Summary
Den presenterte metoden skaper naturlig herbivore skadet plante vev gjennom anvendelse av Manduca Sexta larver til frittliggende blader av potet. Anlegget vev er analyseres for uttrykk for seks transkripsjon faktor homologs involvert i tidlig svar på insekt herbivory.
Abstract
Multitrophic natur genuttrykk studier av insekt herbivory krever et stort antall biologiske replikeres, noe som skaper behovet for enklere, mer strømlinjeformet herbivory protokoller. Forstyrrelser av tygge insekter er vanligvis studert i hele anlegget systemer. Selv om hele denne organismen strategien er populær, er det ikke nødvendig hvis lignende observasjoner kan replikeres i et enkelt frittliggende blad. Forutsetningen er at grunnleggende elementer som kreves for signal Transduction er til stede i bladet selv. I tilfelle av tidlige hendelser i signal Transduction, celler trenger bare å motta signalet fra forstyrrelsene og overføre det signalet til nærliggende celler som er analyseres for genuttrykk.
Den foreslåtte metoden endrer bare tidspunktet for avløsning. I hele plante eksperimenter, larver er begrenset til et enkelt blad som er til slutt løsrevet fra anlegget og analyseres for genuttrykk. Hvis rekkefølgen av forbrukeravgift er reversert, fra siste i hele plante studier, til først i frittliggende studien, er fôring eksperimentet forenklet.
Solanum tuberosum var. Kennebec spres ved Nodal overføring i et enkelt vev kultur medium og overføres til jord for videre vekst hvis ønskelig. Bladene er excised fra den overordnede planten og flyttet til Petri retter der fôring analysen er gjennomført med larvestadiet stadier av M. Sexta. Skadet blad vev er analyseres for uttrykk for relativt tidlige hendelser i signal Transduction. Gene Expression analyse identifisert infestation-spesifikke Cys2-His2 (C2H2) transkripsjon faktorer, bekrefter suksessen med å bruke frittliggende blader i tidlig respons studier. Metoden er enklere å utføre enn hele anlegget infestations og bruker mindre plass.
Introduction
Herbivory setter i gang en rekke molekylære hendelser der en plante kan både identifisere angrep og montere en passende respons for sin overlevelse. En plante får to grunnleggende signaler fra tygge insekter; en fra den fysiske skaden på vevet og den andre fra insekt-spesifikke stoffer. Skade-Associated molekylære mønstre (demper) er utgitt som svar på skader opprettet av larvestadiet elektiske og utløse en veldefinert såret respons som resulterer i en økning i hormonet jasmonic syre og transkripsjon av Forsvaret gener1. En av de mest kjente demper er anlegg, en polypeptid som er dannet av kløften av større prosystemin protein etter et blad er såret2,3. Den jasmonic syre såret responsen er ytterligere modulert av herbivore-assosiert molekylær mønstre (HAMPs), som kan utledes fra Caterpillar spytt, gut innhold (regurgitant) og avføring (frass)4. Insekter bruker disse stoffene til enten å øke eller unngå forsvars responsen5. Transkripsjon faktorer deretter relé meldingen fra hormon signaler i forsvaret responsen via regulering av nedstrøms forsvaret gener6,7,8.
Noen plante-insekt interaksjon studier brukes i laboratoriet innstillingene er av simulert type, med et mål om tilnærme den naturlige metoden for fôring av insekt. Simulert herbivory oppnås vanligvis ved å skape kunstige skader å plante vev med ulike verktøy som etterligner den spesifikke mekanismen for insekt elektiske tilstrekkelig til å forårsake frigjøring av demper og utløse produksjon av forsvars gener. Andre insekt-spesifikke komponenter som oral sekreter eller regurgitant er ofte lagt for å gjenskape bidraget fra HAMPs9,10,11. Opprettelsen av en bestemt størrelse og type sår og anvendelse av presise mengder HAMPs er en fordel for disse typer studier og kan tilby mer reproduserbar resultater. Naturlig herbivory studier, der skade på plante vev oppnås ved anvendelse av felt-ervervet eller laboratorie-reist insekter, er ofte mer utfordrende fordi sår-størrelse og HAMP mengder styres av insekt atferd og legge variasjon til Data. Den naturlige versus simulerte metoder og deres fordeler og ulemper er godt diskutert i litteraturen12,13,14.
