Summary
IDBac er en åpen-kildekode Mass massespektrometri-baserte bioinformatikk rørledning som integrerer data fra både intakt protein og spesialiserte metabolitten Spectra, samlet på celle materiale skrapet fra bakterielle kolonier. Rørledningen gjør det mulig for forskere å raskt organisere hundrevis til tusenvis av bakterielle kolonier i antatte taksonomisk grupper, og ytterligere differensiere dem basert på spesialiserte metabolitten produksjon.
Abstract
For å visualisere forholdet mellom bakteriell fylogeni og spesialisert metabolitten produksjon av bakterielle kolonier som vokser på næringsstoffer agar, utviklet vi IDBac-en lav pris og høy gjennomstrømming matrise-assistert laser desorpsjon/ionisering Time-of-Flight masse massespektrometri (MALDI-TOF MS) bioinformatikk rørledning. IDBac programvare er utviklet for ikke-eksperter, er fritt tilgjengelig, og i stand til å analysere noen få til tusenvis av bakterielle kolonier. Her presenterer vi prosedyrer for utarbeidelse av bakterie kolonier for MALDI-TOF MS analyse, MS instrument drift, og databehandling og visualisering i IDBac. Spesielt instruerer vi brukerne hvordan å klynge bakterier i dendrograms basert på protein MS fingeravtrykk og interaktivt opprette metabolitten Association Networks (MANs) fra spesialiserte metabolitten data.
Introduction
En stor barriere for forskere som studerer bakteriell funksjon er evnen til raskt og samtidig vurdere taksonomisk identiteten til en mikroorganismen og dens evne til å produsere spesialiserte metabolitter. Dette har forhindret betydelige fremskritt i å forstå forholdet mellom bakteriell fylogeni og spesialisert metabolitten produksjon i de fleste bakterier isolert fra miljøet. Selv om MS-baserte metoder som bruker protein fingeravtrykk for å gruppere og identifisere bakterier er godt beskrevet1,2,3,4, disse studiene har generelt vært utført på små grupper av isolat, på en art-spesifikk måte. Viktigere, informasjon om spesialiserte metabolitten produksjon, en stor pådriver for mikrobiell funksjon i miljøet, har vært kommunefritt i disse studiene. Silva et al.5 nylig gitt en omfattende historie detaljering UNDERUSE av MALDI-TOF MS å analysere spesialiserte metabolitter og mangel på programvare for å avlaste dagens bioinformatikk flaskehalser. For å løse disse svakhetene, skapte vi IDBac, en bioinformatikk rørledning som integrerer både lineære og reflectron moduser MALDI-TOF MS6. Dette gjør at brukerne raskt visualisere og differensiere bakteriell isolerer basert på både protein og spesialiserte metabolitten MS fingeravtrykk, henholdsvis.
IDBac er kostnadseffektiv, høy gjennomstrømming, og designet for lå brukeren. Det er fritt tilgjengelig (chasemc.github.io/IDBac), og krever bare tilgang til en MALDI-TOF masse spektrometer (reflectron modus vil være nødvendig for spesialiserte metabolitten analyse). Prøve forberedelser er avhengig av den enkle "utvidet direkte overføring"-metoden7,8 og data samles inn med etterfølgende lineære og reflectron oppkjøp på ett enkelt MALDI sted. Med IDBac, er det mulig å analysere antatte fylogeni og spesialisert metabolitten produksjon av hundrevis av kolonier på under fire timer, inkludert prøve utarbeidelse, datainnsamling, og data visualisering. Dette presenterer en betydelig tid og kostnader fordel over tradisjonelle metoder for å identifisere bakterier (for eksempel gen sekvensering), og analysere metabolske output (flytende kromatografi-Mass massespektrometri [LCMS] og lignende kromatografiske metoder).
