Summary
Dit protocol demonstreert het gebruik van gecompartimenteerde microfluïdische chips, injectie gegoten in een cyclisch olefine copolymeer aan gekweekte neuronen die worden onderscheiden van menselijke stamcellen. Deze chips zijn voorgeassembleerd en gemakkelijker te gebruiken dan traditionele gecompartimentaliseerde poly (dimethylsiloxaan) apparaten. Meerdere gemeenschappelijke experimentele paradigma's worden hier beschreven, met inbegrip van virale labeling, fluidic isolatie, axotomie, en immunokleuring.
Abstract
Gebruik van microfluïdische apparaten voor het compartimengen van gekweekte neuronen is uitgegroeid tot een standaardmethode in de neurowetenschappen. Dit protocol laat zien hoe u een vooraf geassembleerde multi-compartiment chip gebruikt die in een cyclisch olefine copolymeer (COC) wordt gemaakt voor het compartimenaliseren van neuronen die zijn gedifferentieerd uit menselijke stamcellen. De voetafdruk van deze COC-chips is hetzelfde als een standaard Microscoop glijbaan en is net zo compatibel met hoge resolutie microscopie. Neuronen worden onderscheiden van menselijke neurale stamcellen (NSCs) in glutamaterge neuronen binnen de chip en onderhouden voor 5 weken, waardoor voldoende tijd voor deze neuronen te ontwikkelen van synapsen en dendritische stekels. Verder demonstreren we meerdere gemeenschappelijke experimentele procedures met behulp van deze multi-compartiment chips, met inbegrip van virale labeling, het opzetten van micro-omgevingen, axotomie, en immunocytochemie.
Introduction
Menselijke stamcel gedifferentieerde neuronen (hSC-neuronen) worden steeds vaker gebruikt voor biologisch onderzoek. Deze neuronen, die kunnen worden afgeleid van menselijke bronmateriaal, zijn van groot belang voor translationeel onderzoek, met inbegrip van de studie van traumatische hersenletsel en neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer. Er is dus behoefte aan hulpmiddelen om de studie van hSC-neuronen te verbeteren en te vergemakkelijken.
Om de unieke gepolariseerde morfologie van neuronen te bestuderen, gebruiken veel onderzoekers multi-compartimentalized microfluïdische apparaten1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11. Deze apparaten maken metingen en manipulaties van lange projectie neuronen met unieke subcellulaire toegang mogelijk. Multi-compartimentalized microfluïdische apparaten bestaan uit twee parallelle microfluïdische compartimenten gescheiden door micro groeven, die axonale groei begeleiden. Neuronen of neurale stamcellen (NSCs) worden geplateerd in het somatodendritische compartiment en houden zich na minuten aan de onderkant van het compartiment oppervlak. Gedifferentieerde neuronen groeien en breiden hun axons/projecties door de Microgroove regio naar een aangrenzend en geïsoleerd axonale compartiment. In het verleden, deze apparaten werden uitsluitend gemaakt met behulp van poly (dimethylsiloxane) (PDMS) replica molding. PDMS-apparaten hebben veel nadelen die eerder zijn beschreven12, waaronder aanhoudende hydrofobiciteit en de noodzaak om onmiddellijk voorafgaand aan gebruik te monteren op een glazen dekglaasje. Voorgemonteerde spuitgegoten chips overwinnen veel van deze nadelen en worden commercieel verkocht (Zie tabel van de materialen)12. De compartimenten van deze chips zijn permanent hydrofiel gemaakt en de hele chip is spuitgegoten in optisch transparante cyclische olefine copolymeer (COC).
Dit protocol demonstreert hoe u deze COC-chip gebruikt om menselijke NSCs te differentiëren in excitatory neuronen, en om hun lange neuronale projecties te scheiden en fluidisch te isoleren. Voor deze demonstratie werden neuronen onderscheiden van door NIH goedgekeurde H9 stamcellen. Soortgelijke procedures kunnen worden gebruikt om door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen te differentiëren.
