Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/59275
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Hematology & Hematopoietic Cell Transplantation, T Cell Therapeutics Research Laboratory, City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center, 2Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences, City of Hope Beckman Research Institute and Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

כאן נתאר שיטת הפריה תרבות משותפת כדי באופן רקורסיבי אתגר, ממוקדות גידול תאי T, המאפשר ניתוח פנוטיפי ופונקציונליים של פעילות antitumor תא T...

Abstract

בתחום chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) תא T טיפול מתקדם במהירות עם שיפורים עיצוב המכונית, גישות ג'ין-הנדסה, ייצור אופטימיזציות. אתגר אחד עבור המאמצים פיתוח, עם זאת, כבר הקמת מבחני במבחנה כי robustly יכול ליידע את מבחר המוצרים אופטימלית של תא T המכונית להצלחה טיפולית ויוו. מבחני הגידול-פירוק במבחנה רגיל להיכשל לעיתים קרובות לשקף את הפוטנציאל antitumor האמיתי של תאי T רכב עקב זמן קצר יחסית תרבות משותפת תא T גבוה ליחס הגידול. כאן נתאר שיטת הפריה תרבות משותפת כדי להעריך את המכונית T תא רקורסיבית להרוג את הפוטנציאל-גידול גבוה תא המון. זו assay, הפונקציה ציטוטוקסיות לטווח ארוך, קיבולת המקדימות של תאי T הרכב נבדק במבחנה מעל 7 ימים עם מטרות גידול נוספים מנוהל לתרבות שיתוף בכל יום אחר. Assay הזה יכול להיות יחד עם הפעלת תא T פרופיל, תשישות, זיכרון פנוטיפים. שימוש assay הזה, אנחנו בהצלחה כיבדתם את ההבדלים פנוטיפי פונקציונלי בין CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים נגד גליובלסטומה תאים (GBM), המשקף פעילות antitumor ויוו דיפרנציאלי שלהם ב- orthotopic xenograft מודלים. שיטה זו מספקת גישה נתיישב כדי להעריך את עוצמת תא T המכונית וכדי להבהיר את הווריאציות פונקציונלי על פני מוצרים שונים של תא T המכונית.

Introduction

אימונותרפיה בעזרת chimeric אנטיגן קולטן (מכונית)-תאי T מהונדסים ראה מבטיח תוצאות נגד תא B ממאירות1,2,3,4, בעוד הפוטנציאל של פילוח גידולים אחרים ממשיך להיות תחת החקירה5,6,7. התקדמות נהדרת נעשתה כדי למטב לבנות את המכונית, תהליך הייצור ואת החולה משטרי אינפוזיה לפני6,7,8, ביולוגיה סינתטית רומן גישות צפויים להגדיל שלהם התמדה, בטחון, הגידול ירידה לפרטים9,10. לעומת זאת, זה היה קשה, שדורשת להעריך כראוי את הפוטנציאל הטיפולי של תאי T המכונית כדי להנחות את הבחירה הטובה ביותר לתרגום קליניים. המודל ביותר עד כה כדי להעריך את תפקוד תא T המכונית הוא בעכברים immunodeficient הנושאת גידול אנושי xenografts, לפיה המכונית T תאים בחן על יעילות antitumor, לעומת תא טיטרציה מינונים11,12 , 13 , 14 , 15. מחקרים מאתר ויוו אלה הם עתירי עבודה, זמן רב, במיוחד בעת הקרנת מספר רב של פרמטרים. מחקרים נוספים, אין ויוו יכול לרסנם מאת הנגישות של העכבר זנים, מתקני טיפול בבעלי חיים, טכניקות טיפול בעלי חיים. לכן, יש צורך לפתח מבחני מתורבת יותר נוח המאפשר קריאות מהירה של פעילות אפקטור, המשקפים גם בנאמנות את הפונקציה antitumor ויוו של תאים אלה T.