Å studere tidlig signalnettverk hendelser som transkripsjon faktorer, en viss prosent av bladet må forbrukes i en relativt kort tid, så larver må begynne å tygge umiddelbart og opprettholde forbruket til bladet er frosset for analyse. M. Sexta er en grådig mater på flere Solanaceous planter i løpet av mange av sine larvestadiet stadier, noe som gjør det ideelt for å formidle maksimal skade på relativt kort tid15. Dette er praktisk når du studerer tidlig signalering hendelser, som anlegget responsen skjer nesten umiddelbart etter at et insekt kontakter Leaf overflaten16,17. Den brukte klippet buret metode for forvaring beviser klønete, som flere bur ville kreve stadige justeringer gjennom hele eksperimentet for å tillate fjerning eller tilsetning av larver. Bladene må også være store nok og sterk nok til å støtte flere insekter fôring på samme tid. Disse typer potet planter krever en stor mengde plass til å observere fôring. Larver vil ofte flytte til undersiden av bladet overflaten som også gjør fôring observasjoner ganske vanskelig. Bruke hele planter til å utføre disse eksperimentene er klart tungvint.
Den nåværende studien bruker frittliggende blader isolert i Petri retter i stedet for hele planter for å effektivisere og forenkle hele anlegget tilnærming til å studere herbivory. Anvendelsen av protokollen i denne studien er begrenset til observasjon av en gruppe C2H2 transkripsjon faktorer indusert tidlig i potet blader etter planteetende skade av M. Sexta larver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: følgende protokoll er laget for at én person skal kunne konfigurere, gjøre observasjoner og samle inn prøver. Flere kjøringer av samme oppsett kan kombineres for å øke biologisk replikering. Eventuelle ytterligere repetisjoner av eksperimentet bør settes opp på samme tid på dagen for å eliminere mulige dagaktive påvirkninger på genuttrykk. Protokollen er utformet for å skape 3 ' infiserte ' blader for 5 separate Harvest tid poeng. Matchet kontroll blader for hvert tidspunkt opprette totalt 30 prøver. Eksperimentet kan utføres med en rekke blad størrelser og larvestadiet stadier, men det anbefales at blad størrelse, larvestadiet scenen og infestation tid være konsistent gjennom hele prosedyren.
1. utarbeidelse av potet planter
Merk: alle trinn som krever steril teknikk må utføres i en vev kultur hette18,19.
- Forbered Kennebec plantlets fra explant kilde.
- Klargjør forplantning medium.
- Tilsett 4,43 g Murashige og Skoog (MS) med vitaminer pulver, 20 g sukrose og 2 g agar erstatning til 1 L av omvendt osmose (RO)-renset vann i en 2 L kolbe med en spin bar. Overfør flasken til en rør plate og bland. Juster pH til 5,8 ved hjelp av NaOH mens du fortsetter å røre.
Merk: agar vil ikke oppløses før autoklaveres. - Tilsett 1 mL konserveringsmiddel/biocid og autoklav på flytende syklus i 20 min (121 ° c, 101,3 kPa). Fjern medium fra autoklav umiddelbart etter at syklusen er ferdig og Avkjøl det til 50 ° c. Overfør 100 mL sterilt og avkjølt forplantning medium til sterile kultur fartøy (for eksempel magenta eller Plantcon) ved hjelp av steril teknikk i en vev kultur hette.
- Tilsett 4,43 g Murashige og Skoog (MS) med vitaminer pulver, 20 g sukrose og 2 g agar erstatning til 1 L av omvendt osmose (RO)-renset vann i en 2 L kolbe med en spin bar. Overfør flasken til en rør plate og bland. Juster pH til 5,8 ved hjelp av NaOH mens du fortsetter å røre.
- Forbered explant materiale.
- Skaff explant kilde som Kennebec frø poteter og fjerne alle spor av jord ved å vaske med springen H2O. Fjern spirer og skjær i 2 cm biter med en steril skalpell.
