Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

عزل وتلطيخ الخلايا الكيراتينية الجلد الماوس لدورة الخلية تحليل محدد للتعبير البروتين الخلوي عن طريق قياس الخلايا الشامل

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59353
Automatic Translation
1, 1
1Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية عزل خلايا القرنية الجلدية من نماذج الماوس، ووصمة عار مع الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية، وتحليل الخلايا الملونة عن طريق قياس الخلايا الشاملة من أجل تحديد نمط التعبير من البروتينات ذات الأهمية في مراحل دورة الخلية المختلفة.

Abstract

الهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن وقياس التغيرات في التعبير البروتين بطريقة تعتمد على دورة الخلية باستخدام خلايا واحدة معزولة عن البشرة من جلد الماوس. هناك سبع خطوات هامة: فصل البشرة عن الأدمة، وهضم البشرة، وتلطيخ مجموعات الخلايا الجلدية مع سيسبلاتين، والترميز عينة، وتلطيخ مع الأجسام المضادة المعدنية الموسومة لعلامات دورة الخلية والبروتينات من الفائدة، والكشف عن الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية عن طريق قياس الخلايا الشامل، وتحليل التعبير في مختلف مراحل دورة الخلية. ميزة هذا النهج على الأساليب النسيجية هي إمكانية تحليل نمط التعبير من > 40 علامات مختلفة في خلية واحدة في مراحل مختلفة من دورة الخلية. كما يسمح هذا النهج لتحليل الارتباط متعدد المتغيرات للتعبير البروتيني الذي هو أكثر قابلية للقياس الكمي من أساليب النسيج/التصوير. العيب في هذا البروتوكول هو أن هناك حاجة إلى تعليق الخلايا المفردة، مما يؤدي إلى فقدان معلومات الموقع التي يوفرها تلطيخ أقسام الأنسجة. وقد يتطلب هذا النهج أيضاً إدراج علامات إضافية لتحديد أنواع الخلايا المختلفة في حالات تعليق الخلايا الخام. تطبيق هذا البروتوكول واضح في تحليل نماذج أمراض الجلد فرط البلاستيك. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لتحليل نوع فرعي محدد من الخلايا (مثل الخلايا الجذعية) بإضافة أجسام مضادة خاصة بالنسب. ويمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لتحليل خلايا الجلد في الأنواع التجريبية الأخرى.

Introduction

لا يزال ارتباط التعبير الجيني بمراحل دورة الخلايا يشكل تحدياً في تحليل النماذج الحيوانية لأمراض فرط التنسج مثل السرطان. ويتمثل جزء من هذا التحدي في الكشف المشترك عن البروتينات ذات الأهمية مع علامات الانتشار. يمكن العثور على الخلايا التكاثرية في مراحل دورة الخلايا المختلفة بما في ذلك G1، S، G2، وM. Ki67 هي واحدة من علامات الانتشار الأكثر استخداما ويتم التعبير عنها في جميع مراحل دورة الخلية. وقد استخدمت على نطاق واسع في تحليل كلمن الإنسان والأنسجة الماوس 1،2،3. ومع ذلك، مثل غيرها من علامات الانتشار العامة، Ki67 لا يميز مراحل دورة الخلية الفردية. نهج أكثر دقة يستخدم دمج النظائر النيوكليوتيد الثيميدين مثل بروموديوكسيوريبين (BrdU) في الخلايا التي تكرر بنشاط الجينوم (أي المرحلة S)4،5. عيب واحد لاستخدام النظائر النيوكليوتيد هو الحاجة إلى إدارتها للعيش الحيوانات قبل ساعات من التحليل. يتم الكشف عن Ki67 وBrdU عادة على أقسام الأنسجة الثابتة عن طريق استخدام الأجسام المضادة. وتتمثل إحدى مزايا هذا النهج في أنه يمكن التأكد من موقع POIs داخل بنية الأنسجة (على سبيل المثال، الطبقة القاعدية من البشرة الجلدية). ولا يتطلب هذا النهج أيضاً تفكك الأنسجة الذي قد يؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني. أحد العيوب هو أن تثبيت الأنسجة أو معالجة الأنسجة لOCT المجمدة أو تقسيم البارافين قد occlude أهداف الأجسام المضادة (أي، مستضدات). استرجاع المستضدات يتطلب عادة الحرارة أو هضم الأنسجة. كما يمكن أن يكون تحديد حجم التلطيخ أمراً صعباً. ويرجع ذلك إلى الاختلافات في تلطيخ، سمك القسم، وكشف إشارة، والتحيز المجرب. وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن عدد محدود من العلامات في وقت واحد في معظم التجهيزات المختبرية النموذجية. ومع ذلك، فإن نُهُج تلطيخ المضاعفات الأحدث تعد بالتغلب على هذه القيود؛ أمثلة هي التصوير قياس السيتومترية الجماعية وتضخيم إشارة التيراميد6،7.

قياس التدفق هو آخر التكنولوجيا القوية للكشف عن الخلايا المنتشرة. فإنه يسمح للكشف عن متعددة من علامات في نفس الخلايا ولكن يتطلب تفكك الأنسجة لمعظم أنواع الخلايا غير المكونة للدم. يتم تحليل الخلايا المتكاثرة بشكل روتيني باستخدام الأصباغ التي تربط الحمض النووي (على سبيل المثال، بروبيوديوم يوديد (PI))8. تدفق cytometry يسمح أيضا تحديد أكثر دقة من مراحل دورة الخلية عندما يقترن الكشف عن إدراج BrdU9. على الرغم من اتباع نهج قوي، BrdU / PI تدفق قياس السيتومترية لديها عيوبها. وهي غير قادرة على حل مرحلتي G2/M وG0/G1 دون إدراج أجسام مضادة خاصة بالمرحلة. ومع ذلك، فإن عدد الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها محدود بالفلورة الخلوية، والانتشار الطيفي لانبعاثات الفلوروفور، واستخدام ضوابط التعويض. هذا القيد علامات عليه أكثر تحديا وشاقة للكشف عن التعبير عن علامات دورة الخلية مع POIs. وهناك نهج أكثر سهولة هو استخدام قياس السيتومتري ة الشامل10،11. وتستخدم هذه التكنولوجيا الأجسام المضادة المترافقة المعدنية التي لها طيف كشف أضيق. مرة واحدة يتم تلوين الخلايا مع الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية، يتم تبخرها، والمعادن التي تم الكشف عنها عن طريق قياس الطيف الكتلي وقت الطيران (CyTOF). نظرًا لهذه الخصائص، يتيح قياس السيتومتري ة الكتلة الكشف المتعدد المضاعفات عن >40 علامة مختلفة باستخدام الأنظمة الأساسية الموجودة10و11 . وبالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن لعينات الباركود مع المعادن التي تؤدي إلى وفورات الأجسام المضادة الثمينة مع الحد من العينة إلى عينة تلطيخ تقلب. من ناحية أخرى، قياس السيتومتري ة الكتلة لديه العديد من العيوب. هناك عدد محدود من الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن المتاحة تجاريا للخلايا المشتقة من الدم غير الدم. القياس الكمي لمحتوى الحمض النووي أقل حساسية مقارنة باستخدام أصباغ الحمض النووي الفلورية والقياس الخلوي الشامل لديه مجموعة ديناميكية منخفضة من الكشف عن إشارة بالمقارنة مع قياس تدفق الفلورة.

تم تصميم البروتوكول الموضح هنا لتحليل ديناميات دورة الخلية من الخلايا الكيراتينية المعزولة حديثا (KCs) من جلد الماوس وتميز خلية دورة تعبير البروتين محددة في هذه الخلايا باستخدام قياس الخلايا الشامل. يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضًا مع الخلايا المستزرعة أو تكييفه مع أنواع الخلايا الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للالحيوانات في جامعة كولورادو أنشوتز على التجارب الحيوانية الموصوفة في هذا البروتوكول.

1 - الأعمال التحضيرية

  1. تصميم لوحة الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية. استخدام الحرة على الانترنت لوحة تصميم البرمجيات12 وتشمل 127يودودوكيوريدين (IdU)، 164Dy (Dysprosium) وصفت المضادة للCCNB1 (CYCLIN B1)، 175لو (لوتيتيوم) فوسفو (ع)-HISTONEH3Ser28 (pHH3)، و 150 Nd (النيوديميوم)-pRETINOBLASTOMA البروتينSer807/811 (pRB)13. إضافة أجسام مضادة إضافية ذات علامات معدنية لا تتداخل في إشارة القناة14.
  2. إعداد حل أسهم IdU. حل مسحوق إيدو في 10 ملغ / مل في 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم في 60 درجة مئوية. Aliquot IdU الأوراق المالية الحل في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة وتجميد في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
    1. ضبط النتيجة الهيدروجينية للمحلول IdU إلى 7.5 مع 12 N حمض الهيدروكلوريك مباشرة قبل الاستخدام. اختبار مع شريط الحموضة على aliquot تجاهل لضمان الحل هو في pH 7.5.
      ملاحظة: الوقت لفترات طويلة (>5 دقيقة) من IdU في الحموضة 7.5 سيؤدي إلى هطول الأمطار وهناك حاجة aliquot جديدة من IdU عندما يحدث هذا.
    2. استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (على سبيل المثال، القفازات، معطف المختبر، ونظارات السلامة) والعمل في خزانة السلامة عند التعامل مع حلول هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك.
  3. إعداد 2X بارافورمالهايد (PFA) حل تحديد. الجمع بين 5 مل من 10X PBS (درجة الحموضة 7.5) و 1 مل من 16٪ PFA مع 44 مل من الصف الجزيئي النقي dH2O (3.2٪ التركيز النهائي).
    ملاحظة: يمكن إعداد مخزون من PFA كما نشرت سابقا15 أو شراء 16٪ من الأسهم خالية من المعادن الملوثة.
    1. استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة والعمل في مجلس الوزراء السلامة عند التعامل مع مسحوق PFA والحلول.
  4. إعداد الباريوم (با2 +) مجانا 1X PBS عن طريق الجمع بين 5 مل من المعادن خالية PBS 10X (الرقم الهيدروجيني 7.5) مع 45 مل من الصف الجزيئي النقي dH2O.
    ملاحظة: إن نوعية PBS وغيرها من الكواشف مهمة جداً لتجنب تلوث المعادن التي يمكن أن تحدث ضوضاء في الخلفية أثناء تحليل البيانات السيتومترية الكتلية.
  5. إعداد 100 مل سيسبلاتين الأوراق المالية الحل. حل 300.5 ملغ من مسحوق سيسبلاتين في 10 مل من DMSO. يُحفظ في العليكوت عند -80 درجة مئوية. إعداد 10 مل cisplatin حل العمل للتجارب لاستخدامها أكثر من 1 د.
  6. إعداد حلول فصل البشرة / الأدمة. إعداد محلول مخزون dispase 20X عن طريق حل 30 ملغ في 1 مل من HBSS أو PBS. تصفية تعقيم من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينها في aliquots في -20 درجة مئوية. إعداد 1X نوع الرابع كولاجيناز الأوراق المالية الحل في 1 ملغ / مل في HBSS، تصفية تعقيم من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر، وتخزين aliquots في -20 درجة مئوية.

2. وضع العلامات على المرحلة S من قبل تأسيس IdU

  1. وزن الفئران. استخدام P1-P3 الجرو حديثي الولادة أو 8-10 أسابيع الفئران الكبار القديمة واستخدام الفئران الذكور أو الإناث من C57BL/6، FvB، أو 129 خلفيات. تحديد جرعة في 0.1 ملغ إيدو (الحموضة 7.5) / ز وزن الجسم. على سبيل المثال، يتطلب ماوس 25 جم 0.25 مل من IdU.
  2. إدارة جرعة IdU عن طريق حقن داخل احصان الخلايا والانتظار لمدة 2 ساعة قبل حصاد الخلايا. استخدام حقنة درنة لحقن الجرو حديثي الولادة.
    ملاحظة: يمكن استخدام جرعة من 2 ملغ / مل من IdU مع خلايا زراعة الأنسجة مع حضانة 1 ساعة في 37 درجة مئوية قبل الحصاد ووضع العلامات للخلايا الجماعية.

3. عزل الخلايا لوضع العلامات

  1. ذوبان ديسباس وكولاجيناز حلول الأسهم. تخفيف محلول الأسهم ديسباسي 20X إلى 1X (1.5 ملغ / مل) في HBSS أو PBS معقمة. يُحفظ على الجليد حتى يصبح جاهزاً للاستخدام.
  2. الجمع بين 2 مجلدات من dispase مع 1 حجم الكولاجين في حجم إجمالي يسمح للبشرة لتطفو بحرية. على سبيل المثال، يمكن طرح هضم 5 جلود ماوس حديثي الولادة على 8 مل من 1x ديسباس مع 4 مل من الكولاجين في طبق بيتري 100 مم.
  3. اتبع الطرق المعتمدة لقتل الفئران التجريبية (على سبيل المثال، جرعة زائدة من الأيسوفلوران/ فحص قرصة القدم أو استنشاق ثاني أكسيد الكربون/خلع عنق الرحم). تنظيف جلد الأذن الكبار مع محلول اليود (انظر جدولالمواد) وشطف بالماء المعقم عندما الخلايا المعزولة لاستخدامها في زراعة الأنسجة.
  4. إزالة الأذن جراحيا في القاعدة (الشكل1A). شطف الأذنين في PBS معقمة عندما يتم استخدام الخلايا المعزولة لثقافة الأنسجة. توضع على طبق بيتري جاف 100 مم.
  5. فصل أمامي بعناية من الجلد الخلفي عن طريق إنشاء في البداية جيب في منتصف أو حافة منطقة القطع باستخدام ملقط غرامة وسحب اثنين من اللوحات الجلد بعيدا (الشكل 1B-D). المضي قدما مع كل من الجلود الأمامية والخلفية.
    ملاحظة: يتم توفير تعليمات مفصلة لتشريح جلد الفأر الوليدي من قبل Litchi وآخرون16 بالإضافة إلى ذلك، قد يساعد استخدام نطاق تشريح في فصل الأمامي من الجلد الخلفي وتحديد الجانبين البشرة / الجلد من تشريح الجلد: الشعر مرئي على الجانب البشرة في حين أن الأدمة سيكون لها مظهر الجيلاتين.
  6. وضع بعناية الجلود الأمامية والخلفية للأذن مع الجانب الأدمة من الجلد لمس محلول ديسباس / كولاجيناز (الشكل 1E). استخدم 1 مل لكل من الجلد الأمامي والخلفي لأذن واحدة لكل بئر من طبق ثقافة جيد 12. الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، بدلاً من ذلك، تطفو الجلود على محلول ديسباسي 1x عند 4 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
    ملاحظة: العمل في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة مع تقنية معقمة عندما الخلايا التي سيتم التتزرّعها.
  7. ضع يهضم الجلد مع الجانب البشرة لمس سطح طبق بيتري نظيفة. تسطيح الجلد والانزلاق بلطف الأدمة قبالة البشرة من خلال العمل من مركز إلى حواف في نمط دائري.
  8. تجاهل الأدمة أو هضمه كذلك لتحرير الخلايا الليفية لثقافة الأنسجة أو التحليل16.
    ملاحظة: الأدمة سوف تكون أكثر قتامة في المظهر ولها تكوين الجيلاتين ولزجة. يجب أن يأتي الأدمة بسهولة قبالة. الفشل أو صعوبة في إزالة الأدمة يشير إلى عدم كفاية هضم الأنسجة. ومع ذلك، فإن الحضانة الموسعة في المخزن المؤقت الهضم تقلل من قدرة الخلية على البقاء. سوف تبقى البشرة على طبق بيتري وسيكون لها مظهر ابيض.
  9. رفع بلطف قبالة البشرة عن طريق الاستيلاء على حواف وقشر قبالة سطح طبق بيتري. ضع البشرة بعناية على حل مفرزة الخلايا الدافئة مسبقاً (انظر جدولالمواد) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية أو 20 دقيقة في RT. استخدم 500 ميكرولتر من محلول مفرزة الخلايا لـ 2 من البشرة الأذن البالغة لكل بئر من لوحة ثقافة الآبار 12 واستخدام 750 ميكرولتر من مفرزة الخلايا حل لالبشرة حديثي الولادة واحد لكل بئر من 6 لوحة ثقافة جيدا.
  10. فهم البشرة باستخدام ملقط معقمة وفرك عن طريق سحب البشرة ضد الجزء السفلي من الطبق إلى فصل الخلايا. إضافة 1 مل من DMEM تحتوي على 1٪ FBS (0.01 مل) وتمر من خلال منخل خلية 40 ميكرومتر في أنبوب جمع. شطف جيدا مع 2 مل إضافية من DMEM وإضافة إلى تعليق الخلية.
  11. الطرد المركزي في 120 × ز لمدة 5 دقائق.
  12. إعادة تعليق بيليه الخلية في 1-2 مل من DMEM تحتوي على 1٪ FBS. تحديد الخلية ونسبة حساب الخلايا الحية باستخدام الأزرق Trypan ومقياس الهيموكيتوميمتر أو جهاز العد الآلي. خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 3.11.
    ملاحظة: يمكن زراعة الخلايا في وسائط زراعة الأنسجة المناسبة بعد الخطوة 3.12. 17 سنة