Ved hjelp av data innhentet i lineær modus analyse, sysselsetter IDBac hierarkisk Clustering å representere Relatedness av protein Spectra. Siden Spectra for det meste representerer ionisert ribosomal proteiner, gir de en representasjon av Fylogenetiske mangfoldet stede i en prøve. I tillegg inkorporerer IDBac reflectron modus data for å vise spesialiserte metabolitten fingeravtrykk som metabolitten Association Networks (MANs). MANs er bipartite nettverk som gir mulighet for enkel visualisering av delte og unike metabolitten produksjon mellom bakteriell isolerer. Den IDBac plattformen lar forskere til å analysere både protein og spesialiserte metabolitten data i tandem, men også individuelt hvis bare én data-type er ervervet. Viktigere, IDBac behandler rådata fra bruker og Xiamen instrumenter, samt txt, tab, CSV, mzXML, og mzML. Dette eliminerer behovet for manuell konvertering og formatering av datasett, og reduserer risikoen for bruker feil eller mishandling av MS-data betraktelig.
Protocol
1. utarbeidelse av MALDI matrise
- Forbered 10 mg/mL MALDI-grade, og/eller recrystallized α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) i MS-grade løsemidler: 50% acetonitril (ACN), 47,5% vann (H2O), 2,5% trifluoroacetic acid (TFA). Eksempel: 100 μL oppløsning = 50 μL ACN + 47,5 μL H2O + 2,5 μL TFA + 1 mg CHCA
- Forbered minst 1 μL av matrise løsning per MALDI plate flekk og Vortex eller sonikere til i løsning (ca 5 min sonikering eller ingen synlige faste stoffer).
FORSIKTIG: TFA er en sterk syre som skal håndteres i en kjemisk røyk hette mens du bruker riktig personlig verneutstyr, da det kan skade hud, øyne og luftveier med kontakt eller innånding.
Merk: CHCA er hygroskopisk og lysfølsom og bør oppbevares i gult hetteglass i en desikator. Det er mange MALDI Matrix alternativer tilgjengelig. CHCA er mest vanlig for protein profilering av bakterier, men fungerer også for spesialiserte metabolitten analyse. Matrix utvalg avhenger av individuelle bruker/eksperiment behov.
- Forbered minst 1 μL av matrise løsning per MALDI plate flekk og Vortex eller sonikere til i løsning (ca 5 min sonikering eller ingen synlige faste stoffer).
2. utarbeidelse av MALDI mål plater
Merk: se sauer et al.7for mer informasjon.
- Skyll MALDI tallerken med metanol (HPLC eller høyere) og tørk med myke papirkluter. Ikke bruk slipe børster når du rengjør mål platene, da dette kan skade overflaten på mål platen permanent.
- Tildel protein og spesialiserte metabolitten calibrant flekker. Organiser kalibreringspunkter jevnt over utvalgs populasjonen for å gjøre rede for MALDI-uregelmessigheter og instrument drift over tid. Tildel et passende antall Media/matrise-blank spots for studien; disse flekkene vil inneholde bare Media og matrise, eller bare matrise.
- Ved hjelp av en steril tannpirker, overføre en liten del av en bakteriell koloni til riktig sted på MALDI plate. Spre bakterie kolonien jevnt over stedet. Stedet skal vises så flatt som mulig.
Merk: det vil være lettere å flate bakterie kolonier som er mer mucoid/amorfe. For mer stive/solide kolonier, unngå å etterlate synlige klynger av celle massen på MALDI-stedet (figur 1).
Figur 1: MALDI-skiltet som viser to forskjellige isolat før du legger maursyre syre og MALDI matrise (topp 3 spots- Bacillus Sp.; nederst 3 flekker- Streptomyces Sp.). For begge representerer kolonne 3 overflødig prøve; kolonne 2 representerer riktig mengde prøve; kolonne 1 representerer utilstrekkelig prøve for MALDI-analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Forbered en matrise/Media kontroll ved hjelp av en steril tannpirker for å overføre en minimal mengde agar/Media på det aktuelle stedet (e) på MALDI plate.