- Sterilisere spire brikker ved soaking for 15 s i 70% etanol, etterfulgt av 13 min i 1:1 blekemiddel (1 del RO-vann: 1 del konsentrert bakteriedrepende/kommersiell karakter blekemiddel). Skyll 5 ganger i steril H2O.
- Overfør explant materiale til sterile vev kultur fartøy med forplantning medium i en vev kultur hette ved hjelp av steril teknikk. Overfør fartøy til et plante vev kultur kammer og vokse i 2 \ u20123 uker eller til plantlets form ved 24 ° c, 16 h lys (140 mikromol · m-2· s-1)/8 h mørk photoperiod.
- Klargjør forplantning medium.
- Forbered Nodal-spredte vev kultur potet planter.
- Klargjør Nodal overføringsmedium.
Merk: Dette vil gjøre 10 vev kultur fartøy som kan brukes samme dag eller kan gjøres på forhånd og lagres ved 4 ° c til Nodal overføring.- Tilsett 36,43 g av næringsstoffer agar bland til 1 L av RO-renset vann i en 2 L kolbe med en spin bar. Overfør flasken til en rør plate og bland. Juster pH til 5,8 ved hjelp av KOH mens du fortsetter å røre.
Merk: agar vil ikke oppløses før autoklaveres. - Autoklav på flytende syklus i 20 min (121 ° c, 101,3 kPa). Fjern medium fra autoklav umiddelbart etter at syklusen er ferdig og Avkjøl det til 50 ° c. Transfer 100 mL steril avkjølt Nodal overføring medium til sterile kultur fartøy (se tabell over materialer) ved hjelp av steril teknikk i en vev kultur hette.
- Tilsett 36,43 g av næringsstoffer agar bland til 1 L av RO-renset vann i en 2 L kolbe med en spin bar. Overfør flasken til en rør plate og bland. Juster pH til 5,8 ved hjelp av KOH mens du fortsetter å røre.
- Forbered Nodal borekaks.
- Skaff Kennebec plantlets vokst fra explant materiale (produsert i trinn 1.1.2). Plantlets bør ha minst 3 til 4 noder (gren poeng). Fjern bladene med steril saks eller skalpell. Skjær grener nær hoved stammen, etterlot ca 2 mm gren vev.
- Fjern Nodal seksjoner fra stammen ved å kutte ca 2 mm over og under hvert gren punkt eller node. Arrangere Nodal borekaks i et sterilt vev kultur fartøy som inneholder Nodal overføring medium (produsert i trinn 1.2.1.2) i samme retning som i forrige fartøyet (gren peker opp).
- Overfør fartøy med Nodal borekaks til et plante vev kultur kammer og vokse for 2 \ u20123 uker ved 24 ° c, 16 h lys (140 mikromol · m-2· s-1)/8 h mørk photoperiod.
Merk: hver Nodal skjæring vil vokse til en ny plantlet. Antall borekaks i hvert fartøy bestemmer blad størrelse. Færre borekaks overført per fartøy vil resultere i større blader. Tre planter per fartøy vil ha 15 mm x 20 mm blader i 2 \ u20123 uker.
- Klargjør Nodal overføringsmedium.
- Valgfritt Forbered jord dyrket Kennebec potet planter.
Merk: for å produsere større blader, Nodal spredte potet plantlets kan overføres til jord.- Overfør potet plantlets dyrket i Nodal overføring medium til jord ved å forsiktig trekke anlegget fra mediet til alt rot vevet slippes fra agar.
- Overfør til jord like over den første noden fra røttene og lett pakke jorda rundt transplantasjon. Vann forsiktig for å sikre jord kontakt med rotsystemet.
- Plasser i en vekst kammer med 16 h lys (140 mikromol · m-2· s-1)/8 h mørk Photoperiod og 25/20 ° c dag/natt temperaturer.
Merk: plantene er klare når de to øverste fullt utvidet bladene har nådd størrelsen som passer for analysen.
- Valgfritt Forbered tuber-dyrket potet planter.