Protocol
Opmerking: afbeelding 1a, B toont een schematische weergave van de voorgemonteerde COC-chip, met inbegrip van de locaties van de belangrijkste kanalen of compartimenten, putten en micro groeven. De compartimentalized chip kan verschillende fluïdische micro-omgevingen in een compartiment tot stand brengen zoals blijkt uit de isolatie van voedsel kleurstof (figuur 1c). Het protocol voor de voorbereiding van de voorgemonteerde multi-compartiment chip wordt gegeven in Nagendran et al., punt 112.
1. coating van multi-compartiment chips voor hSC-neuronen
Opmerking: afbeelding 2a toont een overzicht van de coating procedures.
- Los poly-L-Ornithine op in celkweek-grade gedistilleerd water om 600 μL oplossing per chip van een werkoplossing van 20 μg/mL te maken.
- Aspireren de resterende PBS links na het voorbereiden van de chips van de putten. Zorg er bij het aanzuigen voor dat de pipetpunt uit de buurt van de opening van het kanaal komt.
Opmerking: de microfluïdische kanalen moeten voor het geheel van deze procedure gevuld blijven. Niet aspireren vloeistof uit de kanalen/compartimenten, alleen de putten. - Laad in de rechterbovenhoek 150 μL poly-L-Ornithine-werkoplossing. Wacht tot 90 s of totdat vloeistof begint te vullen de onderste rechtsgoed. Voeg 150 μL media toe aan de rechterbenedenhoek en wacht 5 minuten om de vloeistof door de micro groeven te laten passeren.
- Voeg 150 μL media toe aan de linker bovenhoek. Wacht 90 s en voeg vervolgens 150 μL toe aan de linker benedenhoek. Wikkel de houder van de chip (s) met Parafilm en plaats bij 4 °C 's nachts.
Opmerking: plaats de chip en houder ook op 37 °C gedurende 1 uur. - Aspireren van de media uit de putten, ervoor te zorgen dat de pipetpunt wordt geplaatst weg van de opening van het kanaal. Voeg 150 μL steriel water toe aan de rechterbovenhoek. Wacht 90 s en voeg vervolgens 150 μL toe aan de rechterbenedenhoek. Wacht 5 minuten om de vloeistof door de micro groeven te laten passeren.
- Voeg 150 μL steriel water goed toe aan de linker bovenhoek, wacht 90 s en voeg vervolgens nog eens 150 μL toe aan de linker benedenhoek.
- Herhaal stap 1.5-1.6.
- Ontdooien langzaam bij 2 °C tot 8 °C en bereiden een werkoplossing van 10 μg/mL voor.
- Laad 150 μL van de laminine werkoplossing in de rechterbovenhoek. Wacht tot 90 s of totdat vloeistof begint te vullen de onderste rechtsgoed. Pipet 150 μL naar de rechterbenedenhoek. Wacht 5 minuten om de laminine door de micro groeven te laten gaan.
- Voeg 150 μL laminine aan de linker bovenhoek goed. Wacht 90 s en voeg vervolgens 150 μL toe aan de linker benedenhoek. Inincuberen van de chip in de houder voor 2 uur bij 37 °C.
- Spoel de chip af met PBS (zonder CA2 + en mg2 +). Laad 150 μL PBS in de rechterbovenhoek. Wacht tot 90 s of totdat vloeistof begint te vullen de onderste rechtsgoed. Voeg 150 μL PBS aan de rechterbenedenhoek toe en wacht 5 minuten om de PBS door de micro groeven te laten gaan.
- Pipet de 150 μL PBS naar de linker bovenhoek. Na 90 s pipet 150 μL naar linksonder goed.
- Aspirate PBS van de chip en spoel de chip met NSC media (Zie tabel van de materialen). Laad 150 μL media naar de rechterbovenhoek. Na 90 s of wanneer de vloeistof via het rechterkanaal in de rechterbenedenhoek stroomt, voegt u 150 μL toe aan de rechteronderkast. Wacht 5 minuten om de media door de micro groeven te laten stromen.
- Voeg 150 μL media toe aan de linker bovenhoek en nog eens 150 μL naar linksonder goed. Incubreer de chip in een incubator van 37 °C met 5% CO2 om de chip vooraf te conditioneren tot ze klaar zijn om nscs te zaaien.
Opmerking: chips kunnen indien nodig 's nachts worden geconditioneerd.