- Overlay 1 μL av 70% masse massespektrometri grade maursyre acid på hver sample spot, inkludert Matrix kontroll flekker. La syre til lufttørke helt i en kjemisk avtrekks hette (ca. 5 min).
FORSIKTIG: maursyre yre er en etsende kjemikalie og bør håndteres i kjemiske avtrekks hetter. Det kan skade luftveiene ved innånding. - Tilsett 1 μL av den tilberedte MALDI Matrix-løsningen på hvert prøvepunkt, samt til Matrix/Media kontroll flekker. Tillat matrise løsning å lufttørke helt (ca 5 min).
Merk: det er mulig å lagre platen i en desikator, i mørket, til den kan analyseres på en MALDI-TOF masse spektrometer. Tillatte lagringstider kan variere avhengig av prøve stabiliteten. - Tilsett 0,5 – 1,0 μL calibrant på de tildelte kalibrerings punktene, etterfulgt av 1 μL MALDI Matrix-løsning. Pipetter den resulterende løsningen opp og ned for å blande. La alle flekker lufttørke helt før innføring i MALDI-TOF masse spektrometer.
Merk: proteinet og spesialiserte metabolitten calibrants bør legges innen 30 min av MALDI analyse, som begge er mottakelige for fornedrelse.
3. innhenting av data
Merk: de generelle parametrene for datainnhenting er listet opp i tabell 1.
| Parameteren | Protein | Spesialisert metabolitten |
| Masse Start (da) | 1920 | 60 |
| Mass end (da) | 21000 | 2700 |
| Masse utslag (da) | 1900 | 50 |
| Skudd | 500 | 1000 |
| Frekvens (Hz) | 2000 | 2000 |
| Laser størrelse | Store | Medium |
| MaxStdDev (ppm) | 300 | 30 |
Tabell 1.
- Etter protokollene som er spesifikke for instrumentet som brukes, sette opp både protein og spesialiserte metabolitten kalibreringer.
- Test noen separate mål punkter for å finne den optimale laser kraften og detektor forsterkningen som skal brukes når du anskaffer Spectra (dette vil variere fra dag til dag og etter instrument).
Merk: figur 2a og figur 3a Vis optimal Spectra, mens figur 2D og figur 3D er eksempler på god kvalitet Spectra.
Figur 2: Eksempel protein Spectra viser effekten av å endre laser kraft og detektor gevinst. Spectra kvalitet er best i panel A, og minsker til utilstrekkelig Spectra kvalitet i paneler C og D. Mens spekteret i panel B kan resultere i brukbare topper, viser panel A optimale data. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Eksempel spesialiserte metabolitten Spectra viser effekten av å endre laser kraft og detektor gevinst. Spectra kvalitet er best i panel A og minsker til utilstrekkelig Spectra kvalitet i paneler C og D. Mens spekteret i panel B kan resultere i brukbare topper, viser panel A optimale data. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Tilegne seg Spectra, sparer protein Spectra i en mappe og spesialisert metabolitten Spectra inn i en andre, separat mappe.
4. rengjøring av MALDI mål plate (tilpasset fra sauer et al.7)
- Fjern MALDI mål platen fra holderen og skyll den med aceton.
- Vask med en ikke-slipende flytende såpe for å fjerne spor proteiner og lipider, og myke papirkluter/Soft-tann tannbørste.
- Skyll med de-ionisert vann i ca 2 min til helt fjerne såpe.
- Sonikere mål platen i vann (HPLC-klasse eller høyere) i 5 minutter.
- Skyll mål platen med vann (HPLC-klasse eller høyere).
- Skyll mål platen med metanol (HPLC-klasse eller høyere).
5. installere IDBac-programvaren
- Last ned IDBac programvare.
