass accuracy is insufficient even at less than 1 ppm. BMC Bioinformatics. 7, 234-234 (2006).
- Brack, W., Dulio, V., Slobodnik, J. The NORMAN Network and its activities on emerging environmental substances with a focus on effect-directed analysis of complex environmental contamination. Environmental Sciences Europe. 24 (1), 29 (2012).
- Blaženović, I., et al. Comprehensive comparison of in silico MS/MS fragmentation tools of the CASMI contest: database boosting is needed to achieve 93% accuracy. Journal of Cheminformatics. 9, 32 (2017).
- Rager, J. E., et al. Linking high resolution mass spectrometry data with exposure and toxicity forecasts to advance high-throughput environmental monitoring. Environment International. 88, Supplement C 269-280 (2016).
- Munoz, G., et al. Environmental Occurrence of Perfluoroalkyl Acids and Novel Fluorotelomer Surfactants in the Freshwater Fish Catostomus commersonii and Sediments Following Firefighting Foam Deployment at the Lac-Mégantic Railway Accident. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1231-1240 (2017).
- Brumovský, M., Bečanová, J., Karásková, P., Nizzetto, L. Retention performance of three widely used SPE sorbents for the extraction of perfluoroalkyl substances from seawater. Chemosphere. 193, 259-269 (2018).
- Definition, Definition and Procedure for the Determination of the Method Detection Limit (Revision 2). Environmental Protection Agency. , Federal Regester (2016).