2. seeding van de NSCs in de multi compartiment chip
Opmerking: dit protocol gebruikt commercieel gekochte NSCs, in tegenstelling tot onze vorige publicatie die begon met menselijke embryonale stengels cellen5. In dit protocol worden neurale stamcellen direct in de plastic chips geplateerd waar ze zich onderscheiden in neuronen. De cellen kunnen worden toegestaan om te vermenigvuldigen als NSCs (zonder differentiatie) voor maximaal 2 passages en opgeslagen in flesjes in vloeistof N2 voor verder gebruik. Dit protocol gebruikt NSC-flacons die zijn opgeslagen in vloeistof N2 na passage 1 of 2. Figuur 2b toont een overzicht van de coating procedures.
- De NSCs ontdooien volgens de instructies van de fabrikant.
Opmerking: deze procedure is van toepassing op H9-afgeleide NSCs. Voor andere cellijnen is optimalisatie van de celdichtheid vereist. - Tel de celconcentratie met behulp van een hemocytometer en pas het gebruik van NSC-media aan om een concentratie van 7 x 106 -cellen per ml te krijgen.
- Aspirate media van elke put van de chip. Vermijd aspirerende media uit de hoofdkanalen.
- Pipet 5 μL van de celoplossing naar de rechterbovenhoek, gevolgd door 5 μL naar de rechterbenedenhoek (70.000 cellen totaal). Zorg ervoor dat de cellen worden gepipetteer naar de openingen van het hoofdkanaal. Gebruik een microscoop om te controleren of cellen het kanaal hebben ingevoerd. Wacht 5 min voor cellen om te voldoen aan de onderkant van de chip.
Opmerking: een of beide compartimenten kunnen worden gebruikt om cellen te laden. - Pipet ~ 150 μL NSC-media naar de rechterbovenhoek en vervolgens 150 μL naar de rechterbenedenhoek. Herhaal dit aan de linkerzijde. Inincuberen bij 5% CO2, 37 °c binnen een geschikte bevoficeerde verpakking.
- Na 48 uur, aspireren NSC media uit de putten en vervangen door Neurale differentiatie media door het toevoegen van 150 μL aan elke top goed en elke bodem goed.
- Cultuur neuronen binnen een incubator van 5% CO2, 37 °c in een geschikte bevoficeerde container.
Opmerking: de media moeten elke 2-3 dagen worden vervangen. Vanwege de kleine volumes die in de chip worden gebruikt, kan verdamping zelfs binnen een bevoficeerde incubator een aanzienlijke invloed hebben op de levensvatbaarheid van de cel. Gebruik een geschikte secundaire container om extra vochtigheid te bieden voor lange-termijn cultuur van cellen met de chip (Zie tabel met materialen).
3. virale fluorescerende labeling van hSC-neuronen binnen de chip
Opmerking: meerdere virussen kunnen worden gebruikt om neuronen binnen de chip te labelen. Onderstaande instructies beschrijven het gebruik van G-deleted rabiës-mCherry of – eGFP virus. Potentieel besmettelijke materialen moeten worden behandeld volgens toepasselijke regels en voorschriften, en kunnen aanvullende opleiding en institutionele goedkeuring vereisen.
- Warm ~ 400 μL verse Neurale differentiatie media per chip tot 37 °C.
- Verwijder 50 μL media van de ene put van het axon-compartiment in een centrifugebuis en voeg vervolgens 100.000 virale eenheden van gemodificeerd rabiësvirus toe aan de buis.
Opmerking: Gooi afgewerkte pipetpunten en centrifuge buisjes met virus goed weg. - Verwijder de overgebleven Neurale differentiatie media uit het axonale compartiment en plaats ze in een centrifugebuis. Bewaren bij 37 °C.
Opmerking: Zorg ervoor dat de kanalen gevuld blijven met vloeistof. - Meng de 50 μL virusoplossing met 150 μL verwarmde media. Pipet-100 μL tot een goed van het axon-compartiment en 100 μL naar het andere axon-compartiment. Incuberen gedurende 2 uur binnen een incubator van 37 °C.