Merk: permanente, versjonsangitte sikkerhetskopier er også tilgjengelig for nedlasting (se tabell over materialer). - Dobbeltklikk på den nedlastede "Install_IDBac. exe" for å starte installasjonsprogrammet og følg instruksjonene på skjermen.
6. starter med RAW data
Merk: detaljerte forklaringer og instruksjoner for hvert databehandlings trinn er innebygd i IDBac, men de viktigste analysene og interaktive inngangene er beskrevet nedenfor.
- Dobbeltklikk skrivebordssnarveien IDBac for å starte IDBac. IDBac vil åpnes i kategorien Innledning som standard.
- Bruk knappen se etter oppdateringer for å sikre at den nyeste versjonen av IDBac er i bruk (krever Internett-tilgang). Hvis en nyere versjon er tilgjengelig, vil IDBac automatisk laste ned og installere oppdateringen, hvoretter IDBac vil be om å bli startet på nytt.
- Falle i staver på igangsetting med ømt punkt data tab og foretrekker fra menyen det type av data å bli anvendt med IDBac; fortsette ved å følge instruksjonene i appen.
- Når du konfigurerer konverteringen og behandlingen av datafiler, legger du inn et beskrivende navn for eksperimentet der du blir bedt om det (se Figur 4). Eksperimenter vil senere vises alfabetisk, så en nyttig strategi er å starte Eksperimentnavn med en gruppe-attributt (for eksempel "Bacillus-trials_experiment-1"; "Bacillus-trials_experiment-2").
Figur 4: IDBac data konvertering og forbehandling trinn. IDBac omdanner ømt punkt Spectra inn i åpen mzML formatter og butikker mzML, topp lister, og eksemplar beskjed inne en data bank for hver eksperiment. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
7. arbeid med tidligere eksperimenter
- Når du har konvertert filer og behandlet dem med IDBac, eller når som helst som ønsker å Reanalyser et eksperiment, navigerer du til siden for arbeid med tidligere eksperimenter og velger et eksperiment du vil arbeide med (figur 5).
Figur 5: «arbeid med tidligere eksperimenter»-siden. Bruk IDBac "arbeid med tidligere eksperimenter"-siden for å velge et eksperiment for å analysere eller endre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Valgfritt Legg til informasjon om eksempler ved hjelp av menyen Klikk her for å endre det valgte eksperimentet. Angi informasjon i det automatisk utfylte regnearket, og trykk Lagre (figur 6). Dette alternativet lar brukeren fargekode data under analyser.
Figur 6: input eksempel informasjon. I «arbeid med tidligere eksperimenter»-siden kan brukere legge inn informasjon om eksempler som taksonomisk identitet, samlingssted, isolasjons betingelser osv. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Valgfritt Overfør alle, eller et delsett av prøver til et nytt eller annet eksperiment, ved å klikke på Overfør prøver fra tidligere eksperimenter til nye/andre eksperimenter og følge instruksjonene som følger med (figur 7).
Figur 7: Overfør data. Siden «arbeid med tidligere eksperimenter» inneholder muligheten til å overføre data mellom eksisterende eksperimenter og nye eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Når du er klar til å starte analysen, må du kontrollere at eksperimentet du arbeider med, er valgt. Velg enten protein dataanalyse eller små molekyl dataanalyse.
8. sette opp protein dataanalyse og lage speilet tomter
- Hvis du analyserer protein data, må du først navigere til siden protein dataanalyse . Velg peak-plukking innstillinger og evaluere protein Spectra av prøvene via de viste speilet tomter (Figur 8).
Merk: i speilet tomter, betyr en rød topp tilstedeværelsen av at peak bare i øverste spektrum, mens blå topper representerer de som forekommer i begge Spectra.