Merk: potet planter vokst fra knoller er større og mer robust og kan være nyttig hvis oppdra larver på planter eller om natten larvestadiet fôring er ønsket.- Plasser en potet tuber 6 i dypt i en 10 i potten som inneholder jord blanding supplert med 10 mL pelleted langsom utgivelse gjødsel.
- Plasser i et vekst kammer med 16 h lys (140 mikromol · m-2· s-1)/8 h mørk Photoperiod og 25/20 ° c dag/natt temperatur. Plantene er klare ca 30 \ u201240 dager fra tuber planting.
Merk: ikke bruk planter som har begynt å blomstre.
2. utarbeidelse av insekter for fôring
- Skaff ønsket larvestadiet trinn av M. Sexta.
Merk: larver for denne studien ble oppdratt på kunstig diett gjennom femte skikkelsen20 og iscenesatt av en erfaren person fra in-House insectary. Larver kan også bli oppdratt helt eller delvis på plante vev. Larvene spiser ikke umiddelbart før en molt og er mest sannsynlig å spise rett etter molt, så hensiktsmessig staging er viktig21. - Overfør larver til et egnet oppsamlings fartøy (f. eks 6-, 12-, 24-brønn vev kultur parabol) avhengig av larvestadiet størrelse. Det bør være en Larven per brønn i fatet.
Merk: larver kan vise territorial eller kannibalistiske adferd uten mat kilde, og kan bli skadet hvis den er plassert sammen. - Valgfritt Sulte larver for inntil 2 h, da dette kan forbedre larvestadiet fôring.
Merk: Larvene skal være i et oppsamlings fartøy som er lagret i vekst kammeret i denne perioden.
3. komponenter oppsett for infestation eksperimentet
Merk: Se skjematisk oppsummering i figur 1.
- Lag plasseringsmaler for hvert tidspunkt for innhøsting.
Merk: det er nyttig å sette opp 5 forskjellige skuffer for hvert tidspunkt for innhøsting. Dette holder prøver organisert og gjør at rettene skal flyttes rundt mer effektivt som et sett uten å endre sin ordning. Hvis prosent-av-skade beregninger vil bli utført, er dette viktig som før-og etter-infestation bilder må fanges i samme brennvidde.- Skaff 5 solide skuffer i stand til å holde et sett med seks passende størrelse Petri retter og linje med hvitt papir.
Merk: størrelsen på Petri parabolen er basert på bladet størrelse valgt for fôring analysen. Bladet skal passe lett i fatet uten å berøre sidene. For eksempel, en 60 mm x 15 mm parabol er egnet for blader opp til 50 mm i lengde eller bredde. - Trace et sett med seks sirkler ved hjelp av riktig størrelse Petri parabolen på papiret i hver skuff. Merk ett sett med sirkler ' kontroll ' A, B og C og den andre ' infisert ' A, B og C. Merk også hver Plasseringsmal med riktig høst tid.
- Skaff 5 solide skuffer i stand til å holde et sett med seks passende størrelse Petri retter og linje med hvitt papir.
- Valgfritt Sett opp et kamera for "før infestation" og "etter infestation" Image Capture.
- Sikre et kamera på en stand på riktig brennvidde for bildeopptak av alle Petri retter i plasseringsmalen.
- Etiketten innhøstingen tid punkt rør.
- Merk et sett med 30, 1,7 mL mikrosentrifugen rør som tilsvarer hver sirkel i plasseringsmalen. Label rørene til hensiktsmessig identifisere forstyrrelsene (kontroll/infisert), anlegget replikering brev (A, B eller C) og innhøstingen tidspunkt punkt (antall minutter etter infestation periode).
- Forbered Petri retter valgt i trinn 3.1.1.
- Plasser en steril filter papir plate i hver av de 30 Petri rettene fra Step 3.1.1. Tilsett sterilt vann for å fukte platene; ikke la overflødig vann til bassenget i fatet. Plasser hver tallerken i hver av de seks sirklene i hver Plasseringsmal.
- Plasser tre potet planter ved siden av hver Plasseringsmal. Sørg for at plantene er alle på samme alder og relative størrelse.
4. utføre infestation
Merk: en innhøsting tid punkt/plassering malen er satt opp om gangen.