Opmerking: het verschil in volumes tussen de axonale en somatische compartimenten zorgt ervoor dat het virus tijdens infectie/incubatie tijden in het axonale compartiment blijft. - Het opnemen en afvoeren van virus bevattende media.
Let op: Verwijder geen vloeistof binnen de meegeleverde microfluïdische kanalen. - Pipet goed 75 μL verse media voorzichtig in een axon compartiment en laat de media door het kanaal naar andere axon stromen.
- Verwijder de media uit het axon-compartiment en gooi ze goed weg.
- Herhaal de stappen 3,6 en 3,7.
- Vul het axon compartiment met de opgeslagen media. Pipet keer een extra 50 μL verse media, indien nodig, en breng vervolgens de chip terug naar de incubator. Deze extra nieuwe media is om te tellen voor verlies van media tijdens vloeistof overdracht en verdamping tijdens het proces.
Opmerking: zichtbare fluorescerende labeling met behulp van deze gemodificeerde rabiës virussen treedt op door 48 h en tot 8 dagen waarna de celdood van geïnfecteerde neuronen in het algemeen optreedt als gevolg van virus toxiciteit. Neuron Imaging kan worden uitgevoerd zoals bij andere standaard kweek platformen (bijv. glazen bodem schotels), maar er is speciale aandacht nodig om voldoende vochtigheid te behouden om verdampings verliezen te voorkomen.
4. fluidic isolatie, axotomie en immunokleuring binnen de chip
- Volg fluïdische isolatie, axotomie en immunokleuring met de chip zoals beschreven in Nagendran et al.12.
Representative Results
Na een week (7-10 dagen) in de chip met differentiatie media, NSCs differentiëren in neuronen en neuronale projecties in het axonale compartiment (Figuur 3). Binnen de chip hechten en verdelen neuronen gelijkmatig binnen het somatische compartiment. In vergelijking, neuronen in PDMS apparaten Clump/aggregaat al 5 dagen na toevoeging van differentiatie media, wat leidt tot gecompromitteerde cel gezondheid zoals te zien is in de Figuur 3b (dag 13 vergrote afbeelding). Neuronen in de chips zien er gezond uit met gebundelde axonen. Gezonde neuronen kunnen worden gehandhaafd binnen de chips voor 4-5 weken.
Om neuron rijping en dendritische wervelkolom ontwikkeling visualiseren, gemodificeerde rabiësvirus werd afgeleverd in het axonale compartiment op dag 29 tot retrograde label neuronen, met inbegrip van dendritische stekels, met mCherry fluorescerende eiwitten. Vier dagen na een virus infectie met rabiës hebben neuronen die axonen in het axonale compartiment uitschuivende mCherry. De neuronen bij differentiatie dag 33 toonde vorming van dendritische stekels (Figuur 4). Visualisatie van dendritische stekels toont aan dat NSC afgeleide neuronen gedifferentieerd binnen de chips vorm volwassen synapsen.
De multi-compartiment chip is ook compatibel met immunocytochemie om de cellulaire lokalisatie van eiwitten te visualiseren. Na 26 dagen van het handhaven van neuronen in differentiatie media, neuronen werden gelabeld voor de excitatory synaptische marker, vGlut1 (Figuur 5). Deze resultaten tonen aan dat aanpak gelabelde neuronen co-localiseren met vGlut1 (figuur 5e) en neuron specifieke marker, β-tubulin III (figuur 5F-H).
De mogelijkheid om verschillende micro-omgevingen te maken, geïsoleerd voor axonen, werd ook gedemonstreerd met behulp van Alexa Fluor 488 Hydrazide, een laag moleculair gewicht fluorescerende kleurstof (Figuur 6).
Axon letsel studies worden vaak uitgevoerd binnen compartimenten. Een bewijs van principe experiment werd uitgevoerd om selectief te verwonden axonen van gedifferentieerde neuronen met de voorgemonteerde COC chip (Figuur 7). De resultaten waren gelijk aan de siliconen compartimenten6,13en14.
Figuur 1: de voorgemonteerde COC, multi compartiment microfluïdische chip. A) een tekening van de chip die de bovenste en onderste putjes identificeert. De grootte van de chip is 75 mm x 25 mm, de grootte van standaard Microscoop dia's. B) een ingezoomde regio met de kanalen en micro groeven die de kanalen scheiden. Meer informatie is beschikbaar in Nagendran et al.12. (C) deze foto illustreert de creatie van geïsoleerde micro omgevingen binnen elk compartiment met behulp van kleurstof voor levensmiddelen. Dit hele cijfer is gereproduceerd van 12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: kunststof compartimenten met compartimengd spaan coating en NSC-celplating. A) plastic multi compartiment chips werden bekleed met een pre-coating oplossing, en vervolgens poly-L-Ornithine en laminine vóór pre-conditioning met NSC media. (B) nscs werden verguld met 7 x 104 cellen in het somatische compartiment van de chip. De cellen werden geteeld in NSC media voor 24 h en vervolgens de media werd vervangen door Neurale differentiatie media. Gedifferentieerde neuronen werden waargenomen door 7-10 dagen na differentiatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: hSC-neuron groei vergelijking in chips en PDMS apparaten. A) een fase contrast beeld van hSC-neuronen, geteeld na 13 dagen na differentiatie in de kunststof multi compartiment chip. B) een ingezoomd gebied van hSC-neuronen gekweekt binnen het witte vak ondera) en een gelijkwaardig gebied binnen een PDMS-apparaat (rechts). hSC-neuronen in de chips hechten goed. Geaggregeerde neuron clusters formulier in PDMS-gebaseerde apparaten. Vertegenwoordiger van 2 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: humane NSC afgeleide neuronen tonen dendritische wervelkolom morfologie. Retrograde gelabeld mCherry neuron op differentiatie dag 33 geteeld binnen de chip. Het vergrote gebied in het rood, benadrukt de aanwezigheid van dendritische stekels, die bewijs leveren ter ondersteuning van de ontwikkeling van volwassen glutamaterge synapsen. Rode pijlen wijzen naar dendritische stekels. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: menselijke NSC afgeleide neuronen gekweekt binnen chips vertonen excitatory synapsen. Immunokleuring werd uitgevoerd bij differentiatie dag 26. Neuron Imaging werd uitgevoerd in het somatische compartiment. A) vGlut1 (groen) en (B) DAPI (blauw) immunolabeling. C) met mcherry gelabelde neuronen (rood) retrograde met een gemodificeerd rabiësvirus. D) een samengevoegde fluorescerende micro graaf van (a-C). E) dendritische stekels en vGlut1 positieve puncta, gelokaliseerd met mcherry-positieve dendrites, weergegeven in een ingezoomde regio van (D). Immunofluorescentie micrografen van (F) neuron specifieke marker, β-tubulin III (magenta) en (G) vGlut1 (groen). H) overlay van β-tubulin III, en vGlut1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: virally getransduceerde mcherry neuronen breiden projecties uit in een axon gelokaliseerde micro omgeving die in de voorgemonteerde COC-chip is gevestigd. (A) mcherry gelabeld neuron Verleng axonen door de micro groeven van de chip en in een geïsoleerd axon compartiment. Isolatie van het axon-compartiment wordt gevisualiseerd met behulp van Alexa Fluor 488 Hydrazide. Beeldvorming van neuronen trad op bij differentiatie dag 26 en 3 dagen na infectie met het gemodificeerde rabiësvirus. B) het fluorescentie beeld in (a) wordt samengevoegd met een dic-afbeelding. Noteer de locatie van de micro groeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Axotomie uitgevoerd binnen de COC multi compartiment chip. (A) mcherry gelabeld neuronen bij differentiatie dag 33 werden voor axotomie afgebeeld. ' Fire ' kleur look-up tafel. (B) onmiddellijk na axotomie, waaruit blijkt dat axonen volledig zijn afgesneden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Kunststof multi-compartiment chips | PDMS-apparaten met meerdere compartimenten |
| isoleren axonen | isoleren axonen |
| Micro-omgevingen instellen | Micro-omgevingen instellen |
| axotomize neuronen | axotomize neuronen |
| optisch transparant | optisch transparant |
| compatibel met hoge resolutie Imaging | compatibel met hoge resolutie Imaging |