שיטות קונבנציונליות כדי לקבוע את cytotoxicity של תאי T במבחנה התמקדו הגילוי של degranulation, ייצור ציטוקינים, היכולת lyse התאים היעד התווית על-ידי radioisotope (קרי, מבחני שחרור של כרום). בעוד אלה מבחני אינפורמטיבי להגדרת רכב T תא ירידה לפרטים והכרה היעד שנותבו מחדש, הם לעתים קרובות נכשלים לשקף ויוו antitumor הפוטנציאל של13,12,תאי T מהונדסים16. במקרים מסוימים, במבחנה הורג פעילות מבחני לטווח קצר הראה של מתאם הפוך עם פונקציית antitumor ויוו16. כזה חוסר עקביות הוא כנראה התוצאה של יחסי אפקטור: המטרה גבוהות (E:T) בשימוש אלה מבחני במבחנה, ולכן חוסר יכולת להבדיל בין המוצרים תא T המכונית נוטים תשישות17. לעומת זאת, במהלך הגידול ויוו מיגור T תאים בדרך כלל מגיבים נגד נטל הגידול גדול, ובכך הדורשים מספר סיבובים על הורגת ונהיגה לאחר מכן תא T בידול ותשישות18,19, 20, אשר הוא אחד המחסומים העיקריים נגד הגידול יעיל אישור מאת המכונית T תאים12,13. בינתיים, מבחני הרג במבחנה לטווח קצר ביותר לעשות גם לא readout הבדלים תא T התפשטות, ואילו בחולים מטופלים תא T המכונית יכולת הרחבה תא T המכונית הוא מתואם חריפה לתגובות הקליניות4. לפיכך, וזמינותו במבחנה המתאים היה צריך לסכם את תנאי הגידול גבוהה נטל, אינדוקציה של תא T תשישות, ומאפשר המדידה של תא T התפשטות.

כאן נתאר אסטרטגיה כדי להעריך את המכונית T תאים לגידול חוזרות הורג את הפוטנציאל, עם assay פשוט תרבות משותפת במבחנה... תא T שונה אפקטור פעילות הפרמטרים יכולים בו זמנית להיבדק, כולל הרג תא היעד, המכונית T תא הרחבת זיכרון או תשישות-הקשורים פנוטיפים. התוצאות שהופקו מן assay זו לתאם עם השפעת antitumor ויוו המכונית T תאים, אפשר לנצל כדי להעריך את העוצמה של המכונית T התא מוצרים. בעוד אנו מתארים assay כדי להעריך את תאי T המכונית, ממוקדות IL13Ra2 נגד GBM ראשי שורות21, זה ניתן בקלות להתאים כל פלטפורמה תא T המכונית.

Protocol

IRB שלנו אינו דורש סקירה של פרוטוקול זה. אנחנו מקבלים דגימות גידול גליובלסטומה טריים שהושלכו עיר של תקווה המחלקה לפתולוגיה שנכתבו, המעבדה שלנו אין אפשרות לקבל גישה למפתח. אנו מקבלים את דגימות עם נתונים רק על מצב המחלה וטיפול מראש ביצוע ביופסיה/כריתה, בלי נתונים מזהים.

1. הכנה מדיה

  1. להתכונן culturing ראשי שורות תאים GBM תאי גזע עצביים מדיה: DMEM:F12, 1:50 B27, 5 הפארין µg/mL, ו 2 mmol/L-גלוטמין; בתוספת 20 ng/mL גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ואת ng/mL 20 בסיסי פיברובלסט גורם גידול (FGF) פעמיים בשבוע (ראה טבלה של חומרים).
  2. הכינו את תא T מדיה: 15 X-VIVO המכיל 10% עגל עוברית סרום (FCS); מצורפים עם 70 IU/mL rhIL-2 ו- 0.5 ng/mL 15-rhIL כל 48 שעות (ראה טבלה של חומרים).
  3. להכין תרבות שיתוף מדיה: לקחת תאי גזע עצביים מדיה ללא תוספת EGF ו- FGF, ולהוסיף 10% FCS.
  4. להכין FACS מכתים פתרון (FSS): HBSS, 2% FCS, נאן3 (0.5 ג'י של 500 מ"ל).