- Fjern de øverste to størrelse-matchet blader fra hver plante med steril saks og plassere ett blad i kontroll Petri parabolen og en i infisert Petri parabolen for hver plante (A, B og C). Utfør denne prosessen så raskt som mulig.
- Valgfritt Overfør plasseringsmalen til kamera stativet for å ta bildet før infestation.
- Overfør larver til hver av de infiserte rettene med Soft touch tang så raskt som mulig. Still inn timeren for ønsket "infestation" tid.
Merk: tidsperioden når larver er forbruker bladet vev er "infestation tid". Dette er noe som kan bestemmes empirisk hjelp av noen test blader/larver før starten av selve infestation. Den valgte "infestation tid" bør være konsistent for alle infiserte blader.
Merk: Larvene skal håndteres forsiktig av en myk tang. 2dre gjennom 4de skikkelsen kan bli forstått forsiktig av deres horn eller midsection. - Observer fôring for å sikre at alle larver spiser. Larver bør legges til/fjernes basert på fôring atferd. Hold lokk på Petri retter så mye som mulig.
Merk: flere larver kan brukes per blad. - Fjern larver fra bladene på slutten av infestation tid. Start tidtakeren for innhøstingen.
- Valgfritt Overfør plasseringsmalen til kamera stativet for å ta bildet etter infestation.
Merk: alle seks bladene i plasseringsmalen høstes på den spesifikke innhøstingen tiden.
5. høsting blader
- Overfør hvert blad til tilsvarende merket rør på slutten av hver høst tid punkt og umiddelbart fryse ved å slippe røret i flytende N2. Oppbevar plante vevet ved-80 ° c til isolasjonen av RNA.
- Gjenta trinn 4 \ u 20125.1 for hvert tidspunkt for innhøsting.
6. behandling av blad vev for analyse av genuttrykk
- Grind den frosne blad vev til et pulver med en micropestle.
- Isoler total RNA og prosess for genuttrykk som tidligere beskrevet22.
7. (valgfritt) estimering Leaf skade
- Visuelt anslå prosent av Leaf skade eller beregne blad området i før-og etter-infestation bilder.
- Mål blad området med programvareverktøy (f. eks Phenophyte)23.
- Beregn prosentandel av skaden fra blad område målinger som
% skade = [(blad området før-blad området etter)/Leaf området før] x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Leaf forbruk definerer suksessen av protokollen. Sunn, nøyaktig iscenesatt larver bør begynne fôring umiddelbart etter plassering på bladet overflaten og fôring bør fortsette i en ganske konsistent måte gjennom infestation tid. I Video 1begynner Larven på toppen å tygge umiddelbart etter plassering og opprettholder en konsistent hastighet mens fôring. Dette er spesielt viktig hvis assaying tidlige genuttrykk hendelser etter infestation. Larven på bunnen brukte ikke noe blad materiale og er et eksempel på et mislykket angrep.
Visuell tilnærmelser under Leaf forbruk overvåkes for å sikre nok skade er produsert. Mengden av blad materiale forbrukes kan beregnes som prosentandel av skaden ved å bruke bilder av blader før og etter infestation. Figur 2 illustrerer de variable utbredelsen av forbruk av ulike utviklingsmessige stadier av M. Sexta larver på ulike typer potet planter. Bladene i figur 2a ble løsrevet fra 2-ukers gamle Nodal-spredte vev kultur planter. Alle bladene i dette tallet er av samme størrelse, men ble utsatt for infestation av ulike stadier av larver i 5 min. figur 2a: i-IV, video 2, video 3, video 4og video 5 illustrere de ulike tallene for forbruk og fôring stiler for hver larvestadiet scenen fra en del av infestation. Dette er nyttig for å bestemme hvor mye skade er mulig å bruke hvert blad og larvestadiet scene kombinasjon og illustrerer grådig natur eldre larver. Bruk av 1ste skikkelsen larver er ikke anbefalt som deres kjakene ikke er utviklet nok til å produsere skade i 5 min infestation vinduet. Det er viktig å merke seg at yngre mer ømme blader avledet fra vev-kultur-dyrket planter er ofte mer spiselig for larver. Basert på disse resultatene, 4de skikkelsen larver ble valgt til å ytterligere vurdere skader på blader fra mer moden, jord dyrket potet planter. Jordsmonnet dyrket planter nærmere omtrentlig de ervervet i feltet. Figur 2b illustrerer omfanget av skaden når tredje og fjerde skikkelsen larver ble brukt til blader løsrevet fra jord-dyrket potet planter. To-ukers-gamle Nodal spredte planter ble transplantert til jord og vokst i ytterligere 3 uker. Skadede blader fra jord dyrket planter falt i tre grupper; 15-20%, 20-30% og 30-40%. De tre bladene i hver gruppe vises for å representere de ulike skade nivåene for hvert område. Bladene fra mer modne jord-dyrket planter trengte flere larver brukt og en lengre infestation tid å nå samme nivå av skade observert i bladene fra yngre Nodal-spredte planter. Disse resultatene illustrerer omfanget av utfall mulig fra vellykket herbivory fra ulike typer planter.
Etter vellykket herbivory er fullført og prosent skade er vurdert, blad vev er analyseres for genuttrykk. Gene Expression resultater bør indikere en robust induksjon eller undertrykkelse av transkripsjoner involvert i responsen på infestation. Figur 3 illustrerer genuttrykket profiler av seks C2H2 transkripsjon faktorer fra en vellykket herbivory eksperiment i frittliggende blader. C2H2 sink finger StZFP2 ble indusert av M. Sexta herbivory i potet i forrige hele anlegget studier24. Selv StZFP2 ble indusert av herbivory i frittstående Leaf analysen, infestation var ikke signifikant i forhold til effekten av avløsning selv. Men to andre StZFP2 Homologs, StZFP5 og StZFP7, ble betydelig indusert på 40 og 80 min post herbivory i forhold til frittliggende kontroller. StLOX3 og StMYC2 er markør gener indusert av både såret og herbivory og indikere involvering av jasmonic acid regulert forsvar trasé. Målet med denne studien var å identifisere infestation-responsive transkripsjon faktorer blant et panel av kandidat gener. Identifikasjonen av to C2H2 sink finger transkripsjon faktorer som er robust responsive til M. Sexta herbivory støtter bruk av frittliggende blader for infestation analyser.
Figur 1: flytskjema for infestation-protokollen. Skjematisk fremstilling av trinnene som inngår i den eksperimentelle arbeidsflyten av infestation delen av protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Leaf skader forårsaket av M. Sexta larver. (A) prosentvis skade på vevs kulturen forlater på hvert larvestadiet trinn over 5 min. romertall i-IV se videoer 2-5 henholdsvis som viser hver skikkelsen fôring på bladet avbildet. (B) spekter av skade på jord-dyrket blader av 4de skikkelsen over 20 min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Gene Expression analyse av blader. Real-Time kvantitativ polymerase kjedere reaksjon (RT-qPCR) genuttrykk analyse av C2H2 sink finger transkripsjon faktorer vises. Gjennomsnittlig transkripsjon nivå er, 2− ΔCT med (ΔCT = CT av test gen-CT av eksogene kontroll gen). Excised kontroll blader i (blå) og excised infiserte blader i (rød) vises ved hvert tidspunkt. Hver verdi er gjennomsnittet av tre biologiske replikerer. Treveis ANOVA ble utført på ΔCt-verdiene. Betydelige forskjeller i kontroll bladene over tid indikeres med store bokstaver. Vesentlige forskjeller i infiserte blader over tid er angitt med små bokstaver. Vesentlige forskjeller mellom kontroll og infiserte blader på samme tidspunkt vises med en stjerne (*). PR > F-verdier var alle mindre enn 0,001, med unntak av StZFP6 kontroll behandling med 0,0086. Feilfelt representerer standardavvik. NCBI tilknytnings numre er: StLOX3-X 96406.1, StZFP2-MK809525, StZFP4-CV 500970.1, StZFP6-DN 587601.1, StZFP7-DN 590005.1. Strå DB tiltredelse tall fra < http://Solanaceae.plantbiology.msu.edu > er StMYC2-PGSC0003DMT400045204, StZFP3-PGSC0003DMT400040144, StZFP5-PGSC0003DMT400040141. Dette tallet er endret fra22. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: videoklipp av larvestadiet fôring. Andre skikkelsen M. Sexta larver fôring (øverst) og ikke fôring (nederst) på et blad fra to uker gamle vev kultur dyrket potet plante. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2: figur 2a videoklipp (i) av larvestadiet fôring. Andre skikkelsen M. Sexta Larven fôring på et blad fra to uker gamle vev kultur dyrket potet plante. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 3: figur 2a videoklipp (II) av larvestadiet fôring. Tredje skikkelsen M. Sexta Larven fôring på et blad fra to uker gamle vev kultur dyrket potet plante. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 4: figur 2a videoklipp (III) av larvestadiet fôring. Fjerde skikkelsen M. Sexta Larven fôring på et blad fra to uker gamle vev kultur dyrket potet plante. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 5: figur 2a videoklipp (IV) av larvestadiet fôring. Femte skikkelsen M. Sexta Larven fôring på et blad fra to uker gamle vev kultur dyrket potet plante. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruk av eksisterende hel plante herbivory metoder er unødvendig å oppnå målet med denne spesielle studien (dvs. skjermen et sett av kandidat gener for deres reaksjon på infestation). Den åpenbare fordel for frittliggende blad raffinement er forkorte tiden det tar å utføre herbivory analyser. Den uhåndterlig natur hele planter med klips bur er eliminert og analysene utføres før, siden planter så unge som 2 uker kan brukes til å høste blader. Det krever også en mye mindre fotavtrykk under fôring og mindre vekst kammer plass; både viktig når disse ressursene er begrenset.
Begrensningen av denne analysen, nemlig avløsning, er oppstått når forsvaret-genet uttrykket er analyseres. Avløsning selv forårsaker et sår respons og det er derfor viktig å vurdere hvilken effekt avløsning har på basal nivåer av forsvar-genet uttrykk. I en studie som involverer simulert herbivory, transkripsjon nivåer av et velkjent forsvar genet protease inhibitor II(PIN2) ble uventet høy i kontroll bladene av frittliggende potet blader trolig på grunn av "såret forårsaket under innsamling av bladet" 25. men anvendelse av insekt Regurgitant fra M. Sexta sterkt forbedrede nivåer av PIN2 Gene Expression. Dette illustrerer behovet for å bruke kontroller for å erte ut effekten av avløsning fra infestation respons.
Frittliggende blad analyser er ofte utført for å spare tid, plass og ressurser. De har blitt brukt i screening for resistens mot Fungal sykdommer i hvete26,27, og insekt resistens i soyabønner28 og kikert29. Analysen er allment akseptert i studiet av patogen som forårsaker sen sykdom på planter i potet30,31. En fersk studie fant at frittstående blad analysene var tilsvarende hele anlegget analyser for å bestemme slutten av sykdom på planter i feltet32.
Lite bevis finnes i litteraturen, men for bruk av frittliggende blader til analysen for forsvar-genet uttrykk. En studie profilert seks forsvar gener som svar på edderkopp midd infestation av frittliggende Lima bønne33. Bladene også produsert flyktige som indusert forsvar responser i nærliggende uninfested blader, en velkjent strategi for forsvar-genet uttrykk i planter34. Til vår kunnskap, ingen tygge insekt herbivory studier hittil utnytte frittliggende blader til analysen for genuttrykk.
Den tidligere definerte infestation responsive C2H2 sink finger, StZFP2 var ikke signifikant indusert av infestation i dagens frittliggende blad analysen. Bortsett fra den åpenbare forskjellen på hele anlegget versus frittliggende blader, benyttet den forrige studien en kontinuerlig type infestation der anlegget vev ble analyseres for genuttrykk umiddelbart etter fjerning av Larvene24. Dette er forskjellig fra den usammenhengende type infestation benyttet i dagens studie, der larvestadiet fjerning ble etterfulgt av en hvileperiode før Leaf Harvest. I løpet av denne utvinningen perioden, StZFP2 nivåer reduseres raskt og kan resultere i et lavere nivå av StZFP2 induksjon. Det kan også være andre så langt udefinert systemiske signalering komponenter som kan bidra til utvidet induksjon observert i hele anlegget studien. En annen mulighet er at StZFP2 transkripsjoner kunne ha toppet før 20 min høste tid. Det er imidlertid klart at den imponerende induksjon av StZFP5 og StZFP7 transkripsjoner gjør denne typen infestation protokollen relevant. En annen begrensning av dagens metode vil være manglende evne til å bruke root fôring larver som mais rootworm. Det ville heller ikke være egnet når hele anlegget kommunikasjon som root til Leaf signalnettverk35 eller signalering fra systemisk blader36,37 blir studert.
Suksessen til denne protokollen avhenger sterkt av kvaliteten og nøyaktig oppsetning av Larven som brukes i eksperimentet. Oppdra ferdigheter og grunnleggende kunnskaper om M. Sexta oppførsel er nyttig, men ikke kritisk. Men å få sunne, hensiktsmessig iscenesatt larver kan direkte påvirke fôring suksess. Larvene går inn i en Quiescent periode som kommer forut for hver larvestadiet molt der de ikke mater21. Åpenbart vil slike larver ikke skade blad vev. Den ideelle tiden for å bruke larver er like etter en molt. En developmentally iscenesatt kohort av insekter av en bestemt larvestadiet scenen vil også forbedre reproduserbarhet av genet uttrykk som planter kan reagere forskjellig på hvert utviklingstrinn scenen.
Tilgang til en insectary ville være ideelt for tilførsel av larver. M. Sexta egg eller larver kan også bestilles fra kommersielle kilder38,39 og oppdratt på diett eller plantemateriale til riktig stadium. Det finnes også flere nettbaserte verktøy som kan bidra til å identifisere hver skikkelsen40,41,42. Larver oppdratt på diett vil ikke inneholde plante spesifikke komponenter som mikrobiell symbionter ervervet av larver oppdratt på planter43. Gen uttrykks profiler kan endres hvis disse komponentene mangler. Larver kan delvis eller helt oppdratt på verts anlegget hvis disse effektene er viktige for studien. Tilbakeholdt mat fra insekter et par timer før fôring eksperimenter kan også forbedre fôring atferd. Felt-innsamlede larver kan også være robuste og fordelaktig som de har vært utsatt for riktig trofiske nivåer, men som legger til en annen variabel som kan eller ikke være egnet for alle studier.
Produksjonen av sunne, insekt-og plantevernmidler-frie planter er også kritisk. Planter med virus, insekter og sopp organismer vil innføre forvirrende faktorer og presentere en utfordring i å skaffe reproduserbar data.
Mange larvestadiet larvestadiene, potet plante aldre og blad størrelser kan kombineres for å tilpasse protokollen for en bestemt type studie. Lengden på infestation og høste ganger kan også justeres. Potensielt kan mange andre plante-insekt interaksjoner bli studert ved hjelp av frittstående blader hvis hele plante observasjoner brukes som en Baseline. Den frittliggende Leaf analysen er et relevant og verdifullt alternativ til hele anlegget herbivory studier for å analysere genuttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Bob Farrar og Alexis Park for å gi insekter som brukes i denne studien og for deres ekspertise i larvestadiet regi. Ytterligere takk til Michael Blackburn og SAIKAT Ghosh for kritisk gjennomgang av manuskriptet.
Omtale av handelsnavn eller kommersielle produkter i denne publikasjonen er utelukkende for det formål å gi spesifikk informasjon og innebærer ikke anbefaling eller støtte fra det amerikanske Landbruksdepartementet.
USDA er en lik mulighet leverandør og arbeidsgiver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R. Jr, Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- Carolina Biological Supply Company. Hornworms. , Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018).
- Great Lakes Hornworm. Products. , Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018).
- The Board of regents of the University of Wisconsin System. Manduca. , Available from: http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/ (2018).
- Raising Manduca sexta. , Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018).
- Berkley, C. Teach life cycles with the tobacco hornworm. , Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018).
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