| compatibel met fluorescentiemicroscopie | compatibel met fluorescentiemicroscopie |
| volledig geassembleerd | montage op ondergrond vereist |
| gezonde axonen > 21 dagen | gezonde axonen > 14 dagen |
| hydrofiel kweekoppervlak | Hydrophobic |
| gasongevoelbaar | gas permeabel |
| afgeronde micro groeven en kanalen | rechte micro groeven |
| niet compatibel met laser ablatie | Kan worden gebruikt voor laser ablatie wanneer PDMS Chambers worden geassembleerd op speciale laser ablatie compatibele dia's. |
| apparaat kan niet worden gewijzigd om boven te verwijderen | Top is afneembaar voor kleuring binnen micro groeven |
| niet compatibel met op minerale olie gebaseerde Dompel oliën (oliën op basis van siliconen zijn prima) | geschikt voor Dompel oliën op basis van minerale olie |
| ongevoelbaar voor kleine moleculen en organische oplosmiddelen | absorptie van kleine moleculen & organische oplosmiddelen |
| Geen lekkage problemen met de chip | coating met poly-L-Ornithine en laminine maken de apparaten lekvrij |
| gedifferentieerde neuronen blijven gelijkmatig verdeeld (> 4 weken) op de geteste celdichtheden | gedifferentieerde neuronen beginnen te aggregeren na 3-4 dagen in de cultuur op de geteste celdichtheden |
Tabel 1: Comparisie van COC-chips met meerdere compartimenten en siliconen apparaten voor het kweken van neuronen
Discussion
Het voorgemonteerde multi-compartiment COC chip is een eenvoudig te gebruiken gecompartimentaliseerd platform om te differentiëren en te onderhouden menselijke NSCs in neuronen voor lange termijn (> 4 weken). In dit protocol demonstreren we de differentiatie van menselijke NSCs in glutamatergische neuronen, retrograde label neuronen, voeren immunocytochemie uit, visualiseren dendritische wervelkolom morfologie en voeren axotomie uit. Deze chips zijn compatibel met hoge resolutie Imaging en er is geen auto fluorescentie met de COC12.
COC multi-compartiment chips zijn functioneel gelijkwaardig aan op siliconen gebaseerde compartimenten, en hebben voordelen en nadelen zoals eerder beschreven12. Tabel 1 vergelijkt multi-compartiment COC-chips en siliconen apparaten voor het kweken van hSC-neuronen. De COC-compartimenten bieden een beter hydrofiel oppervlak voor de bevestiging en het onderhoud van stamcellen gedurende een lange cultuur periode. Op PDMS gebaseerde apparaten moeten worden geassembleerd en aan glas dekstroken worden bevestigd. De hydrofobe aard van de PDMS-apparaten veroorzaakt aggregatie van stamcellen5; Dit leidt tot beide uitdagingen bij beeldvorming op cellulair niveau en grotere gevoeligheid voor fysieke schade als gevolg van de verplaatsing van celaggregaten tijdens media veranderingen. De plastic chip overkomt deze uitdagingen. COC is gasongevoelbaar, in tegenstelling tot PDMS, dus luchtzakken gevangen of gevormd binnen de kanalen moeten worden verwijderd door de gebruiker. De pre-coating oplossing vermindert de mogelijkheid voor lucht om opgesloten te raken in de kanalen. Deze oplossing bestaat uit ethanol en andere middelen. Een eerder gepubliceerde protocol voor het kweken van Murine neuronen binnen deze plastic chips biedt extra informatie over Pipetteer cellen en media binnen de chips12. NSCs zijn kwetsbaarder dan neuronen, dus moeten ze voorzichtig worden behandeld. Het is ook essentieel om de stamcellen grondig te mengen voor het beplating door ze zachtjes op en neer te pipetteren.
Gebruik van neuronen afgeleid van in vitro gedifferentieerde menselijke stamcellen wordt steeds populairder in de geneeskunde en onderzoek. Deze neuronen zijn belangrijk voor onderzoek en klinische toepassingen voor veel CNS aandoeningen, met inbegrip van neurodegeneratieve ziekten en traumatische hersenletsel. Deze neuronen lijken sterk op menselijke foetale neuronen15. In de toekomst, adequaat verouderde neuronen kunnen worden gegenereerd uit stamcellen om na te bootsen leeftijdsgebonden neuronale functie en gebruikt in combinatie met deze compartimenten gecompartimentaliseerd. Deze apparaten zal onderzoek in ziekten die axon gezondheid en functie zoals axon tekorten in neuronen van patiënten gediagnosticeerd met autisme spectrum stoornissen en axonale regeneratie na blessure16,17vergemakkelijken.
