Qui, forniamo un protocollo dettagliato per isolare piccole vescicole extracellulari (SVE) dai tessuti interi, compresi i campioni di cervello e del tumore. Questo metodo offre una tecnica riproducibile per estrarre SVE da tessuto solido per ulteriori analisi a valle.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Estrazione delle vescicole extracellulari dal tessuto intero
In questo articolo
Sommario
Abstract
Circolante e interstiziale piccole membrana-limita (SVE) vescicole di extracellulare rappresentano un bersaglio promettente per lo sviluppo di saggi di nuovo biomarcatore diagnostico o prognostico e probabilmente servono come giocatori importanti nella progressione di un vasto spettro di malattie. Ricerca corrente è focalizzata sulla caratterizzazione delle vescicole secernuta da cellule multiple e tipi di tessuto al fine di meglio comprendere il ruolo di EVs nella patogenesi di condizioni tra cui neurodegenerazione, infiammazione e cancro. Tuttavia, globalmente coerenti e riproducibili tecniche per isolare e purificare le vescicole rimangono in corso. Inoltre, a malapena vengono descritti metodi per l'estrazione del SVE da tessuto solido ex vivo . Qui, forniamo un protocollo dettagliato per estrarre piccoli EVs di interesse dai tessuti intero freschi o congelati, compreso i campioni del cervello e del tumore, per ulteriore caratterizzazione. Dimostriamo l'adattabilità di questo metodo per analisi multiple a valle, tra cui la microscopia elettronica e immunophenotypic caratterizzazione delle vescicole, così come la spettrometria di massa quantitativa delle proteine di EV.
Introduzione
Piccole vescicole extracellulari (SVE) includono endosomal-derivato esosomi e microvescicole membrana-capannone piccolo di ampio interesse biomedico. Piccoli SVE sono composti da una popolazione eterogenea di vescicole di membrana-limitano nm 50-250 contenenti proteine biologicamente attive, i lipidi e gli acidi nucleici che collettivamente sono creduti per svolgere ruoli importanti in una moltitudine di processi di malattia. Progresso della ricerca è particolarmente implicata queste vescicole in neurodegenerative e malattie da prioni, processi infettivi, condizioni infiammatorie o autoimmuni e la crescita del tumore e metastasi1,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutto cervelli sono stati ottenuti con approvazione dall'uso animale istituzionale e cura Committee (IACUC) della Florida State University. Un totale di dodici cervelli di topo (3 cervelli da ogni gruppo d'età: 2, 4, 6 e 8 mesi) da un C57BL/6 J sfondo sono stati utilizzati per l'estrazione di EV, come descritto in precedenza16. Esemplari del tumore del polmone sono stati generosamente donati da Dr. Mandip Sachdeva sotto approvazione del Florida agricola e meccanica Università IACUC. Tumori del polmone sono stati derivati dalla linea cellulare umana dell'adenocarcinoma H1975 coltivato in immunodeficienti topi nudi di Balb/c nu/nu. Dati da due re....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Nella Figura 1viene visualizzata una descrizione schematica della dissociazione del tessuto, centrifugazione differenziale e gradienti purificazione delle vescicole. Conferma della morfologica e immunophenotypic del gradiente-purificato sve è evidenziata nella Figura 2. Un diagramma di densità riproducibile dopo ultracentrifugazione di pendenza di iodixanol il 10-30% viene mostrato, con due popolazioni distinte della vescicola la.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Interesse molto scientifico è stato generato per quanto riguarda i ruoli che piccoli EVs giocare nel microambiente tumorale, come pure in funzione, la maturazione e lo sviluppo dell'organo. Nel complesso, questo studio fornisce un flusso di lavoro ottimizzato per l'estrazione del SVE intatti da intero cervello o esemplari del tumore. Mentre qui abbiamo semplicemente dimostrare l'applicabilità di questa tecnica per EVs derivate da tumore del polmone, questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per lavoro su altri te.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dr. Richard Nowakowski e la Florida State University laboratorio animale risorse per fornire e la cura per gli animali utilizzati per sviluppare questo protocollo, rispettosamente. Ringraziamo Liu Xia, Dr. Rakesh Singh e il Florida State University traslazionale Science Laboratory per assistenza con il lavoro di spettrometria di massa utilizzato per la caratterizzazione della vescicola a valle, come pure del fondo per la FSU biologico Scienza Imaging Resource l'utilizzo del microscopio elettronico trasmissione in questo studio. Infine, ringraziamo il dottor Mandip Sachdeva (Florida A & M University) per la donazione degli esemplari del tumore....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,45 & micro; m filter | VWR | 28145-505 | |
| Provette per ultracentrifuga da 12 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| provette per ultracentrifuga da 5,5 mL | Beckman Coulter | 344057 | |
| anticorpo anti-Alix | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anticorpo anti-Calnexina | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anticorpo anti-CD63 | Abcam | ab59479 | |
| anticorpo anti-CD81 | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anticorpo anti-Flotillin 2 Santa | Cruz | sc-25507 | |
| anticorpo HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anticorpo anti-Syntenin-1 | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anticorpo anti-TSG101 Santa | Cruz | sc-7964 | |
| EZQ kit di quantificazione di proteine | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotore | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Microscopio elettronico | TSS | ||
| Microscopio capra anti-coniglio IgG (frammento Fab) | Genetex | 27171 | |
| Inibitore della fosfatasi HALT (soluzione 100x) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| Inibitore della proteasi HALT (soluzione 100x) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Ibernazione E media | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 rotore a secchiello oscillante | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Ultracentrifuga da banco | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuga | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% di iodixanolo in soluzione di acqua sterile |
| Q Spettrometro di massa HF esattivo | ThermoFisher Scientific | ||
| coniglio anti-capra | IgG Genetex | 26741 | |
| coniglio anti-topo IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (rifrattometro) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotore | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti a secchio oscillante Rotore | Beckman Coulter | 333790 | |
| Centrifuga da tavolo 5804R | Eppendorf | 22623508 |
Riferimenti
- Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