Figur 8: Velg hvordan topper beholdes for analyse. Når du har valgt et eksperiment for å analysere, besøke "protein data analyse" siden og deretter åpne "Velg hvordan topper er beholdt for analyse"-menyen kan brukerne velge innstillinger som signal-til-støy-forhold for å beholde topper. Speilet plottet (eller dendrogram) som vises, oppdateres automatisk for å gjenspeile de valgte innstillingene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Juster prosentandelen av replikerer der en topp må være til stede for at den skal inkluderes for analyser (for eksempel hvis terskelen er satt til 70% og en topp oppstår i minst 7 av 10 replikerer, vil det bli inkludert).
- Bruke speilet plott som visuell veiledning, justere signal til støy cut-off som beholder de mest "ekte" topper og minst støy, og bemerker at flere replikerer og en høyere "prosentvis peak tilstedeværelse" verdi vil tillate valg av et lavere signal til støy cut-off.
- Angi nedre og øvre m/z- cutoffs, som dikterer omfanget av masse verdier i hvert spektrum som skal brukes i videre analyser av IDBac.
9. klynger prøver med protein data
- Velg Dendrogram -fanen i siden protein data analyse . Dette gjør det mulig for gruppering prøver i en dendrogram i henhold til bruker-valgte avstandsmålinger og klynger algoritmer.
- Klikk på Velg prøver på menyen, og følg instruksjonene for å velge prøver som skal inkluderes i analysene. Bare prøver som inneholder protein Spectra vises i boksen tilgjengelige eksempler (figur 9).
Figur 9: Velg prøver fra det valgte eksperimentet som skal inkluderes i den viste dendrogram. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bruk standardverdiene eller, under Velg innstillinger for klynger, Velg ønsket avstand og klynger algoritmer som skal brukes til generering av dendrogram.
- Velg tilstedeværelse/fravær som inn data. Hvis du er trygg på topp høydene i prøvene (f.eks. etter å ha utført en studie for å vurdere variasjon i topp intensitet), velger du intensitet som inn data.
Merk: på tidspunktet for utgivelsen, IDBac gir fleksibilitet i innstillingene for klynger, avhengig av brukere å velge de riktige kombinasjonene. Hvis ukjent med disse alternativene, er det foreslått å pare enten A: "cosinus" avstand, og "gjennomsnittlig (UPGMA)" Clustering; eller B: "euklidsk" avstand, og "Ward. D2" Clustering. - Hvis du vil vise bootstrap verdier på dendrogram, skriver du inn et tall mellom 2 og 1000 under håret.
- Når du rapporterer resultater, kopierer du teksten i avsnittet forslag til rapportering av protein analyse . Dette gir de brukerdefinerte innstillingene som genererte den bestemte dendrogram.
10. tilpasse protein dendrogram
- Hvis du vil begynne å tilpasse dendrogram, åpner du Juster dendrogram -menyen (Figur 10).
Figur 10: Juster dendrogram. IDBac gir noen alternativer for å endre hvordan dendrogram ser ut, kan disse finnes i menyen "Juster Dendrogram". Dette inkluderer farging grener og etiketter av k-midler, eller ved å "skjære" dendrogram på en bruker-gitt høyde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Hvis du vil fargelegge dendrogram linjer og/eller etiketter, velger du den aktuelle knappen: Klikk for å endre linjer , eller Klikk for å endre etiketter og velge ønskede alternativer.
- Hvis du vil plotte informasjon fra regnearket ved siden av dendrogram (se trinn 7,2), velger du knappen Inkluder informasjon om eksempler. Dette vil åpne et panel der en kategori (kolonne i regnearket) vil selv fylle ut basert på de angitte verdiene (Figur 11).
Figur 11: innlemme informasjon om prøver. Innenfor "Juster Dendrogram" menyen er alternativet "innlemme info om prøver". Hvis du velger dette, kan du tegne inn informasjon om eksempler ved siden av dendrogram. Eksempel informasjon er inn data i «arbeid med tidligere eksperimenter»-siden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
11. sett prøver fra et eget eksperiment inn i dendrogram
- Hvis du vil sette inn prøver fra et annet eksperiment, velger du menyknappen Sett inn prøver fra et annet eksperiment. Følg instruksjonene i det nylig åpnede panelet (Figur 12).