2. הכנת תאים סרטניים GBM

  1. הקציר נמוך-המעבר GBM הגידול הספירות (TSs) על ידי צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 4 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.
    הערה: הגידול GBM הספירות (TSs) מופקים מן resected גידולים כפי שתואר לעיל22,23,24, ומתוחזק בתקשורת תאי גזע עצביים, בחממות עם 5% CO2 ב 37 º C.
  2. לחמם תרבות שיתוף מדיה באמבט מים 37 º C.
  3. להוסיף 1 מ"ל של accutase קר GBM TSs, מביצועם TSs מאת pipetting עבור s 30-60, וכן להפסיק דיסוציאציה על-ידי הוספת 5 מיליליטר חמים תרבות שיתוף מדיה.
    הערה: GBM TSs לא צריך להישמר על accutase עבור יותר מ 5 דקות.
  4. קציר תאים GBM על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 4 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בתאים 2 מ"ל של תרבות שיתוף מדיה.
  5. לקבוע ריכוז התא באמצעות מונה הכדאיות התא.
    הערה: תא הכדאיות בטח > 70%.

3. הכנת רכב T תאים

  1. פחות מ- 24 שעות לפני וזמינותו, לקחת 100 µL בתרבית תאים T המכונית לתוך צינור cytometry זרימה ולהוסיף 2 מ של FSS.
    הערה: תאי T המכונית היו שנוצר כפי שתואר לעיל11,21 ותרבותית בתקשורת תא T.
  2. צנטריפוגה ב x 300 גרם 4 דקות ו להשליך תגובת שיקוע.
  3. 2 מ של FSS לרחוץ את התאים, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 4 דקות, להוסיף ולמחוק את תגובת שיקוע.
  4. כתם התאים עם נוגדן המתאים כדי לציין ביטוי המכונית ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    הערה: לדוגמה, אם מכונית, ממוקדות IL13Rα2 תיאר בעבר25 משמש, ואז כתם עם נוגדן anti-IL13.
  5. לשטוף פעמיים עם 2 מ של FSS וניתוח exn המכונית באמצעות cytometer של זרימה.
  6. לקבוע את המכונית % בתאי T באמצעות האסטרטגיה המגביל שמוצג באיור 1ב'.
  7. ביום של תרבות משותפת, לקצור את כל המכונית T תאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 4 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בתאים 2 מ"ל של תרבות שיתוף מדיה.
  8. לקבוע ריכוז התא באמצעות מונה הכדאיות התא.
    הערה: תא הכדאיות בטח > 70%.

4. הגדרת הגידול – תרבות משותפת תא T

  1. לדלל תאים סרטניים כדי ריכוז של 0.16 מיליון למ"ל עם תרבות שיתוף מדיה.
  2. בהתבסס על המכונית %, לדלל בתאי T רכב על ריכוז של 0.04 מיליון מכוניות+ תאים/mL עם תרבות שיתוף מדיה.
    הערה: לדוגמה, אם המכונית היא 50% והוא תא T ריכוז 0.4 מיליון למ"ל, ואז לגרום לדילול 1:5 כדי לקבל את הריכוז הסופי של 0.04 מיליון מכוניות+ תאים/מ ל....
  3. פיפטה 100 µL של תאים סרטניים מדולל לתוך כל טוב של צלחת תרביות רקמה 96-ובכן שטוח התחתונה.
  4. פיפטה 100 µL של תאי T המכונית מדולל לבאר כל המכילה תאים סרטניים, לערבב היטב.
    הערה: כל תרבות משותפת תא הגידול-T ינותחו בנקודות זמן 4. 4-6 משכפל ייתכן שיהיה צורך בכל פעם נקודת מבוסס על ניתוח שונות, אבל < 3 משכפל לכל נקודת זמן לא מומלץ; ראה טבלה 1 platemap נציג.
  5. לשמור על הצלחת ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים.

5. גידול התא Rechallenge

הערה: Rechallenge מתקיים ב- 2, 4, 6 ימים שלאחר ההתקנה הראשונית תרבות משותפת (איור 1א').

  1. הקציר, מביצועם GBM TSs כמתואר לעיל (שלבים 2.1-2.6).
  2. Resuspend תאים GBM-ריכוז של 0.64 מיליון למ"ל.
  3. לקבוע הבארות תרבות משותפת צריך rechallenge (ראה טבלה 1) בזהירות להסיר מדיה µL 50 מהחלק העליון של כל טוב.
  4. להוסיף 50 µL של השעיה תאים GBM לבאר כל, מערבבים היטב ולאחר מכן תחזיר את הצלחת לתוך 37 ° C, 5% CO2 מיכלים.

6. הקציר דגימות וזרימה ניתוח Cytometric

הערה: דוגמאות יהיה לקצור בעמדה 1, 3, 5, 7 ימים שההתקנה הראשונית תרבות משותפת, עם 1, 2, 3 ו- 4 סיבובים של הגידול אתגר, בהתאמה.

  1. לחמם 0.05% פתרון טריפסין-EDTA waterbath 37 º C.
  2. לקבוע את הבארות צריך קציר ולא להעביר את המדיה לתוך צלחת חדשה של 96-ובכן סיבוב המדרגה.
  3. פיפטה µL 50 של טריפסין-EDTA לתוך הבארות לעכל תאים סרטניים שנותרו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  4. תחת מיקרוסקופ, אשר שהתאים יש תלושים מלמטה.
  5. פיפטה סביב החלק התחתון טוב resuspend תאים מנותק ולאחר מכן להעביר טריפסין-EDTA המכיל תאים מנותקת הבארות המקביל של צלחת 96-ובכן עגול-התחתון.
  6. צנטריפוגה צלחת 96-ובכן עגול-התחתון ב 300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, ואז למחוק את תגובת שיקוע.
  7. להוסיף 200 µL/טוב של FSS לרחוץ את התאים, צנטריפוגה ב 300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.
  8. Resuspend תאי 100 µL/טוב FSS המכיל נוגדנים (ראה טבלה של חומרים), הכתם תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  9. להוסיף µL 100/FSS טוב לתאים, צנטריפוגה ב 300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, ואז להשליך תגובת שיקוע.
  10. להוסיף 200 µL/טוב של FSS לרחוץ את התאים, צנטריפוגה ב 300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.
  11. Resuspend תאים עם 100-200 µL/טוב של FSS עם 500 ננוגרם למ"ל דאפי, ולאחר מכן לנתח דגימות ידי cytometry זרימה.

7. פונקציונלי וניתוח פן Otypic של תאי T המכונית

  1. לאחזר את קבצי הנתונים זרימה cytometer, שער כל (דאפי-) תאים חיים (איור 1C).
  2. לכמת תאים סרטניים על ידי gating CD45 את– האוכלוסייה ותאי T המכונית על ידי gating את CD45+, רכב + האוכלוסייה (איור 1C).
    הערה: אם תאים סרטניים אקספרס CD45 (למשל ראג'י תאים לימפומה), אנטי-CD3 מכתים יכול לשמש כדי להבדיל בין תאי T מתאי הגידול.
  3. מגרש תא הגידול ומספר תא T המכונית במהלך הזמן.
  4. לזהות תא T ההפעלה על-ידי הביטוי משותף של 4-1BB, CD69.
    הערה: סמנים אלה פני השטח ניתן לנתח תא T הפעלה 6-24 h פוסט משותף התרבות הראשונית.
  5. לזהות תא T מיצוי על ידי הביטוי של PD-1, לג-3 וטים-3.
  6. מזהים תא T זיכרון מצב על-ידי הביטוי של CD45RO ושל CD62L.

Representative Results

באמצעות וזמינותו שתוארו לעיל, אנו כיבדתם את העוצמה אפקטור דיפרנציאלית, להרוג את הדינמיקה מתווכת על-ידי CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים. התוצאות המובאות כאן להמחיש את ההבדל בין CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים, שנוצר מתורם בריא עצמאית של הפרסום הקודם שלנו21.

דרך assay degranulation הרגיל, היינו יכול לצפות כי שניהם CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים באותה מידה הופעלה כנגד תאים GBM המבטאים אנטיגן יישוב, כמצוין על-ידי הביטוי של CD107a וציטוקין תאיים (איור 2א). עם זאת, שימוש assay לאתגר את הגידול חוזרות, מצאנו כי CD4+ אבל לא CD8+ המכונית T תאים הציג את היכולת של הרג מרובים-עגולים (איור 2B). CD4+ המכונית T תאים גם מושגת הרחבה יותר לעומת תאי CD8 + במהלך הזה assay (איור 2C). ההבדל של הרחבה בין קבוצות משנה של תא T המכונית רק נצפו מ D3 לאחר שני סיבובים של הגידול אתגר (1:12 E:T), בעוד ההבדל של cytotoxicity נצפתה שמתחילים ב- D5 אחרי שלושה סיבובים של הגידול אתגר (1:20 E:T), המציין מבחני לטווח קצר הצליח להבהיר את ההבדלים העוצמה של מוצרים שונים של תא T המכונית. כאשר ה-1:1 מעורב CD4+ ו CD8+ T הרכב תאי חלות זה וזמינותו, הם נמצאו כדי להכות CD8+ אבל לא CD4+ המכונית T תאים על cytotoxicity לטווח ארוך (איור 2B). ההרחבה של CD8+ המכונית T CD4 יישומית במשותף הסחרור הושפע תאים תאים+ , בעוד CD4+ הרחבה תא T המכונית היה עכבות בנוכחות CD8+ תאים (איור 2C).

כדי להסביר את המנגנון המבדיל את הפעילות אפקטור בין CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים, אנחנו קודם לאשר הזה 24 שעות לאחר הראשונית בשיתוף תרבות, שניהם CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים היו וזהובה מופעל (איור 3 A). בינתיים, כמצוין על-ידי ביטוי CD45RO ו CD62L, שני CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים הראתה מעבר מן הזיכרון המרכזית (CD45RO+, CD62L+) לזיכרון אפקטור (CD45RO+, CD62L–) גן # מושגים בסיסיים במהלך הגידול החוזרות על עצמן אתגר (איור 3ב). ואז אנחנו מאופיין התאים-D3 של זה assay, זמן לפני תת-קבוצות תא T המכונית התחילה להצגת ההבדל פונקציונלי. תא t תשישות סומן על-ידי הביטוי שיתוף של קולטני מעכבות PD-1, לג-3 וטים-315,21, אשר הראו CD8 הזה+ המכונית T תאים היו נוטים יותר תשישות לעומת CD4+ המכונית T תאים ( איור 3 C). עוד יותר, אין הבדל נראה על CD8+ תשישות תא T המכונית בהיעדר/הנוכחות של CD4 יישומי שיתוף+ תאים (איור 3C), המציין את CD8 CD4-induced+ הרחבה תא T המכונית אינה הקשורים פונקציה אפקטור טוב יותר.

יחד, התוצאות של זה וזמינותו זיהו את CD4+ T המכונית תאי CD8 ביצועים טובים יותר+ תאים בפרט cytotoxicity לטווח ארוך. למרות דומה לטווח קצר cytotoxicity (1-3 ימים, פעם אחת rechallenged), CD4+ המכונית T תאים אפקטור מתמשכת פונקציה עם אתגר גידול החוזרות על עצמן, תוך CD8+ תאים הפך מותש ונכשל לשלוט תא הגידול. כאשר שתי תת-קבוצות, מעורבים, CD4+ המכונית T תאים הקל ההרחבה של CD8+ המכונית T תאים, אך המצב תשישות של CD8+ תאים לא היו יושבחו, והתוצאה היא העדר אפקט סינרגיסטי בין שתי הקבוצות. דומה ההבדל בין CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים במודל ויוו נחשבה שתואר לעיל21. אכן, CD8+ המכונית T תאים הצליחו לתווך סיווג הגידול לטווח הקצר אבל בעקבות עם אנטיגן-חיוביות הישנות; לעומת זאת, CD4+ טיפול תאי T המכונית גרמו להכחדת לטווח ארוך הגידול21, וזה מזכיר את הפוטנציאל שלהם הרג חוזרות באמצעות וזמינותו rechallenge במבחנה.

Figure 1
איור 1 : אסטרטגיה הסכימה וניתוח של אתגר חוזרות assay. ציר הזמן של הגידול החוזרות על עצמן אתגר assay וסכימה של (A). עבור כל טוב, תאי T המכונית היו קודם תרבותי משותף עם תאים GBM PBT030-2 (4,000 רכב + תאים, תאים סרטניים 16,000) והזמנו מחדש עם תאים סרטניים 32,000 בכל יום אחר (D2, D4 ו- D6). ניתוח של הגידול תא T המכונית תא מס, כמו גם פנוטיפ תא T הרכב מבוצעת D1, D3, D5 ו D7. (B) Gating אסטרטגיה כדי לקבוע הרכב % ב- T תאים לפני הגדרת תרבות משותפת. (ג) Gating אסטרטגיה של תאים חיים, תאים סרטניים ותאים המכונית T מ וזמינותו אתגר חוזרות. (ד) גידול תאים מספר בתקופות שונות של rechallenge וזמינותו, תרבותי משותף עם תאי T untransduced. קווי שגיאה = ±SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : אתגר חוזרות assay מגלה הבדלים הרג ואת proliferative העוצמה בין CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים. Degranulation (א) וציטוקין תאיים מכתים של CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים לאחר 5 שעות של תרבות משותפת עם תאים GBM (E:T = 1:1). (B) CD4+, CD8+ או מעורבות (CD4:CD8 = 1:1) ותאי T המכונית הוחלו על האתגר חוזרות assay, תאים סרטניים קיימא היו לכמת. p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001 לעומת CD4+, באמצעות חד-כיווני אנובה עם בדיקות השוואה מרובים של Bonferroni. (ג) CD4+ ו CD8+ הרחבה תא T המכונית במהלך הגידול החוזרות על עצמן אתגר וזמינותו. השוואה של (משמאל לימין) CD4+ vs CD8+, משנה יחיד; CD4+ vs CD8+, בתוך הקבוצה "מעורבת"; CD4+, יחיד לעומת מעורבים; CD8+, יחיד לעומת מעורב. p < 0.05, * *p < 0.01, * * * באמצעות מבחן t של סטודנט אינטראקציתפיסי < 0.001. קווי שגיאה = ±SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : ניתוח של תא T פנוטיפ במהלך האתגר חוזרות assay. (א) 4-1BB, CD69 מכתים בתאי T רכב-D1 של וזמינותו. (B) CD45RO ו- CD62L מכתים של תאי T רכב לפני החלת rechallenge assay (קלט), ו- D3 ו- D7 של וזמינותו. (ג) ביטוי משותף של PD-1, לג-3 וטים-3 על תאי T רכב-D3 של וזמינותו. (למעלה) Gating אסטרטגיות כדי לזהות תאים T המבטאים קולטנים מעכבות 1, 2 או 3. (למטה) השוואה של: CD4+ (משנה יחיד), תאי CD8+ (משנה יחיד), תאי CD8+ תאים (בתוך הקבוצה "מעורבת"). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Table 1
טבלה 1: צלחת נציג מפת rechallenge ההתקנה.

Discussion

Assay האתגר הזה תא הגידול שחוזרת על עצמה מספקת גישה נוחה כדי להעריך את המכונית T תא פונקציונלי האון, באמצעות התקנה במבחנה זה recapitulates את נטל הגידול גבוהה המשויך הגידול ויוו מודלים. במהלך זה assay 7 ימים, תאי T רכב לעבור ארבעה סיבובים של אתגר גידול (תרבות משותפת הראשונית, 3 x rechallenge), יצירת סביבה שבה תאי T מותש עלול לאבד שלהם יכולת להגיב עם אתגר גידול למרות לתגובה הראשונית חזק. חיסול תאי גידול והתרחבות תא T המכונית מייצגים שתי הקריאות הבאות יסוד זה ניתן לרכוש מ- assay הזה, בעוד הפנוטיפים של תאי T המכונית ניתן לנתח בקלות על ידי צביעת משטח או תאיים סמנים המציינים ההפעלה תא T, תשישות ו/או זיכרון. זה וזמינותו נוח גם לשלב עם אפשר לקבל ניתוח של המכונית T תאים transcriptome פרוטאום או זרחן-פרוטאום21,26, polyfunctionality תא T אשר כבר אומץ כדי לחזות לתגובות הקליניות27. יתר על כן, תאים סרטניים יכול להיבדק גם על תגובתם מסתגלת נגד תא T חסינות כגון הפרשת ציטוקינים28. מאז דגימות נקצרים בנקודות זמן מרובים, וזמינותו הזה מאפשר לא רק רעש סטטי, אלא גם ניתוח דינאמי של המכונית T בהתנהגות התא בעת להגיב למספר עודף של תאים סרטניים.

וזמינותו היא חזקה במיוחד להשוות את העוצמה אפקטור של תאי T המכונית מיקוד אנטיגן זהה אבל עם עיצובים שונים ו/או בתהליכי ייצור. השתמשנו assay זו כדי לזהות את CD4+ המכונית T תאים הצליחו לתווך מעולה לטווח ארוך אפקטור פונקציה מ- CD8+ תאים21. זה הוצג גם שאת היעילות המכונית ויוו היה בקורלציה עם cytotoxicity בנקודות זמן מאוחר יותר (D5-D7) במהלך הזה assay, נוסף המדגיש את נחיצות באמצעות הגידול החוזרות על עצמן אתגר להערכה תא T המכונית במבחנה. למרות תאים GBM שימשו הדוגמה של התאים היעד כאן, זה וזמינותו שיוכלו בקלות לאמץ שילוב תא T-גידול שונים. ראוי לציין, בהתנהגות התא המכונית T יכול להשתנות גם על צפיפות אנטיגן שונים, הנדסת תאים סרטניים לבטא רמות שונות של אנטיגנים יישוב סיפק את הכלי כדי לחקור להתרחשויות מולקולריים רציפים זיהוי המכונית29. לכן, ניתן לנצל assay הזה גם לבחון את דפוס ההפעלה של תאים T רכב מסוימים נגד מטרות שונות.

מאז הכדאיות תא היעד והתרחבות תא T רכב שני המפרט מראש של assay הזה, זה קריטי בכל התרבויות שיתוף להתחיל עם בת קיימא (> 70%) הגידול ותאי T. בעת ביצוע התהליכים rechallenge, הפעולה של התקשורת שואבת (שלב 5.3) כדאי לא להפריע הגידול ותאי T בתחתית הבארות, כדי לא להציג וריאציות מיותרים של ספירת תאים. בעת ביצוע וזמינותו זה בשורות תא היעד ההשעיה, מומלץ כדי לקצור בתאי שנותרה על ידי צנטריפוגה לפני הגידול תא rechallenge.

מגבלה אחת של זה וזמינותו היא כי הגדרת הפרמטרים (יחסי E:T של תרבות משותפת הראשונית rechallenge) צריכה תיקון בהתבסס על שילובים שונים של המכונית-הגידול. לדוגמה, אם תאים סרטניים אקספרס רמה משמעותית של מולקולות מעכבות-חיסונית (למשל PD-L1), יחס גבוה יותר של E:T מומלץ בהתחשב בעובדה הכולל הרג יעילות הוא לקוי לעומת תאים סרטניים PD-L1-נמוכה. לפני החלת וזמינותו שילובים רכב-גידול חדש, מחקר פיילוט מומלץ לקבוע את התנאים אופטימליים, בדרך כלל המאפשר תאי T המכונית הקטלניים ביותר במקצועות וזמינותו לחסל > 80% של תאים סרטניים על נקודת הקצה. מאז קשר ישיר תא תא נדרש עבור המכונית בתיווך תא T להרוג, אם תאים סרטניים התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית, ואז הפאנל של ניתוח תזרים cytometric שתישמר בהתאם (למשל אם בתאי הגידול היו GFP שכותרתו, ואז כל FITC-מצומדת נוגדנים לא אמור לשמש).

הפעילות הקלינית של תאי T מכונית נגד מחלות ממאירות של תא B הוביל שתי תרופות שאושרו על-ידי ה-FDA. עם זאת, התגובה הראו וריאציה ניכר על פני לחולים שונים27,30,31, אשר היה מבואר לתאם עם המאפיינים פנוטיפי של מוצרים רכב30. Assay האתגר הזה הגידול שחוזרת על עצמה במבחנה נוספת מספק גישה פונקציונלית לבחון את הפוטנציה אפקטור המכונית בנוסף אפיוני פנוטיפי וייצור ציטוקינים polyfunctionality, ומאפשר להקרנה תפוקה גבוהה יותר של מוצרים קליניים לעומת הגידול ויוו מודלים תוך שמירה על אמינות חזויה. בסך הכל, וזמינותו הזה יכול לשמש לבדיקת תפקודי תא T עבור המכונית T תא עיצוב, פיתוח פרה-קליניים ומחקרים קליניים.

Disclosures

הבונה המכונית המתואר בעבודה זו יש ברשיון על-ידי ביו מוסטנג., inc., אשר S.J.F. ו- C.E.B. לקבל תשלומי תמלוגים. כל המחברים אחרים מצהירים שאין פוטנציאל ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממכון קליפורניה עבור רפואה רגנרטיבית (CIRM) גרנט TR3-05641 ומענקים NIH P30 CA33572 (ליבות). D.W. נתמך על ידי NCI מלגת 1F99CA234923-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS without Calcium and Magnesium Corning MT25051CI
1 M Hepes Irvine Scientific 9319
200 mM L-Glutamine Cambrex Bio Science 17-605E
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) - FluoroPure grade Invitrogen D21490
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) Novartis Oncology NDC 0078-0495-61
Anti-CD137, PE BD Biosciences 555956 4B4-1
Anti-CD19, PE-Cy7 BD Biosciences 557835 SJ25C1
Anti-CD3, PERCP BD Biosciences 340663 SK7
Anti-CD4, FITC BD Biosciences 340133 SK3
Anti-CD45, PERCP BD Biosciences 340665 2D1
Anti-CD45RO, PE BD Biosciences 561137 UCHL1
Anti-CD62L, APC BD Biosciences 559772 DREG-56
Anti-CD69, APC BD Biosciences 340560 L78
Anti-CD8, APC-Cy7 BD Biosciences 348793 SK1
Anti-IL-13, PE BD Biosciences 340508 JES10-5A2
Anti-LAG-3, PE eBiosciences 12-2239-41 3DS223H
Anti-PD-1, APC-Cy7 BioLegend 329921 EH12.2H7
Anti-TIM-3, APC eBiosciences 17-3109-42 F38-2E2
B-27 Serum-Free Supplement (50x) Invitrogen 17504-044
Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) Corning Life Sciences 3596
Defined fetal bovine serum,HI IR Hyclone Labs SH30070.03IH
DMEM F-12 50:50 (1x) without Glutamine MediaTech, Inc. 15-090-CV
DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L Invitrogen 11960051
DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES Fisher Scientific MT10092CV
HBSS Irvine Scientific 9224
Heat-Inactivated FCS Hyclone SH30070.03
Heparin Sodium(1,000 U/mL) American Pharmaceutical 401811B
MACSQuant Milteni Biotech Inc. BIS013220 
PBS 1x W/CA & MG Irvine Scientific 9236
PBS with 1 mM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) VWR Scientific Products PB15009A
Recombinant human EGF R&D Systems 236-EG-200
Recombinant human FGF R&D Systems 233-FB
rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) CellGenix, US Operations tF0297
Sodium Azide (NaN3) Sigma S8032
Sorvall ST40R Thermo Scientific 41693700
TC-HEPES BUFFER (1 M) SOLN 100ML  IRVINE SCIENTIFIC CORP 6472
Tecnol Procedure Mask Kimberly-Clark 47117
X-VIVO 15 Lonza BW04-744Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).
  3. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  4. Lee, D. W., et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).
  5. Yong, C. S. M., et al. CAR T-cell therapy of solid tumors. Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).
  6. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
  7. Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. Smart CARs engineered for cancer immunotherapy. Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).
  8. Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).
  9. Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials. Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).
  10. Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
  11. Brown, C. E., et al. Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma. Molecular Therapy. , (2017).
  12. Long, A. H., et al. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).
  13. Cherkassky, L., et al. Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition. The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).
  14. Priceman, S. J., et al. Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer. Oncoimmunology. 7 (2), 1380764 (2018).
  15. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
  16. Gattinoni, L., et al. Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).
  17. Malandro, N., et al. Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion. Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).
  18. Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
  19. Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
  20. Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell. Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).
  21. Wang, D., et al. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), (2018).
  22. Kahlon, K. S., et al. Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells. Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).
  23. Brown, C. E., et al. Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells. Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).
  24. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  25. Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
  26. Salter, A. I., et al. Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function. Science Signaling. 11 (544), (2018).
  27. Rossi, J., et al. Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL. Blood. 132 (8), 804-814 (2018).
  28. Garcia-Diaz, A., et al. Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression. Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).
  29. Walker, A. J., et al. Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase. Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).
  30. Fraietta, J. A., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
  31. Fraietta, J. A., et al. Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells. Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).

Tags

לחקר הסרטן גיליון 144 חיסוני העברה לתא המאמצת תרבות משותפת assay העוצמה אפקטור הפונקציה לטווח ארוך תשישות תא t
ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, D., Starr, R., Alizadeh, D.,… More

Wang, D., Starr, R., Alizadeh, D., Yang, X., Forman, S. J., Brown, C. E. In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function. J. Vis. Exp. (144), e59275, doi:10.3791/59275 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter