Il metodo presentato crea tessuto vegetale naturale danneggiato erbivoro attraverso l'applicazione di larve di sexta Manduca a foglie staccate di patate. Il tessuto vegetale è stato analisi per l'espressione di sei omologhi del fattore di trascrizione coinvolti nelle prime risposte all'erbivoro degli insetti.
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Articolo metodologico
Secondo i saggi foglia distaccati per semplificare gli studi sull'espressione genica nelle patate durante l'infestazione da mawing Insect Manduca sexta
In questo articolo
Sommario
Abstract
La natura multitrofica degli studi sull'espressione genica degli insetti erbivori richiede un gran numero di repliche biologiche, creando la necessità di protocolli erbivori più semplici e più snelli. Le perturbazioni degli insetti masticatori sono di solito studiate in sistemi vegetali interi. Mentre questa strategia dell'intero organismo è popolare, non è necessario se osservazioni simili possono essere replicate in un'unica foglia staccata. L'ipotesi è che gli elementi di base necessari per la trasduzione del segnale siano presenti all'interno della foglia stessa. Nel caso di eventi iniziali nella trasduzione del segnale, le cellule devono solo ricevere il segnale dalla perturbazione e trasmettere quel segnale alle cellule vicine che vengono analizzate per l'espressione genica.
Il metodo proposto modifica semplicemente la tempistica del distacco. Negli esperimenti su piante intere, le larve sono confinate in una singola foglia che alla fine viene staccata dalla pianta e analizzata per l'espressione genica. Se l'ordine di escissione è invertito, dall'ultimo negli studi di piante intere, al primo nello studio distaccato, l'esperimento di alimentazione è semplificato.
Kennebec, Var, Varnebec di Solanum viene propagato dal trasferimento nodale in un semplice mezzo di coltura dei tessuti e trasferito al suolo per un'ulteriore crescita, se lo si desidera. Le foglie vengono ascise dalla pianta madre e trasferite ai piatti Petri dove il saggio di alimentazione viene condotto con gli stadi larvali di M. sexta. Il tessuto fogliare danneggiato viene analizzato per l'espressione di eventi relativamente precoce nella trasduzione del segnale. L'analisi dell'espressione genica ha identificato i fattori di trascrizione Cys2-His2-His2 (C2H2) specifici per l'infestazione, confermando il successo dell'uso di foglie distaccate negli studi di risposta precoce. Il metodo è più facile da eseguire rispetto alle infestazioni di piante intere e utilizza meno spazio.
Introduzione
Herbivory mette in moto una serie di eventi molecolari durante i quali una pianta può sia identificare l'attacco che montare una risposta appropriata per la sua sopravvivenza. Una pianta riceve due segnali di base da insetti masticatori; uno dal danno fisico al tessuto e l'altro da sostanze specifiche per insetti. I modelli molecolari associati ai danni (DAMP) vengono rilasciati in risposta ai danni creati dalle parti della bocca larvale e innescano una risposta ben definita della ferita che si traduce in un aumento dell'acido jasmonico ormonale e nella trascrizione dei geni di difesa1. Uno dei DAMP più conosciuti è systemin, un polipeptide che....
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Protocollo
NOTA: il seguente protocollo è progettato per una persona per impostare, effettuare osservazioni e raccogliere campioni. Più corse della stessa configurazione possono essere combinate per aumentare la replicazione biologica. Eventuali ripetizioni aggiuntive dell'esperimento dovrebbero essere impostate alla stessa ora del giorno per eliminare possibili influenze diurne sull'espressione genica. Il protocollo è progettato per creare 3 foglie "infestate" per 5 punti di tempo di raccolta separati. Il controllo corrispondente lascia per ogni punto temporale creare un totale di 30 campioni. L'esperimento può essere eseguito con una varietà di dimensioni delle foglie e stadi ....
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Risultati
Il consumo foglia definisce il successo del protocollo. Le larve in fase sane e accurate dovrebbero iniziare l'alimentazione immediatamente dopo il posizionamento sulla superficie della foglia e l'alimentazione dovrebbe continuare in modo abbastanza coerente per tutto il tempo di infestazione. Nel Video1, la larva nella parte superiore inizia a masticare subito dopo il posizionamento e mantiene una velocità costante durante l'alimentazione. Ciò è particolarmente important.......
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Discussione
L'uso di metodologie erbiflue vegetali intere esistenti non è necessario per raggiungere l'obiettivo di questo particolare studio (ad esempio, vagliare una serie di geni candidati per la loro risposta all'infestazione). L'ovvio vantaggio della raffinatezza delle foglie staccate è l'accorciamento del tempo necessario per eseguire i saggi erbivori. La natura ingombrante di intere piante con gabbie clip viene eliminata e i saggi vengono eseguiti prima, poiché le piante fino a 2 settimane possono essere utilizzate per raccog.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Bob Farrar e Alexis Park per aver fornito insetti utilizzati in questo studio e per la loro esperienza nella messa in scena larvale. Ulteriori grazie a Michael Blackburn e Saikat Ghosh per la revisione critica del manoscritto.
La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione ha lo scopo esclusivamente di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazioni o approvazioni da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti.
USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Il prodotto | G3251 | PhytoTechnology Laboratories | |
| il recipiente di contenimento Gelzan (piatto da 6,12 o 24 pozzetti) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | molte altre aziende vendono questi prodotti |
| uova manduca | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 uova |
| uova di manduca | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 o 500 uova |
| larve di manduca | Carolina Biological Supply Company | chiama per richieste specifiche di stadi larvali | qualsiasi |
| larva di manduca instar qualsiasi larva di instar | Grandi Laghi chiama | per richieste specifiche di stadi larvali | |
| provette per microcentrifuga instar, 1,7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | questi sono stati testati nel liquido N2 e non esploderanno |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | utilizzato per fare la propagazione medium |
| nutriente agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | il prodotto è Murashige & Skoog Basal Medium con vitamine, saccarosio e |
| dischi filtranti in carta | Fisher Scientific. | 09-805A | Cerchi Whatman-acquisto per adattarsi alla capsula |
| Petri, 60X15 mm o 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A o FB0875712 | formato di acquisto appropriato per |
| i tuberi di patata | qualsiasi | taglia B (non biologico) | suggerisci Maine Farmer' s Vasi di scambio |
| , 10" | Forniture per serre Griffin, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| conservante/biocida | Tecnologia delle cellule vegetali | Il prodotto NA | è PPM (Plant Preservative Mixture) |
| da semina per fonte di espianto | qualsiasi | dimensione B (non organica), | suggerisce l'agricoltore del Maine' s |
| Scambio fertilizzante a lenta cessione (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote è un popolare marchio |
| pinze soft touch | BioQuip | 4750 | |
| miscela di terreno | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | il prodotto è |
| un recipiente di coltura sterile | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Recipiente di tipo magenta, PTL-100 |
| sterile recipiente di coltura | Fisher Scientific | ICN2672206 | prodotto è MP Biomedicals Plantcon |
Riferimenti
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science.
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Ristampe e permessi