Figur 12: Sett inn prøver fra en annen eksperiment meny. Noen ganger er det nyttig å sammenligne prøver fra et annet eksperiment. Bruk menyen Sett inn prøver fra et annet eksperiment for å velge eksempler som skal inkluderes i dendrogram som vises for øyeblikket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
12. analysere spesialiserte metabolitten data og metabolitten forening nettverk (MANs)
- Fortsett til siden for metabolitten tilknytnings nettverk (lite molekyl) . Denne siden gjør det mulig for data visualisering av prinsippet komponenter analyse (PCA) og MANs, som bruker bipartite nettverk for å vise korrelasjon av små molekyl m/z verdier med prøver.
- Hvis et protein dendrogram ble opprettet (avsnitt 9), vil det også bli vist på denne siden. Klikk og dra på dendrogram for å utheve utvalgte prøver av interesse som skal analyseres. Hvis ingen prøver er uthevet eller ingen protein dendrogram ble opprettet, en mann av en enten en tilfeldig delsett eller alle prøvene vises, respektfullt (figur 13).
Figur 13: liten molekyl data analyse»-siden. Hvis en dendrogram ble opprettet fra protein Spectra, vil det bli vist i "Small molekylet data Analysis" side. Denne siden vil også vise metabolitten førsteamanuensis Networks (MANs) og prinsipp komponenter analyse (PCA) for små molekyl data. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- For å trekke en matrise/Media blank i MAN, åpne menyen Velg en sample til subtrahere og velg det aktuelle eksempelet som skal brukes som en blank.
- Åpne menyen Vis/Skjul mann-innstillinger for å velge ønskede verdier for prosent av topp tilstedeværelse i replikerer, signal til støy og øvre og nedre masse cutoffs, slik det ble gjort for protein Spectra i avsnitt 9. Bruk de små molekylet speilet tomter for å veilede valg av disse innstillingene.
- Velg "Last ned gjeldende nettverksdata" for å lagre dataene til mannen som vises for øyeblikket. Disse dataene kan brukes i nettverksanalyse programvare enn IDBac.
- Hvis du vil rapportere resultater, kopierer du teksten i avsnittet forslag til rapportering av man-analyse . Dette gir de brukerdefinerte innstillingene som brukes til å generere den opprettede MAN.
13. deling av data
- Hver IDBac "eksperiment" er lagret som en enkelt SQLite database. Den inneholder de konverterte mzML rå Spectra, oppdagede topper, og all informasjon om brukerinndata om prøver. Derfor, for å dele et IDBac eksperiment bare dele SQlite-fil som har samme navn som eksperimentet (filplasseringen vises på arbeider med forrige eksperimenter siden).
Representative Results
Vi analyserte seks stammer av Micromonospora chokoriensis og to stammer av Bacillus subtilis, som tidligere var karakterisert6, ved hjelp av data tilgjengelig på doi: 10.5281/zenodo. 2574096. Følgende retninger i starter med RAW data tab, valgte vi alternativet Klikk her for å konvertere bruker filer og fulgte IDBac-forutsatt instruksjoner for hvert datasett (figur 14).
Etter automatisert konvertering og forbehandling/peak-topp trinnene ble fullført, fortsatte vi å lage en ny kombinert IDBac eksperiment ved å overføre prøver fra to eksperimenter i et enkelt eksperiment som inneholder både Bacillus og Micromonosopora prøver (Figur 15). Den resulterende analysen involvert sammenligne protein Spectra bruke speilet tomter, som avbildet i Figur 16, som var nyttig for å evaluere Spectra kvalitet og justere peak-plukking innstillinger. Figur 17 viser en skjermdump av proteinet Clustering resultater med standardinnstillingene valgt. Dendrogram ble farget ved å justere terskelen på plottet (vises som en prikket linje). Av notatet er det klare skillet mellom slekter, med både M. chokoriensis og B. subtilis isolerer klynger separat.
Figur 18, Figur 19, og figur 20 fremheve evnen til å generere MANs av bruker-utvalgte regioner ved å klikke og dra over proteinet dendrogram. Med dette var vi i stand til å raskt skape MANs å sammenligne bare B. subtilis stammer(figur 18), bare M. chokoriensis stammer (Figur 19), og alle stammene samtidig (figur 20). Den primære funksjon av disse nettverkene er å gi forskere en bred oversikt over graden av spesialiserte metabolitten overlapping mellom bakterier. Med disse dataene i hånden, forskere har nå kapasitet til å ta informerte beslutninger fra bare en liten mengde materiale skrapet fra en bakteriell koloni.
Figur 14: Spectra prosessering. Nedlastede bruker autoFlex Spectra ble konvertert og behandlet ved hjelp IDBac. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 15: kombinert IDBac eksperimentet. Fordi Micromonospora og Bacillus Spectra ble samlet på ulike MALDI mål plater, de to eksperimentene ble deretter kombinert i et enkelt eksperiment-"Bacillus_Micromonsopora". Dette ble gjort i "arbeid med tidligere eksperimenter"-fanen, følgende retninger i menyen "Overfør prøver fra tidligere eksperimenter til nye/andre eksperimenter". Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 16: sammenligning. Micromonspora og Bacillus Spectra ble sammenlignet ved hjelp av speilet tomter innenfor "protein data analyse" side. Til syvende og sist ble standard topp innstillinger valgt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 17: hierarkisk gruppering. Hierarkisk klynging, bruker standardinnstillinger, riktig gruppert Bacillus og Micromonospora isolerer. Dendrogram var farget av "cutting" dendrogram på en vilkårlig høyde (vises som en stiplet-linje) og 100 håret brukes til å vise tillit i forgrening. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 18: man opprettet ved å velge Bacillus Sp. stammer fra proteinet dendrogram viste differensial produksjon av spesialiserte metabolitter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 19: man opprettet ved å velge de seks Micromonospora Sp. stammer fra proteinet dendrogram viste differensial produksjon av spesialiserte metabolitter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 20: Man of Bacillus Sp. og Micromonospora Sp. stammer som viser en differensiell produksjon av spesialiserte metabolitter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Den IDBac protokollen detaljer bakteriell protein og spesialiserte metabolitten datainnsamling og analyse av opptil 384 bakteriell isolerer i 4 timer av en enkelt forsker. Med IDBac er det ikke nødvendig å trekke ut DNA fra bakteriell isolerer eller generere spesialiserte metabolitten ekstrakter fra flytende gjæring kjøttkraft og analysere dem ved hjelp av kromatografiske metoder. I stedet, protein og spesialisert metabolitten data er samlet inn ved å spre materiale fra bakterielle kolonier direkte på en MALDI mål plate. Dette reduserer betydelig tid og kostnader forbundet med alternative teknikker som 16S rRNA gen sekvensering og LCMS9.
Det er viktig å legge en matrise blank og kalibrering flekker til MALDI plate, og vi anbefaler å bruke et passende antall replikerer for å sikre reproduserbarhet og statistisk tillit. Antallet replikeres vil bli eksperiment avhengig. For eksempel, hvis en bruker har til hensikt å differensiere tusenvis av kolonier fra en samling av miljømessige mangfold plater, færre replikerer kan være nødvendig (vår Lab samler tre tekniske replikerer per koloni). Alternativt, hvis en bruker ønsker å opprette en egendefinert database av stammer fra bestemte bakterielle arter å raskt bestemme sub-arter klassifikasjoner av ukjent isolat, deretter flere replikerer er hensiktsmessig (vår Lab samler åtte biologiske replikerer per eller belastning).
IDBac er et verktøy for raskt å skille svært relaterte bakterielle isolerer basert på antatte taksonomisk informasjon og spesialiserte metabolitten produksjon. Det kan utfylle eller tjene som en forløper til ortogonale metoder som i dybden genetiske analyser, studier som involverer metabolitten produksjon og funksjon, eller karakterisering av spesialiserte metabolitten struktur av Nuclear magnetisk resonans spektroskopi og/eller LC-MS/MS.
Specialized metabolitten produksjon (IDBac MANs) er svært utsatt for bakterielle vekstforhold, spesielt ved hjelp av ulike medier, som er en potensiell begrensning av metoden. Men disse egenskapene kan utnyttes av brukeren, som IDBac kan lett generere MANs viser forskjellene i spesialiserte metabolitten produksjon under en rekke vekstforhold. Det er viktig å merke seg at mens spesialiserte metabolitten fingeravtrykk kan variere fra vekst tilstand, har vi tidligere vist at protein fingeravtrykk fortsatt relativt stabilt på tvers av disse variablene (se Clark et al.6). Når du arbeider med miljømessige mangfold plater, anbefaler vi rensing bakteriell isolat før analyse for å redusere mulige bidrag fra nabokommunene bakteriell cross-talk.
Til slutt, mangelen på en søkbar offentlig database med protein MS fingeravtrykk er en stor brist i bruk av denne metoden for å klassifisere ukjente miljømessige bakterier. Vi opprettet IDBac med dette i tankene, og inkluderte automatisk konvertering av data til et Community-akseptert Open-Source format (mzML)10,11,12 og utviklet programvaren for å tillate søking, deling og opprettelse av egendefinerte databaser. Vi er i ferd med å skape en stor offentlig database (> 10000 fullt karakterisert stammer), som vil tillate klassifisering av noen isolerer til arten-nivå, inkludert lenker til GenBank tiltredelse tall når det er tilgjengelig.
IDBac er åpen kildekode og koden er tilgjengelig for alle å tilpasse sine dataanalyse og visualisering behov. Vi anbefaler at brukerne Rådfører seg med en omfattende mengde litteratur (sauer et al.7, Silva et al.5) for å hjelpe til med å støtte og designe sine eksperimentelle mål. Vi arrangerer et forum for diskusjon på: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac og et middel til å rapportere problemer med programvaren på: https://GitHub.com/chasemc/IDBacApp/Issues.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17; Det islandske forskningsfondet Grant 152336-051; og University of Illinois i Chicago oppstart midler. Også, vi takker følgende bidragsytere: Dr. Amanda Bulman for hjelp med MALDI-TOF MS protein oppkjøpet parametere; Dr. Terry Moore og Dr. Atul Jain for recrystallizing Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid Matrix (CHCA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher | 60-002-65 | LC-MS Ultra CHROMASOLV |
| Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument | Bruker Daltonics | ||
| Bruker Daltonics Bacterial test standard | Fisher | NC0884024 | Bruker Daltonics 8604530 |
| Bruker Peptide Calibration standard | Fisher | NC9846988 | Bruker Daltonics 8206195 |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | 99.5+%, Optima LC/MS Grade |
| MALDI-TOF target Plate | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemical | A456-500 | Optima LC/MS Grade |
| Toothpicks | any is ok | ||
| Trifluoroacetic acid | Fisher | AC293810010 | 99.5%, for biochemistry, ACROS Organics |
| Water | VWR | 7732-18-5 | LC-MS |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | 28166-41-8 | (C2020-25G) ≥98% (TLC), powder |
References
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
- Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).
- Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).
- Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists. Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).
- Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis. Planta Medica. 82, 671-689 (2016).
- Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).
- Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).
- Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., Böttger, E. C., Hombach, M. Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).
- Schumann, P., Maier, T. MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria. Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).
- Chambers, M. C., Maclean, B., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).
- Martens, L., Chambers, M., et al. mzML-a community standard for mass spectrometry data. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).