Disclosures
S.P. en T.N. verklaren geen concurrerende financiële belangen. V.P. is een medewerker van Xona Microfluidics, LLC. J.H. is lid van Xona Microfluidics, LLC. A.M.T. is een uitvinder van de microfluïdische kamer/chip (US 7419822 B2, EPO 2719756 B1) en is lid van Xona Microfluidics, LLC.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de steun van Xona Microfluidics, LLC, het National Institute of Mental Health (R42 MH097377), en het National Institute of neurologische aandoeningen en beroerte (R41 NS108895, P30 NS045892). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
| anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
| anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
| anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
| complete neural stem cell media: | |||
| REC HU EGF 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0314 | 20ng/mL |
| REC HU FGF BASIC 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0024 | 20ng/mL |
| GlutaMAX Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | 2mM |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12660012 | |
| StemPro Neural Supplement | ThermoFisher Scientific | A1050801 | 2% |
| Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
| fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
| Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Gibco DPBS without Calcium and Magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT COMBO KIT |
Gibco | N7800200 | |
| Gibco Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
| H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL 1E6 CELLS/VIAL; 1 ML |
ThermoFisher Scientific | 510088 | |
| hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
| Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
| modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
| Mr. Frosty | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| Neural differentiation media | Per 100 mL. | ||
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | 1mL (100X) |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A8960 | 200mM |
| BDNF | ThermoFisher Scientific | PHC7074 | 40 ng/mL |
| Gibco B27 Plus Supplement (50X) | FisherScientific | A3582801 | 2mL (50X) |
| Gibco CultureOne Supplement (100X) | FisherScientific | A3320201 | 1mL (100X) |
| Gibco Neurobasal Plus Medium | FisherScientific | A3582901 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Taylor Wharton Liquid N2 dewar | FisherScientific | 20HCB11M | |
| triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
| XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
| XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier |
| Humidifier Tray | Xona Microfluidics, LLC | humidifier tray |
References
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics. The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington’s Disease. Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Pinto, M. J., et al. The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates. The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).
- Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons. Scientific Reports. 7 (1), 611 (2017).
- Nagendran, T., et al. Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling. Nature Communications. 8 (1), 625 (2017).
- Van Laar, V. S., et al. Evidence for compartmentalized axonal mitochondrial biogenesis: Mitochondrial DNA replication increases in distal axons as an early response to Parkinson's disease-relevant stress. The Journal of Neuroscience. , (2018).
- del Río, J. A., Ferrer, I., Gavín, R. Role of cellular prion protein in interneuronal amyloid transmission. Progress in Neurobiology. 165-167, 87-102 (2018).
- Jia, L., et al. MiR-34a Regulates Axonal Growth of Dorsal Root Ganglia Neurons by Targeting FOXP2 and VAT1 in Postnatal and Adult Mouse. Molecular Neurobiology. , (2018).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Menon, S., et al. The E3 Ubiquitin Ligase TRIM9 Is a Filopodia Off Switch Required for Netrin-Dependent Axon Guidance. Developmental cell. 35 (6), 698-712 (2015).
- Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. Journal of visualized experiments : JoVE. (141), (2018).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Oh, J. H., Jung, C. R., Lee, M. O., Kim, J., Son, M. Y. Comparative analysis of human embryonic stem cellderived neural stem cells as an in vitro human model. International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 783-790 (2018).
- Lazar, M., Miles, L. M., Babb, J. S., Donaldson, J. B. Axonal deficits in young adults with High Functioning Autism and their impact on processing speed. Neuroimage Clinical. 4, 417-425 (2014).
- DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Combinatory repair strategy to promote axon regeneration and functional recovery after chronic spinal cord injury. Scientific Reports. 7 (1), 9018 (2017).
