Ce protocole décrit les méthodes in vivo et ex vivo pour visualiser et caractériser pleinement les vaisseaux hyaloïdes, un modèle de régression vasculaire dans les yeux de souris, utilisant la tomographie de cohérence optique et l'angiographie de fluorescein de fundus pour l'imagerie en direct et ex vivo l'isolement et la monture plate subséquente de hyaloid pour l'analyse quantitative.
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Article de méthode
Évaluation et caractérisation des navires hyaïdis chez les souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans l'œil, les vaisseaux hyaloid embryonnaires nourrissent la lentille et la rétine en développement et régressent lorsque les vaisseaux rétiniens se développent. La régression persistante ou échouée des vaisseaux hyaloïdes peut être vue dans des maladies telles que le vitré primaire hyperplastique persistant (PHPV), menant à un chemin de lumière obstrué et à la fonction visuelle altérée. Comprendre les mécanismes sous-jacents à la régression des vaisseaux hyaïdides peut conduire à de nouvelles connaissances moléculaires dans le processus de régression vasculaire et de nouvelles façons potentielles de gérer les maladies avec des vaisseaux hyaloïdes persistants. Ici nous décrivons les procédures pour l'hyaloïde d'imagerie chez les souris vivantes avec la tomographie optique de cohérence (OCT) et l'angiographie de fluorescein de fundus (FFA) et un protocole technique détaillé de l'ex vivo d'hyaloïde isolant et plat-montage pour l'analyse quantitative. Des souris knock-out de protéine 5 (LRP5) liées aux récepteurs de lipoprotéines de faible densité ont été utilisées comme modèle expérimental de vaisseaux hyaloïdes persistants, pour illustrer les techniques. Ensemble, ces techniques peuvent faciliter une évaluation approfondie des vaisseaux hyaloïdes comme modèle expérimental de régression vasculaire et des études sur le mécanisme des vaisseaux hyaloïdes persistants.
Introduction
L'approvisionnement en sang dans l'œil est essentiel pour assurer le développement normal de la rétine et des tissus oculaires environnants et pour équiper une fonction visuelle appropriée. Il y a trois lits vasculaires dans l'oeil : la vascularisation rétinienne, la choroïde, et un réseau circulatoire embryonnaire transitoire des vaisseaux hyaloïdes. Le développement de la vascularisation oculaire nécessite une coordination spatiale et temporelle tout au long de l'embryogenèse et de la maturation des tissus. Parmi les trois lits vasculaires, la vascularisation hyaloïde est le premier système fonctionnel d'approvisionnement en sang à fournir la nutrition et l'oxygène ....
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Protocole
Tous les animaux ont été traités conformément à la Déclaration de l'Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l'utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle pour des expériences animales, conformément aux Lignes directrices des National Institutes of Health ( NIH) concernant les soins et l'utilisation des animaux pour des procédures expérimentales et les règlements énoncés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) à l'Hôpital pour enfants de Boston. Lrp5-/- souris (stock no 005823; Jackson Laboratory) et son type sauvage (WT) contrôlent les souris C57BL/6J (stock no 00066....
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Résultats
Imagerie in vivo de vaisseaux hyaloïdes chez des souris vivantes
Figure 3 A révèle des vues transversales des images OCT pour la rétine et les tissus hyaloid chez les souris WT et Lrp5de 3 mois, un modèle animal avec hyaloïde persistant. L'oeil de WT montre l'absence de tissu hyaloïde, alors que l'oeil de Lrp5-/-montre deux vaisseaux hyaloïdes persistants dérivés de la tête de nerf optique. Figu.......
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Discussion
Les techniques d'évaluation et de caractérisation des vaisseaux hyaloïdes sont des procédures intuitives et nécessaires pour observer la régression des vaisseaux hyaloïdes dans les modèles animaux, afin de permettre des études sur les mécanismes sous-jacents à la régression vasculaire au cours du développement. Tandis que l'imagerie rétinienne in vivo permet l'observation longitudinale de la régression hyaloïde chez le même animal, l'accès à un système d'imagerie de fonds de rongeur pour OCT et FFA peut être un facteur l.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH) (R01 EY024963 et EY028100) à J.C. Z.W. a été soutenu par une subvention de démarrage de carrière de la Fondation des Templiers. La procédure d'isolement hyaloïde décrite dans cette étude a été adaptée avec une modification des protocoles généreusement partagés par les Drs Richard Lang, Toshihide Kurihara et Lois Smith, à qui les auteurs sont reconnaissants.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| AK-Fluor (injection de fluorescéine, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anticorps anti-CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Milieu de montage anti-décoloration | Thermo Fisher | S2828 | |
| Médium de montage anti-décoloration avec DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Collyre de larme artificielle | Systane | N/A | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Souris Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory Stock | NO : 000664 | |
| Chlorure de calcium (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Chlorhydrate de cyclopentolate et phényléphrine collyre chlorhydrate | Cyclomydril | N/A | |
| Gélatine ; | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Anticorps secondaire anti-Rabbit IgG (H+L) à adsorption croisée de chèvre, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Carte chauffante | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectine GS-IB4, 594 conjugué | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Injection de chlorhydrate de kétamine | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- | souris The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Développé par Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV et OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imagerie logiciel : InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Pince de microchirurgie | Scanlan International | 4004-05 | |
| Ciseaux de microchirurgie | Scanlan International | 6006-44 | |
| Température de coupe optimale composée | Tissue-Tek | 4583 | |
| Température de coupe optimale composée | Agar Scientific | ||
| Paraformaldéhyde (16 %) | Electron ; Microscopie ; Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way Moules d’enrobage jetables (moules à tissus) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Tampon salin tamponné au phosphate (PBS) (10X) | Teknova | P0496 | |
| Verre de couverture de diapositive | Premiere | 94-2222-10 | |
| Lames de microscope Superfrost ; | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine solution stérile | Akorn : AnaSed | NDC : 59399-110-20 |
Références
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and it....
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Réimpressions et autorisations