4. سيسبلاتين وضع العلامات لتحديد الخلايا الحية / الميتة

  1. إعادة تعليق 1-3 × 106 خلايا لكل 1 مل من DMEM تحتوي على 25 ميكرومتر سيسبلاتين (2.5 ميكرولتر من المخزون / مل). حضانة لمدة دقيقة واحدة وتبريد عن طريق الأنابيب مع حجم متساو من FBS (على سبيل المثال، 1 مل).
  2. الطرد المركزي في 120 × ز لمدة 5 دقائق Decant supernatant في كوب يحتوي على التبييض المخفف وأنابيب عكس لاستنزاف الحل المتبقي على منشفة ورقية. اضغط بلطف لتحرير الحل المتبقي على بيليه والجدار الجانبي للأنبوب.
  3. إعادة تعليق بيليه الخلية في 2 مل من Ba+2خالية PBS. خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 4.2.
    ملاحظة: من المستحسن إصلاح الخلايا إذا كان لا يمكن تلوينها فوراً.

5. تثبيت الخلايا وصفت سيسبلاتين (اختياري)

  1. إعادة تعليق 1-3 × 106 سيسبلاتين الخلايا المسماة في 1 مل من Ba+2خالية PBS. دوامة الخلايا تحت الطاقة المنخفضة المستمرة وإضافة إسقاط 1 مل (1 حجم) من المخزن المؤقت تثبيت PFA 2X. احتضان في RT لمدة 10 دقائق على منصة هزاز.
  2. خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 4.2، ولكن الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق.
  3. غسل الخلايا مع 2 مل من Ba+2خالية PBS وخلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2. كرر الخطوة 5.3 مرة واحدة.
  4. إعادة تعليق بيليه في 2 مل من Ba+2خالية PBS. تخزين في 4 درجة مئوية ل <3 د. إضافة FBS إلى 3٪ (على سبيل المثال، 0.3 مل من FBS / مل من الخلايا) من الحجم الإجمالي إذا تخزين أطول > 3 د، ثم مزيج وتجميد في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد يؤثر التثبيت على الكشف عن بعض الepitopes. يجب تحديد آثار التثبيت على إشارة الأجسام المضادة تجريبياً.

6. فك التشفير من العينات (اختياري ولكن الموصى بها)

  1. خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2 ثم إعادة تعليق 1-3 × 106 خلايا في 1 مل من 1X تثبيت العازلة (انظر جدول المواد). حضانة في RT لمدة 10 دقيقة خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2.
  2. غسل الخلايا مع 1 مل من الباركود نفاذية العازلة (انظر جدولالمواد). خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2. كرر الخطوة 6.2 مرة واحدة.
  3. إضافة 100 درجة مئوية من الباركود نفاذيبيليت العازلة إلى الباركود (انظر جدولالمواد)18 ومزيج على الفور في حين أن الخلايا من الخطوة 6.2 هي التكوير.
  4. إعادة تعليق بيليه الخلية في 800 درجة مئوية من الباركود نفاذية العازلة. إضافة حل الباركود إلى الخلايا، مزيج وحضانة في RT لمدة 30 دقيقة خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2. غسل الخلايا في 2 مل من خلية تلطيخ العازلة (انظر جدولالمواد) وبيليه مرة أخرى.
    ملاحظة: يمكن تسمية ما يصل إلى 20 عينة مع تركيبات مختلفة من معادن البلاديوم18. ويرد وصف لاستراتيجيات الترميز الأخرى في أماكن أخرى15.

7. وضع العلامات على الخلايا للخلايا الشاملة

  1. إعادة تعليق 1-3 × 106 خلايا في 1 مل من المستضد النووي وصمة عار العازلة حل العمل (انظر جدول المواد). الجمع بين العينات في أنبوب واحد للخطوات اللاحقة عند استخدام عينات الباركود. حضانة في RT لمدة 30 دقيقة بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2.
  2. إعادة تعليق 1-3 × 106 خلايا في 2 مل من المستضد النووي تلطيخ نفاذية العازلة (انظر جدولالمواد). مقياس حسب الضرورة. على سبيل المثال، استخدم 6 مل من المخزن المؤقت لـ 10 عينات مدمجة مع عدد خلايا 9 × 106 خلايا. بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2.
  3. كرر الخطوة 7.2. دوامة بلطف بيليه الخلية في حجم المتبقية اليسار في الأنبوب.
  4. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة داخل الخلايا لكل 1-3 × 106 خلايا. مقياس حسب الضرورة. على سبيل المثال، استخدم 150 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لـ 10 عينات مجمعة مع عدد خلايا من 9 × 106 خلايا. مزيج وحضانة في RT لمدة 45 دقيقة إضافة 2 مل من الخلية تلطيخ العازلة وبيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2.
  5. إعادة تعليق 1-3 × 106 خلايا بيليه في 2 مل من الخلية تلطيخ العازلة. خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2. كرر الخطوة 7.5 مرة واحدة.
    ملاحظة: يمكن استخدام حلول عازلة أخرى لتلطيخ الغشاء خارج الخلية أو علامات السيتوبلازمية والمجربة قد يكون لتحسين تلطيخ إذا كانت هناك حاجة للكشف عن epitopes في مواقع خلوية مختلفة. يمكن أيضًا إصلاح الخلايا في PFA بعد الخطوة 7.5 عند استخدام الخلايا الحية للتلطيخ.
  6. إعادة تعليق 1-3 × 106 خلايا في 1 مل من محلول التشذيب وتخزينها لمدة 1-3 د عند 4 درجة مئوية.
    1. تخزين الخلايا في -80 درجة مئوية في DMSO تحتوي على الحل لخلايا بيليه > 3 د. كما هو موضح في الخطوة 5.2 إذا كانت الخلايا في حل التشبيك. إعادة تعليق بيليه (1-3 × 106 خلايا) في 1 مل من الخلية تلطيخ العازلة وخلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من 10٪ DMSO / 90٪ FBS19،نقل إلى التبريد، ووضع هافيحاوية تجميد isopropanol، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  7. خلايا بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2. غسل 1-3 × 106 الخلايا مع 2 مل من الخلية تلطيخ العازلة، بيليه كما هو موضح في الخطوة 5.2. قم بإجراء غسلين إضافيين مع 2 مل من الماء، كما هو موضح في الخطوة 5.2.
  8. تخفيف الخرز معايرة EQ 1:9 في الماء (حل الأوراق المالية في 3.3 × 105 الخرز / مل).
  9. إعادة تعليق بيليه الخلية في تركيز 1 × 106 خلايا / مل مع تخفيف EQ حبة الحل. تصفية الخلايا من خلال 35 ميكرومتر أنابيب تدفق غطاء مصفاة.
  10. تشغيل عينات على مقياس السيتومتر الشامل والحصول على البيانات. سيتم إيداع البيانات بتنسيق ملف قياس التدفق Cytometry قياسي (FCS).

8 - تجهيز وتحليل ملفات بيانات القياس السيتومي الشامل

  1. تطبيع ملفات FCS. استخدام برنامج مجاني متاح في20 https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest
  2. Deconvolute الباركود ملفات FCS. فصل مجموعة الباركود المجمعة في ملفات الباركود منفصلة مع برنامج مجاني متاح في https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
  3. تحليل ملفات FCS التي تمت تسويتها. استخدم برامج تجارية21أو22 أو مجانية (انظر web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الجدول 1 الغلة المتوقعة للخلايا وجدوى الأذن الفأرة البالغة (الشكل 1) وجلد حديثي الولادة في ظروف غير مرضية. ويبين الجدول أيضا بيانات تمثيلية للأراضي من خلفية مختلطة من C57/126. ومن المتوقع أن الجلد من سلالات أخرى من شأنه أن يؤدي إلى غلة الخلايا مماثلة وحيوية. ويعتمد العائد التقريبي على المساحة السطحية للبشرة ويشير إلى أن جلد حديثي الولادة سيكونخياراً أفضل للتجارب التي تتطلب أعداداً أكبر من الخلايا (الجدول 1). انخفاض الغلة أو انخفاض القدرة على البقاء (<50%) تشير إلى مشاكل في الهضم أو الظروف التجريبية التي تقلل من سلامة الجلد أو تحفز موت الخلايا. زراعة الخلايا مع وسائل الإعلام المناسبة والمكملات الغذائية يمكن أن تساعد في تقييم نوعية الاستعدادات KC17.

بعد التطبيع20 وdeconvulation18 من ملفات FCS، فإن جمع البيانات تحديد مجموعات الخلايا البشرة ذات الأهمية وdemark مراحل دورة الخلية الفردية (الشكل2). في المؤامرات ثنائية المتغيرات مقارنة 191الأشعة تحت الحمراء مقابل 193قنوات الأشعة تحت الحمراء، يمكن أن تكون بوابة الخلايا سليمة في الربع الأيمن العلوي (الشكل2A). رسم طول الحدث مقابل 191Ir وتحديد كتلة ضيقة من الخلايا بالقرب من 191محور الأشعة تحت الحمراء demarks خلايا واحدة. يتم اختيار الخلايا القابلة للحياة في مؤامرة من 195Pt مقابل 193رسم Ir عن طريق gating للخلايا مع مستويات منخفضة 195Pt. وللعينة المبينة في الشكل 2ألف لديها حطام وزيادة وجود الخلايا غير القابلة للحياة التي تحمل اسم سيسبلاتين. وهذا قد يشير إلى أن العينة كانت مبالغ فيها، التعامل معها بقسوة، أو تركت على الجليد أو RT لفترة طويلة جدا قبل تلطيخ لقياس السيتومترية الشامل. الملامح من الخلايا المستزرعة الأنسجة تعطي عادة نسب أعلى من الخلايا السلبية 195Pt (الشكل2B). بدلا من ذلك، يمكن توقع وجود 195Pt الخلايا الإيجابية إذا كان موت الخلية التعريفي سمة من سمات النموذج التجريبي و / أو الظروف.

ومن الناحية المثالية، ينبغي إدراج العلامات التي تحدد السكان المهتمين في تحليل أنواع خلايا محددة. على سبيل المثال، يمكن الكشف عن الخلايا المناعية التي من المتوقع أن تكون موجودة في تعليق KC الخام عن طريق إضافة الأجسام المضادة CD4523، الذي يكشف الخلايا المكونة للدم (الشكل2C). فيما يتعلق بانتشار لوحة الأجسام المضادة13، والتآمر IdU مقابل CYCLIN B1 يحل مراحل دورة الخلية (الشكل2C)مماثلة لمعيار BrdU / PI مؤامرة تدفق (الشكل2D)،مما يسمح للكشف عن S-المرحلة، G0 / G1 و G2 / M الخلية السكان. في IdU مقابل قطعة أرض pHH3، تحدد الإيجابية pHH3 عالية خلايا المرحلة M. وأخيراً، يمكن لخلايا G0/G1 على إشارة pRB عالية تمييز G0 (هادئ) عن الخلايا في G1 (الشكل2C،اليسار معظم اللوحة).

بعد تحديد مراحل دورة الخلية المختلفة، فمن الممكن بعد ذلك لبناء تمثيل رسومي لملفات تعريف دورة الخلية لأنواع الخلايا المختلفة أو الظروف التجريبية. على سبيل المثال، تظهر ملفات تعريف دورة الخلايا المميزة عند مقارنة مجموعات الخلايا CD45- مقابل CD45+ (الشكل3A)في تعليق KC الموضح في الشكل 2. كما هو متوقع Hyperplastic KCs وجدت في CD45- مجموعة لديها خلايا أقل في G0 والمزيد من الخلايا في S، G2، وM المراحل3. وعلى النقيض من ذلك، كان للخلايا المناعية من نفس العينة أعداد ملحوظة في G0 وG1. وبالإضافة إلى ملامح دورة الخلايا، فإن توصيف التعبير الجيني بطريقة تعتمد على دورة الخلايا ممكن أيضاً. على سبيل المثال، تم تحليل بروتينات فوسفو التي تساعد على تعريف إشارات EGFR وmTOR/PI3K في البيانات المقدمة للحصول على الشكل 3A. كشف تحليل مراحل G1 من خلايا CD45- مقابل CD45+ عن ملف تعريف مماثل لبروتينات إشارة EGFR وmTOR/PI3K، على الرغم من أنه يبدو أن هناك اختلافات طفيفة في النسبة المئوية للخلايا الإيجابية pS6 و pEGFR (الشكل3B). ويمكن تكييف نُهج مماثلة لتوصيف التعبير عن بروتينات مسار الإشارات الأخرى أو العمليات الخلوية في مراحل مختلفة من دورة الخلية.

Figure 1
الشكل 1 إعداد جلد الأذن الماوس للهضم: (أ) أولا، إزالة الأذن من الحيوان ووضع شقة على طبق بيتري نظيفة. (B) أمسك جانب ًا واحدًا من الأذن إما في الوسط أو على الحافة باستخدام ملقط دقيق منحني. (C) الوجه أكثر واستخدام زوج آخر من ملقط وسحب بلطف أنصاف الأذن وبصرف النظر حتى تمزق الأذن على تجعد. (د) مواصلة سحب حتى الجانبين منفصلة إلى نصفين. (E) تعويم نصفالأذن على وسائل الإعلام التفكك مع الجانب الأدمة لمس الحل. شريط مقياس = 2 ملم.

Figure 2
الشكل 2 استراتيجية التجشؤ لبيانات قياس السيتومترية الشاملة. تم إنشاء البيانات في هذا الرقم من الحيوان التجريبي ة المعالجة مع إستر phorbol TPA كما سبق وصفها3. TPA هو المنشط PKC الذي يحفز التهاب الجلد24. (أ) تظهر اللوحات استراتيجية التغرير الأولية بعد التطبيع وdeconvolution من البيانات الباركود. من خلال التغرير على طول الحدث، 191Ir،193Ir، و 195Pt القنوات، فمن الممكن لتحديد الخلايا سليمة، واحدة، وقابلة للحياة. (B) الإنسان SCC SRB-P93 الخلايا تعامل مع DMSO ثم ملطخة لقياس الخلايا الشاملة. تم بوابات البيانات كما هو الحال في (أ) وتظهر المؤامرة مستويات الخلايا الحية في هذه العينة. (ج) إدراج علامات النسب يسمح لاختيار السكان الخلية ذات الأهمية. على سبيل المثال، تمبوابات الخلايا القابلة للحياة من (A) على طول الحدث مقابل CD45 لاستبعاد خلايا المكونة للدم. Gating CD45- خلايا لدمج IdU مقابل CYCLIN B1 يسمح بتحديد S، G0/G1، وG2 /M مجموعات الخلايا. تحديد الخلايا العالية pHH3 يحدد المرحلة M، في حين أن تحليل G0/G1 لإيجابية pRB يحدد الخلايا في G1. (D) تظهر المؤامرة النتائج التمثيلية لتحليل دورة الخلية عن طريق الكشف عن تأسيس BrdU وPI (محتوى الحمض النووي) مع قياس التدفق القائم على الفلورة. البيانات المعروضة هي من الإنسان Colo163 SCC الخلايا نمت مع BrdU لمدة 1 ساعة كما سبق وصفها3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 توصيف ملامح دورة الخلية والتعبير البروتيني الخاص بالمرحلة. (أ) تم تحديد ملفات تعريف دورة الخلية في العينة من الشكل 2 للخلايا CD45- مقابل CD45+. (ب) كشف تحليل مراحل G1 مع الأجسام المضادة الخاصة بالفوسفور في خلايا CD45-(orange) وCD45+(Blue) عن ملامح تعبير مشابهة لعلامات مسارات الإشارات EGFR وmTOR/PI3K. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الانسجه منطقه خلية العائد صلاحيه
أذن الماوس 225-230 مم3 1-2x106 70-90 في المائة
جلد حديثي الولادة 1000-1100 مم3 5-10x106 80-99 في المائة

الجدول 1: غلة الخلايا النموذجية وصلاحيتها من أذن الماوس البالغة وجلد حديثي الولادة. تم حساب الخلايا وصلاحيتها من قبل استبعاد الأزرق تريبان من الـ KCs الأذن التي تم حصادها من n=7 8-10 أسابيع من آذان الفئران البالغة القديمة أو n=7 P3 جلود حديثي الولادة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن إكمال البروتوكول الموضح في هذه الورقة في حوالي 8 ح. والنتيجة النهائية هي تعليق الخلايا المخصب في KCs التي يمكن تحليلها للتعبير عن البروتين بطريقة تعتمد على دورة الخلية. وقد حددت العديد من الدراسات السابقة طرق لعزل KCs من الجلد البشري والماوس16،25. وتشمل هذه الدراسات أيضا بروتوكولات لعزل KCs لتدفق قياس السيتومترية26. ومع ذلك، لم يتم وصف بروتوكول مفصل من قبل يجمع بين عزل ة KCs مع تحليل التعبير البروتيني وديناميات دورة الخلية باستخدام قياس الخلايا الكتلية.

أكبر عقبة أمام الحصول على نتائج عالية الجودة في هذا البروتوكول هو نوعية الخلايا الحية المستخدمة. في الأدب ، تختلف الظروف المقترحة والانزيمات لفصل البشرة / الأدمة اختلافا كبيرا16،25،26،27. ومع ذلك، فمن المستحسن للحفاظ على وقت هضم الجلد لأقصر مدة ممكنة التي تسمح فصل فعال من البشرة من الأدمة. يقدم هذا البروتوكول الهضم مع ديسباس والكولاجين من النوع الرابع الذي يسمح بفصل سهل لكل من الأذن وبشرة الأذن والأذن الوليدة في غضون ساعة واحدة. وهذا يؤدي إلى غلة خلايا كافية مع ارتفاع قدرة الخلية على البقاء. عامل آخر يمكن أن يؤثر على نوعية الخلايا هو موقع الجلد المحدد للهضم. ومن المفترض أن KCs يتصرف بالمثل من مواقع تشريحية مختلفة في الجسم. ومع ذلك، قد يكون الجلد في مواقع مختلفة خصائص مختلفة وتكوين الخلايا الجذعية28،29. ومع ذلك، يفضل استخدام جلدحديثي الولادة والأذن 3،30 لأن عزل KCs هو أكثر صعوبة من مناطق الجلد مع كثافة عالية من بصيلات الشعر (على سبيل المثال، الجلد الخلفي). قد تكون هناك حاجة إلى درجة أعلى من التلاعب أو تفكك الأنسجة لعزل كفاءة من KCs من مناطق شعر من الماوس26. كما أن الظروف التجريبية قبل عزل الـ KCs قد تؤثر أيضاً على نوعية الخلايا المعزولة. قد تقلل الآفات الجلدية أو الحالات التي تؤثر على حاجز الجلد أو سلامة الجلد من فصل البشرة عن الأدمة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض غلة الخلايا القابلة للحياة أو زيادة تلوث الخلايا غير KC (على سبيل المثال، الخلايا المناعية). وأخيراً، فإن الـ KCs المعزولة عرضة للتكتل. كما أنها يمكن أن تفقد صلاحية الخلية إذا تركت لفترة طويلة جدا على الجليد أو في RT قبل معالجة لقياس الخلايا الجماعية أو غيرها من تحليلات خلية واحدة.

منهجية تلطيخ القياس الكلي الشامل مماثلة لتلك المستخدمة في قياس تدفق الفلورة ولكن مع الاختلافات الرئيسية. على سبيل المثال، يتم الكشف عن النسخ المتماثل للحمض النووي عن طريق الكشف المباشر عن IdU بدلاً من استخدام الأجسام المضادة ضد النظير النيوكليوتيدات مثل BrdU. الكشف المباشر عن IdU يبسط إلى حد كبير تحديد خلايا المرحلة S، كما يمكن الكشف عن الأجسام المضادة من BrdU أن يكون إجراء المعنية. وثمة فرق آخر هو استخدام سيسبلاتين للتمييز بين الخلايا الميتة والخلايا الحية. سيسبلاتين بشكل تفضيلي تسميات الخلايا الميتة. هذه الخطوة مماثلة لاستخدام PI أو غيرها من البقع لتجارب FACS الميتة / الحية. خطوة تلطيخ سيسبلاتين مهم لأن الخلايا الميتة قد ربط الأجسام المضادة وبالتالي توليد إشارات إيجابية كاذبة. كما يستخدم قياس السيتومترية الكتلية الأجسام المضادة للكشف عن التعبير عن علامة خاصة بالمرحلة بدلاً من قياس محتوى الحمض النووي. وهذا يسمح بالتمييز السهل في مراحل دورة الخلايا الفردية. وأخيراً، تحتاج ملفات بيانات قياس السيتومترية الكتلية (FCS) إلى التطبيع باستخدام الارتفاع الحاد في حبات المعايرة بسبب تدهور إشارة العينة مع مرور الوقت في أداة CyTOF أثناء نفس التشغيل وبين الأشواط.

وقد تم استعراض تلطيخ، والحصول على البيانات، وتحليل القياس السيتومي الشامل بشكل جيد من قبل المنشورات الأخيرة14،15. تطبيق هذه التكنولوجيا على تحليل الخلايا المكونة للدم والمناعة موثقة بشكل جيد. ويتجلى ذلك في مجموعة كبيرة من الأجسام المضادة الموسومة بعلامات معدنية المتاحة تجارياً وهيمنة المنشورات ذات الصلة بالمناعة التي تستخدم هذه التكنولوجيا. التطبيق الفوري للخلايا الجماعية في الجلد سيكون لتحليل الخلايا المناعية. وهذا أمر مهم بشكل خاص لنماذج جلد الماوس في أمراض مثل السرطان حيث يكون للالتهاب دور مهم. لتحليل الخلايا غير المناعية، يمكن أن يكون عدم وجود الأجسام المضادة الموسومة بعلامات معدنية متاحة تجارياعائقا. ميزة الكواشف التجارية هي أنه يمكن استخدامها دون تحسين كبير كما هو الحال بالنسبة للأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية في المنزل. ومع ذلك، هناك الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية ضد العلامات الفلورية شائعة الاستخدام (على سبيل المثال، FITC، PE، وAPC) التي من شأنها أن تسمح للمجرّب بإضافة علامات إضافية إلى لوحة تلطيخ. ويمكن أيضا تطبيق هذا الحل البديل على تحليل خلايا الجلد في أنواع مختلفة حيث قد يكون هناك عدد محدود من الأجسام المضادة التجارية الموسومة بالمعادن التي تظهر التفاعل عبر الأنواع. ومع ذلك، يتطلب هذا الحل البديل أيضا خطوة تلطيخ إضافية بعد تلطيخ سيسبلاتين وبعض التحسين. ويناقش النظر الإضافي لبناء لوحة ناجحة في الأدب14. عيب آخر من قياس الخلايا الشامل هو أن كفاءة جمع البيانات من أجهزة قياس الخلايا الشامليمكن أن تكون 40-60٪ من رقم خلية الإدخال. وعلى هذا النحو، فإن تحليل مجموعات الخلايا النادرة (مثل الخلايا الجذعية) من العينات السائبة قد يتطلب عدداً أكبر من الخلايا، أو تجميع العينات للكشف الفعال، أو نُهج أخرى لإثراء مجموعة الخلايا ذات الأهمية قبل تلطيخ الخلايا للخلايا الجماعية 24.

قياس السيتومترية الشاملة هي تكنولوجيا ناشئة قوية سيستمر استخدامها في النمو. حاليا، يتم التركيز على تطبيق هذه التكنولوجيا على استخدام الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية، ولكن تم تمديدها مؤخرا للكشف عن mRNA31. وعلاوة على ذلك، هناك إمكانية لوضع علامات على المكونات الخلوية الأخرى أو الأيض بعلامات معدنية، مما يوسع نطاق تطبيق قياس الخلايا الكتلي في الجلد والأنسجة الأخرى من الفئران والبشر والأنواع الأخرى. وباختصار، قد يؤدي هذا البروتوكول بعد ذلك إلى توسيع الأدوات التجريبية المتاحة لعلماء الأحياء الجلدية لربط تعبير بروتين KC في مختلف مراحل دورة الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وجاء الدعم لهذا العمل من قسم الأمراض الجلدية، ومركز غيتس للطب التجديدي في جامعة كولورادو وجامعة كولورادو (UC) مركز الأمراض الجلدية مورفولوجيا والنوى الفينوتين (NIAMS P30 AR057212). يقر المؤلفون بـ "مركز السرطان في جامعة كاليفورنيا" "الموارد المشتركة للسيتوميتري" ومنحة الدعم (NCI P30 CA046934) لتشغيل مقياس الخلايا الكتلي، وهم ممتنون لكارين هيلم وكريستين تشايلدز في صميم نصائحهم الخبيرة بشأن التدفق ومقياس الخلايا الشامل تقنيات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plate Cell Treat 229512
Intercalator solution Fluidigm 201192A 125 µM - Ir intercalator solution
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4 16 %  PFA
Strainer cap flow tubes Fisher/Corning 352235 35 µm pore size 
Cell sieve Fisher 22363547 40 μm pore size 
Cell detatchment solution CELLnTEC CnT-ACCUTASE-100 Accutase
Iodine Solution ThermoFisher/Purdue 67618-151-17 Betadine 7.5%-iodine surgical scrub
Barcode permeabilization buffer  Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
Barcodes Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
pH strips EMD 9590 colorpHast
DMEM Hyclone SH30022.01 Dulbecco’s Modified Eagle Media
Fine forceps Dumont & Fils 0109-5-PO Dumostar #5
Curved precision forceps Dumont & Fils 0109-7-PO Dumostar #7
Calibration Beads Fluidigm 201078 EQ Four Element Calibration Beads
HBSS Gibco 14175-095 Hank's Balanced Salt Solution
Water Fisher SH30538.03 Hyclone Molecular Biology grade water
Iododeoxyuridine  Sigma I7125 IdU
Cryo vials ThermoFisher 366656PK internal thread
Cell Staining buffer Fluidigm 201068 Maxpar Cell Staining buffer
Fix & Perm buffer Fluidigm 201067 Maxpar Fix & Perm buffer
Fix I buffer Fluidigm 201065 Maxpar Fix I buffer
Phosphate buffered saline Rockland MB-008 Metal free 10x PBS
isopropanol-freezing container ThermoFisher 5100-0001 Mr.Frosty
Sodium hydroxide Fisher BP359-500 NaOH
Petri dish Kord-Valmark 2900 Supplied by Genesee 32-107 
15 mL conical Olympus/Genesee 28-101
50 mL conical Olympus/Genesee 28-106
6-well plate Cell Treat 229506
Cisplatin Sigma 479306
Dispase II Sigma/Roche 4942078001
DMSO Sigma D2650
FBS Atlanta Biologicals S11150
Hydrochloric acid Fisher A144-212
Nuclear Antigen Staining  permeabilization buffer Fluidigm 201063
Nuclear Antigen Staining buffer Fluidigm 201063
Trypan blue Sigma T8154
Tuberculin syringe BD 309626
Type IV Collagenase  Worthington Bioscience CLSS-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
  2. Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
  3. Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  4. Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
  5. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  8. Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
  9. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  10. Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
  12. http://www.dvssciences.com. , http://www.dvssciences.com (2019).
  13. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
  14. Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
  15. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
  16. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
  17. Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
  18. Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  19. Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
  20. Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
  21. http://www.cytobank.org. , http://www.cytobank.org (2019).
  22. http://www.flowjo.com. , http://www.flowjo.com (2019).
  23. Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
  24. Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
  25. Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
  26. Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
  27. Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  28. Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
  29. Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
  30. Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
  31. Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).

Tags

علم الأحياء التنموية العدد 147 دورة الخلية البشرة الجلد عزل الخلايا الكيراتينية نماذج الماوس قياس الخلايا الجماعية الانتشار ارتباط التعبير البروتيني تحليل خلية واحدة
عزل وتلطيخ الخلايا الكيراتينية الجلد الماوس لدورة الخلية تحليل محدد للتعبير البروتين الخلوي عن طريق قياس الخلايا الشامل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandez, J., Torchia, E. C.… More

Fernandez, J., Torchia, E. C. Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59353, doi:10.3791/59353 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter