Summary
Een zachte touch-Force laad machine is opgebouwd uit menselijke haar borstels, robotarmen en een controller. De haar borstels worden aangedreven door robotarmen die op de machine zijn geïnstalleerd en bewegen periodiek om touch-Force op planten toe te passen. De sterkte van machinaal aangedreven haar aanrakingen is vergelijkbaar met die van handmatig aangebrachte aanrakingen.
Abstract
Planten reageren op zowel intracellulaire en extracellulaire mechanische stimulaties (of kracht signalen) en ontwikkelen van speciale morfologische veranderingen, een genaamd thigmomorphogenesis. In de afgelopen decennia zijn verschillende signalerings componenten geïdentificeerd en gerapporteerd om betrokken te zijn bij de mechanotransductie (bijv. calciumionen bindende eiwitten en jasmonische zuur biosynthese enzymen). Echter, de relatief trage tempo van het onderzoek in de studie van de kracht signalering of thigmomorphogenesis wordt grotendeels toegeschreven aan twee redenen: de eis voor bewerkelijk menselijke hand gemanipuleerd aanraking inductie van thigmomorphogenesis en de kracht sterkte fouten verbonden met de hand-Touch van mensen. Om de efficiëntie van externe kracht belasting op een planten organisme te verbeteren, werd een automatische Touch-Force-laad machine gebouwd. Deze robotische arm-aangedreven haarborstel raakt een arbeidsbesparende en gemakkelijk herhaalbare simulatie van aanraak kracht, onbeperkte herhalingen van aanraak herhaling en instelbare aanraak sterkte. Deze haar Touch-Force laad machine kan worden gebruikt voor zowel grootschalige screening van touch-Force signalering mutanten en de fenomica studie van plant thigmomorphogenesis. Bovendien, touch materialen zoals mensen haar, kan worden vervangen door andere natuurlijke materialen zoals dierlijk haar, zijde draden en katoenvezels. De automatische bewegende armen op de machine kunnen worden uitgerust met Watersproeiers en lucht blowers om de natuurlijke krachten van respectievelijk regendruppels en wind na te bootsen. Door het gebruik van deze automatische haar Touch-Force laad machine in combinatie met de hand uitgevoerde wattenstaafje aanraken, hebben we onderzocht de aanraking reactie van twee kracht signalering mutanten, MAP kinase kinase 1 (MKK1) en MKK2 planten . De fenomes van de Touch-Force geladen wild type planten en twee mutanten werden statistisch geëvalueerd. Ze hebben significante verschillen in aanraak respons tentoongesteld.
Introduction
Plant thigmomorphogenesis is een term die werd bedacht door Jaffe, MJ in 19731. Het is een plant tropisme, maar verschillend van het bekende phototropisme of gravitropism veroorzaakt door prikkels van zonlicht of zwaartekracht2,3. Het beschrijft fenotypische veranderingen in verband met periodieke mechanische stimulaties, die vaak zijn waargenomen door botanisten in vroegere tijden4,5. Regendruppels, wind, planten, dieren en menselijke aanrakingen, zelfs dieren beten, worden allemaal beschouwd als verschillende soorten mechano-stimuli die de kracht signalering in planten4,5triggeren. Kenmerken van de plant thigmomorphogenesis omvatten de vertraging van het bout, een kortere Steel, kleinere rozet/blad grootte in kruidachtige planten, en dikkere stam in houtige planten6,7,8. Dit is in tegenstelling tot de thigmonastieke of thigmotrope respons die vaak voorkomt in de Mimosa plant of andere mechano-gevoelige wijnstokken, waar deze snelle aanraak responsen gemakkelijker te volgen zijn op1,9,10. Thigmomorfogenese, aan de andere kant, is relatief moeilijk te worden waargenomen vanwege de trage groei reactie. Thigmomorfogenese wordt meestal waargenomen na weken of zelfs jaren van continue kracht-loading stimulatie. Deze unieke aard van plant Touch Response maakt het moeilijk om een voorwaartse genetische scherm uit te voeren met behulp van menselijke hand aanraking stimulatie om de Touch-Force signalering resistente mutanten op een robuuste manier te isoleren.
Om de kracht signaaltransductie trajecten en de onderliggende moleculaire mechanismen van de thigmomorphogenesis6,11, moleculaire en cellulaire biologische experimenten te verheldoen, zijn uitgevoerd in de afgelopen6, 12,13,14. Deze studies hebben voorgesteld dat de plant kracht signaal receptoren voornamelijk bestaan uit mechanosensitieve ionenkanalen (msc) en de tethered MSC complexen samengesteld door multimere complexen van membraan-spanning eiwitten11,14 , 15. de cytoplasmatische CA2 + voorbijgaande Spike gegenereerd binnen enkele seconden van de eerste aanraking. Wind-, regen-of gravi-stimulatie kan communiceren met de benedenstroomse calcium sensoren om de kracht signalen te leveren aan nucleaire gebeurtenissen14,16,17,18. Naast moleculaire en cellulaire studies heeft het voorwaartse genetische scherm met handmatige vingeraanraking van planten geconstateerd dat fytohormonen en de secundaire metabolieten betrokken zijn bij de daaruit voortvloeiende Touch-inducible (TCH) genexpressie na de Touch-Force loading13,19. Voorbeelden zijn AOS en opr320 mutanten geïdentificeerd tot dusver van de genetische studies. Het grote probleem in verband met de toepassing van de voorwaartse genetica in de studie van thigmomorphogenesis is echter nog steeds de intensieve arbeid die nodig is voor het kwantificeren van het niveau van aanraak respons en het aanraken van een grote populatie van genetisch gemuleerde individuele planten. Het tijdrovende probleem blijft ook bestaan in het met de hand raken van het Mutant scherm14,20. Voor een voorbeeld, om een ronde van touch-Force stimulatie te voltooien, moet een persoon 30-60 keer aanraken (één aanraking per seconde) op een afzonderlijke plant. Om een voldoende aantal planten voor statistische fenotype analyse te hebben, zijn 20-50 afzonderlijke planten van hetzelfde genotype normaalgesproken nodig voor het aanlaad proces van de aanraak kracht. Deze touch-Force laden regime betekent dat een persoon moet herhaaldelijk uitvoeren 600-3000 aanrakingen op één genotype van keuze. Dit type aanraking moet normaalgesproken 3 tot 5 ronden per dag worden herhaald, wat overeenkomt met ongeveer 1800-15000 vinger-of wattenstaafje aanrakingen per dag bij genotype van planten. Een goed opgeleide persoon is normaalgesproken vereist om de kracht en kracht van meerdere aanrakingen binnen een wenselijk bereik in vele herhalings rondes in een dag te handhaven om de grote variatie in kracht en kracht te vermijden. Omdat het bekend is dat thigmomorphogenesis een verzadigbaar en dosis afhankelijk proces is van6,21, raakt de kracht/sterkte van de aanraking cruciaal voor een succes bij het activeren van de aanraak respons van een plant.
Om de persoon afhankelijke belasting te verwijderen en de mechanische toepassing binnen een acceptabel fout bereik14te houden, hebben we daarom een automatische Touch-Force-laad machine ontworpen om de hand gemanipuleerde aanrakingen te vervangen. De machine heeft 4 bewegende armen gebouwd, die elk zijn uitgerust met één human hair Brush. Deze versie heeft de naam model K1 om de functie van human hair Touch-Force loading te specificeren. Als 4 genotypen kwantitatief worden gemeten voor hun thigmomorfogenese of aanraak respons onder één machine, kunnen 40-48 individuen per genotype worden gemeten. Elke ronde Touch herhaling (minder dan 60 keer aanraking per plant) duurt minder dan 5 minuten met behulp van een verstelbare robotarm met bewegende snelheid. Zo kunnen planten op een model K1-aanraak machine mechanisch worden gestimuleerd voor meerdere rondes per dag, hetzij met een constante belasting van de aanraking-kracht of verschillende niveaus van sterktes als aanvankelijk geprogrammeerd.
Arabidopsis thaliana, een model plant organisme, werd daarom gekozen als doel plantensoort voor het testen van de volautomatische haar Touch-Force laad machine applicatie. Omdat er verschillende grote kiem banken beschikbaar zijn voor het ophalen van de verschillende germplasmen van mutanten en de grootte van de bloei, past Arabidopsis goed in de ruimte die beschikbaar is in de groei plank gemonteerd met de model K1 Touch machine.
De model K1 Automatic Touch machine bestaat uit drie belangrijke componenten: (1) de H-shape metalen rek samengesteld door twee riem-aangedreven lineaire actuatoren, (2) robotische metalen armen uitgerust met haar borstels, en (3) een controller. Voor een aangepaste model K1-aanraak machine bestaat elke X/Y-asmodule uit één belt-gestuurde geleiderail, twee Slide blocks (rood) en 1 57 Stepper Motor (vooraf geïnstalleerd en ontkoppelbaar) (Figuur 1a,B). De bovenste horizontale Actuator laat de robotische metalen arm naar links en rechts horizontaal bewegen, de onderste verticale riem-gestuurde Lineaire Actuator laat de robotische metalen arm verticaal omhoog en omlaag bewegen (Figuur 1B, Figuur 2A ). Op de verticale Actuator zijn vier ontkoppelbaar gerobotiseerde armen geïnstalleerd (Figuur 1C, Figuur 2B). Vier menselijke haar borstels waren gebonden aan vier robotische armen, respectievelijk (Figuur 1C, Figuur 2B). Alle mechanische onderdelen voor het construeren van de model K1 Touch machine in vetdicht lettertype hieronder zijn gemarkeerd in Figuur 1C (Zie ook de tabel van de materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van zaaizaad
Opmerking: Arabidopsis zaden van zowel wild type (Col-0) als mkk1 en mkk2 verlies-van-functie mutanten werden aangekocht bij het ARABIDOPSIS Biological Resource Center (ABRC, https://www.Arabidopsis.org, Columbus, Oh).
- Bereken hoeveel plantaardige individuen van elk genotype zullen worden gebruikt voor een betrouwbare statistische analyse. Bereid een voldoende aantal zaden op basis van de kiemkracht van elke lijn, meestal 4-5 keer meer dan wat nodig is voor een experiment. Zorg ervoor dat er voldoende aantal gezonde en uniforme planten kan worden gebruikt voor touch Response assay. Volgens dit protocol worden 300-500 zaden per genotype meestal gebruikt om 80-90 planten van vergelijkbare grootte te produceren.
- Dompel zaden in koud water en bewaar ze in 4 °C (bedekt met aluminiumfolie om in het donker te houden) voor zaad imbibition. Zaai de zaden 5-7 dagen na de imbibition.
2. plantengroei
- Selecteer de juiste grond voor plantengroei (Zie de tabel met materialen). Vermijd grote klonters en meng ze homogener.
- Bereid 24 plastic bekers: de vasthoud capaciteit is 207 mL en de bovenste velgdiameter is 7,4 cm. boor drie ronde gaten aan de onderkant van een beker voor irrigatie doel.
- Vul deze plastic bekers met de gemengde grond. Laat de bodem opstapelen tot 1-2 cm hoger dan de bekerrand en maak het oppervlak van gestapelde grond zachtjes plat.
- Breng 24 kopjes in een plastic bakje (21 inch x 10,8 inch x 2,5 inch) en plaats de lade onder constante lichtomstandigheden (zie hieronder).
- Voeg 2,5 L water toe aan elke lade twee uur voor het zaaien van de zaden. Laat de bodem het water absorberen uit gaten die zich op de bodems van kopjes bevinden en wacht tot het oppervlak van de grond naar het kopje RIM niveau daalt.
- Zaai 3-4 zaden in een enkele vlek en 4 gelijkmatig verdeelde vlekken in een beker.
- Plaats een doorzichtige plastic afdekking boven elke lade en laat de zaden een week ontkiemen. Verwijder vervolgens de afdekking en laat zaailingen nog een week groeien.
- Verwijder extra planten door te verdunnen en houd 4 planten individuen van vergelijkbare grootte in elke beker 9-10 dagen na zaad zaaien.
- Irrigeren planten met 1,5 L water om de andere dag na de zaden ontkiemen.
3. groei conditie
- Stel de temperatuur van de groei kamer in op 23,5 ± 1,5 °C en vochtigheid tussen 35 en 45%.
- Stel de lichtintensiteit in tussen 180 en 240 μE ∙ m-2∙ s-1 (gemeten door Il 1700 Research Radiometer, International Light)14. De fotosynthetische actieve straling is van 90 tot 120 μE ∙ m-2∙ s-1.
- Stel de licht toestand in op 24 uur constante.
4. de bouw van de Touch-Force laad machine
Opmerking: deze robotische haar Touch-Force laad machine (model K1) is ontworpen om te dienen voor zowel Touch-Force signalering Mutant screening en plant thigmomorphogenesis generatie (Figuur 1, Figuur 2).
- Pre-installatie modules (ontkoppelbaar, Figuur 1C)
- Installeer twee Slide blocks (I) en één 57 Stepper Motor (II) op de X/Y Axis Guide-Rail module (III/V).
- Installeer twee diablokken (I) op de X/Y-as hulp ligger (IV/VI).
- Installatie van andere mechanische onderdelen (Figuur 1C)
- Bevestig de X AXIS Guide-Rail module (III) en de x-as hulp ligger (IV) samen door twee verdeel plaatjes (VII) aan elk uiteinde van de geleiderail te monteren.
- Bevestig de Y-as Guide-Rail module (V) op de rug van twee Diablokken (X-as) in een kruisende positie door twee verdeel plaatjes (VIII) daartussenin te monteren.
- Bevestig de Y-as hulp ligger (VI) op de rug van de andere twee Diablokken (X-as) in een kruisende positie door twee verbindingsplaten (VIII) daartussen te monteren.
- Monteer de houder van de robotarmen (IX) op de voorkant van twee Diablokken (Y-as) in een kruisende positie met een verbindingsplaat (Figuur 2a).
- Monteer 4 haar borstels (X) op de robotarmen (IX) met klemmen (Figuur 2B).
5. instelling van de Touch-Force loading machine
Opmerking: alle controlerende parameters voor het instellen van de model K1-aanraak machine in vetdicht lettertype worden weergegeven in het bedieningspaneel (Figuur 2F).
- Installeer Touch Hair borstels op de robotarmen. Gebruik een 330 mm lange stalen liniaal als houder om één laag menselijk haar (3600-4600 haren/borstel) gelijkmatig te fixeren. De lengte van het haar is 126 mm (Figuur 1C).
- Bevestig die stalen linialen op de robotarmen met twee metalen klemmen.
- Stel eerst de hoogte van machine armen in langs de verticale afmeting (Y-as). Druk op JOG F + om R te verhogen en te joggen om de robotarmen en borstels te verlagen. Laat de punt van haar borstels 0,5 cm lager zijn dan de bekerrand. Druk op de nulset. Pre-run de machine 1-2 cycli om ervoor te zorgen dat alle planten individuen worden aangeraakt. Pas de borstels en haar uiteinden elke dag tijdens de gehele ontroerende periode aan op dezelfde hoogte.
- Gebruik een elektronische weegschaal om de aanraak kracht te meten (verticaal laden) en houd het aanraak kracht niveau bij 1-2 mN14.
- Stel de startpositie van machine armen handmatig in langs de horizontale afmeting (X-as). Laat de haar borstels aan de rand van elke lade hangen en zorg ervoor dat er geen installatie wordt aangeraakt voordat het ontroerende experiment begint. Druk op JOG F +/JOG R- om de machine arm bij beetje horizontaal te bewegen om de startpositie in te stellen.
- Stel de haar penseel reisafstand in de horizontale afmeting (X-as) in op 365 mm door op de knop reizen te drukken. Press Inc. F +/Inc. R- om de machine armen te verplaatsen om een volledige reisafstand te verkrijgen en ervoor te zorgen dat alle behandelde planten tijdens het gehele ontroerende experiment worden aangeraakt.
- Stel de bewegingssnelheid langs de X-as van de machine armen in op 5.000 mm/min door op de knop automatische snelheid te drukken. Houd dezelfde bewegingssnelheid tijdens het hele ontroerende experiment.
- Stel de aanraak tijd in op 20 proeven door op de knop secundaire cyclus te drukken. Houd hetzelfde aantal aanrakingen per ronde tijdens het hele ontroerende experiment.
Opmerking: een kleine cyclus is gelijk aan twee reis afstanden, wat betekent dat machine armen van de startpositie naar de eindpositie zullen gaan en dan weer terug naar de startpositie. Een kleine cyclus genereert twee aanrakingen. Haar borstels Touch planten 40 keer binnen 20 proeven (2 aanrakingen x 20 proeven = 40 aanrakingen). De 40-touch wordt gedefinieerd als een ronde van touch-Force loading. - Stel het herhalingsinterval van de Touch-round in op 480 min per dag door op de knop belangrijke periode te drukken. Houd dezelfde frequentie van aanraak rondes tijdens een volledig ontroerend experiment.
Let op: Hierdoor kunnen haar borstels planten voor 3 rondes per dag aanraken, en de intervaltijd tussen elke ronde is 480 min (8 uur). Het weergegeven blauwe getal staat voor de intervaltijd van elke aanslag ronde. De machine start automatisch een nieuwe aanraking wanneer het aftellen onder (rode getal) tot 0000 wordt. - Zet de grote cyclus op 12 proeven, wat betekent dat de machine planten voor 12 rondes binnen een periode van 4 dagen automatisch zal aanraken. Deze instelling van 12 proeven wordt gebruikt om te voorkomen dat menselijke fouten bij het overslaan van een dag van aanraken.
- Druk op de Start knop om het vooraf ingestelde programma te starten. De model K1-aanraak machine voert automatisch het aanraak kracht-laden uit volgens de instellingen.
6. fysiologische gegevensverzameling en-analyse
-
Dagen om te vetteren: Noteer de bolting dag van elke plant afzonderlijk binnen een ontroerend experiment. Bolting is een symbool dat een plant zijn groeistadium verandert van de vegetatieve fase naar de voortplantings fase. In Arabidopsis wordt de bolting dag gedefinieerd als het aantal dagen dat door een plant wordt gebruikt om de eerste bloeiwijze te laten oplopen tot 1 cm lang.
Opmerking: onder de hierboven beschreven groei voorwaarde initieert de bolting van wilde type planten normaalgesproken van 19 tot 23 dagen na het zaaien van zaad en eindigt op 28-32 dagen. -
Rozet RADIUS: meet de afstand van het Rosette Center tot de punt van het langste blad.
- Maak foto's van de hele lade vanaf de bovenkant. Neem foto's van de controlegroep en de Touch-behandelde groep afzonderlijk.
- Download de juiste software. Gebruik bijvoorbeeld de gratis gedownloade software imagej (https://imagej.NIH.gov/IJ/download.html).
- Open een fotobestand, gebruik de zoomfunctie om de foto in een passend formaat in te zoomen.
- Kies het rechte gereedschap om een rechte lijn te tekenen tussen het rozet centrum en de punt van een langste blad om de rozet RADIUS te meten.
- Selecteer één plant en druk op de linkerknop om een rechte lijn van het rozet centrum naar de langste blad uiteinde te trekken.
- Kies de functie analyse-meting of druk op CTRL + M om de regelafstand te analyseren.
- Selecteer één kopje en herhaal de voorgaande twee stappen om de diameter van elke plastic beker tegelijkertijd te analyseren. Gebruik deze gegevens om de berekening uit te voeren om de bias als gevolg van het maken van Foto's te elimineren.
Opmerking: de vergelijking is:
Ra/da = rm/dm
Ra, de werkelijke rozet straal van een installatie; Da, de werkelijke diameter van de plastic beker; Rm, de gemeten rozet straal van dezelfde installatie, bepaald door een software; Dm, de gemeten diameter van de plastic beker die wordt gebruikt voor het kweken van dezelfde plant)
-
Rozet gebied: meet de horizontale 2-dimensionale oppervlakte van rozet bladeren.
- Verwijder de bloeiwijze zonder de rest van rozet organen te beïnvloeden.
- Neem foto's van de bovenkant van elke plant samen met een schaal liniaal in de buurt geplaatst.
- Gebruik een gratis plugin van imagej, Rosette tracker en volg het protocol dat eerder werd gepubliceerd22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De automatische Hair Touch-Force laad machine
Voor observatie van morfologische veranderingen op planten zijn zowel de reproduceerbare groeiomstandigheden als de behandelingsmethoden van cruciaal belang voor het verkrijgen van herhaalbaar resultaat. Deze mutant screening met hoge doorvoer en automatische Touch Force-signalering wordt bereikt door de nieuw gebouwde haar Touch-Force laad machine, model K1 (Figuur 1, Figuur 2). Deze haar borstels kunnen maximaal 4 trays planten tegelijk aanraken. Er waren 24 kopjes in een bakje geplaatst en 12 kopjes planten in een groep die zowel als controle als als de behandelde planten werden gebruikt (Figuur 2C, D). In elke beker werden vier planten geteeld en in totaal 48 of minder planten individuen werden geraakt door dezelfde haarborstel, die voldoende planten garandeert voor latere statistische analyse. Maximaal 4 genotypen van planten kunnen gelijktijdig met aanraking worden behandeld op één model K1-aanraak machine. Een van de belangrijkste punten is de instelling van de Touch machine arm/haar hoogte omdat thigmomorphogenesis dosis-afhankelijke6,21is. Verschillende haar posities met betrekking tot de plant rozet bladpositie genereren verschillende touch krachten, die totaal verschillende thigmomorphogenesis resultaten kan genereren. In onze experimenten, moet de plant-contactpunt van haren worden geplaatst 0,5 cm lager dan de bekerrand (Figuur 2E), die krachten die vergelijkbaar zijn met de eerder gepubliceerde Touch Force14genereert. Een programmeerbare controller die in een aanraakpaneel wordt geïnstalleerd, wordt gebruikt om de hele Touch-Force-laad machine te bedienen (Figuur 2F, Zie tabel met materialen).
De vergelijking van twee verschillende aanraak methoden
Om deze automatische machine-gestuurde haar methode te vergelijken met de conventionele handmatige wattenstaafje, werden twee onafhankelijke experimenten uitgevoerd op Col-0 (Figuur 3). In de Cotton staafje Touch Group begon het aanraken van 12-daagse-oude planten. Elke ronde had 40 aanrakingen (1 aanraking/s). In totaal werden er elke dag 3 rondes uitgevoerd (Figuur 3A). Het toonde 1,7 dagen vertraging in het bolten na een continue wattenstaafje Touch behandeling (22,1 ± 0,2 dagen vs. 23,8 ± 0,2 dagen). Evenzo, voor de automatische machine-gestuurde haar aanraking, de Touch-Force laden gestart vanaf 14-dag-oude planten en 40 tijden van Aanraking (binnen 3 min) werden toegepast voor een ronde. In totaal werden 3 rondes van aanrakingen uitgevoerd per dag met exact 8 uur interval (Figuur 3B). Vertraagde bolting werd waargenomen bij Col-0 planten. De gemiddelde bout tijd bedroeg 23,0 ± 0,3 dagen, terwijl de bout tijd van de model K1 Touch machine behandelde planten 24,7 ± 0,2 dagen bedroeg. De verschillen tussen besturings-en aanraak installaties werden dan ook geanalyseerd met het univariate Cox proportioneel-Hazard model. Het bood de geschatte Hazard ratio (HR) van 0,31 (wattenstaafje aanraking) en 0,52 (machinaal aangedreven haar aanraking), respectievelijk (Figuur 3C), wat betekent dat het bolting risico/de waarschijnlijkheid van planten in de aangeraakt groep 31% en 52% is vergeleken met planten in de controlegroep, respectievelijk. Dit geeft aan dat de mogelijkheid om de aangeraakt wilde planten te versterken ongeveer de helft is vergeleken met die van de ongerepte controleplanten, ongeacht of het handmatig aanraken met een wattenstaafje of de geautomatiseerde haar aanraking is.
De beoogde resultaten op verschillende touch mutanten
Recente voorlopige gegevens suggereerden dat MKK1 en MKK2 een belangrijke rol zouden kunnen spelen in de aanraak reactie van Arabidopsis14. We selecteerden deze twee mutanten en voerden Touch experimenten uit op deze vermoedelijke Touch Response mutanten met behulp van de automatische Hair Touch-Force laad machine (Figuur 4, tabel 1). De wild type controleplanten toonden 1,8 dagen aan bout vertraging (24,1 ± 0,3 dagen vs. 25,9 ± 0,2 dagen, Figuur 4A) net zoals in het vorige verslag14 , terwijl deze bout vertraging niet werd waargenomen op T-DNA insertie mutanten, mkk1 (24,6 ± 0,2 dagen vs. 24,4 ± 0,3 dagen, Figuur 4B en tabel 1) en mkk2 (23,9 ± 0,1 dagen vs. 24,2 ± 0,2 dagen, Figuur 4C en tabel 1). Door deze gegevens te analyseren met het univariate Cox proportioneel-Hazard model vertoonde alleen het wilde type Col-0 een significant verschil tussen controle en aangeraakt planten met een geschatte HR van 0,41 (Figuur 4D). Deze touch-Force laden experimenten uitgevoerd door de automatische Hair Touch-Force laad machine aangetoond dat mkk1 en mkk2 mutanten zijn touch Response mutanten.
De meting van andere morfologische indexen
Morfologische veranderingen in verband met thigmomorfogenese zijn niet beperkt tot het vertragen van de bout vorming. Zowel kortere Steel als kleinere rozet blad grootte zijn ook de componenten van thigmomorphogenesis6,7,9,14. Vandaar dat we hier twee extra soorten metingen hebben gerapporteerd over morfologische indexen van aanraak respons, rozet RADIUS/blad lengte en rozet (geprojecteerd) gebied (Figuur 5). Net als bij de eerder waargenomen fenotype verandering vertoonde de wild type Col-0 significant kleinere rozet RADIUS en kortere blad lengte na 3 dagen constant en repetitief automatisch machinaal aangedreven haar aanraking (1,77 ± 0,05 cm versus 1,50 ± 0,04 cm, Figuur 5A). Het geprojecteerde rozet gebied werd veranderd van 20,32 ± 0,53 cm2 naar 16,19 ± 0,48 cm2 na 13 dagen aanraking (Figuur 5B). Zowel mkk1 als mkk2 hadden de soortgelijke gereduceerde rozet RADIUS en gebied. Samen hebben deze gegevens aangetoond dat MKK1-en MKK2-eiwitten belangrijk zijn voor de aanvetting van Arabidopsis en niet vereist zijn voor het vorm geven van de rozet grootte en het rozet gebied.
Statistische analyse
Met betrekking tot de in figuur 2 en Figuur 3 weergegeven doos-en whisker plots en de kolomdiagrammen in Figuur 5werd de statistische significantie geanalyseerd door de t-toets van de tweezijdige Student, met een betekenis die wordt weergegeven door * * * en n.s. bij p respectievelijk < 0,001 en p > 0,05. Voor de Kaplan-Meier plots zoals weergegeven in Figuur 2 en Figuur 3werd een univariate Cox Hazard analyse gebruikt om het effect van aanraak behandeling op het bolting event23,24te analyseren. De Hazard ratio (HR), 95% betrouwbaarheids interval (95% BI) en p waarde worden in de onderstaande tabellen aangeboden. Bijvoorbeeld, HR = 0,5 betekent dat op een bepaalde dag het vaststel risico/de waarschijnlijkheid van planten in de aangeraakt groep 0,5 of 50% was in vergelijking met die planten in de controlegroep.
Figuur 1 . De bouw en parameters van de automatische haar Touch-Force laad machine. A) standaardschema's van de lineaire actuator. Het linker paneel is de laterale weergave en het onderste linker paneel is de rugzicht. De totale lengtes van de X-asmodule en de Y-asmodule zijn respectievelijk 843 mm en 1.038 mm. Elke standaard X/Y-module bestaat uit één geleiderail, één schuifblok en 1 57 Stepper Motor (vooraf geïnstalleerd en ontkoppelbaar). Voor een aangepaste model K1-aanraak machine bestaat elke X/Y-module uit twee diablokken (rood). De koppelingsplaat van de X-module is vergroot van 56 mm tot 100 mm om een betere aansluiting en ondersteuning te bieden. Het bovenste rechter paneel is de dwarsdoorsnede van de geleiderail en het onderste rechter paneel is de 57 Stepper Motor. B) Schematische voorstelling van de geconstrueerde dubbele X-as en dubbele Y-as lineaire actuatoren. Dit is het grootste deel van de Touch-Force laad machine. Het onderste linker paneel is de rugzicht van geconstrueerde lineaire actuatoren. Het linker paneel is de laterale weergave van de X-asmodule (843 mm). Het middelste paneel is de laterale weergave van de Y-as-module (1.038 mm). Het bovenste rechter paneel is de rugzicht van 4 glij blokken op de Y-module en Y Auxiliary ligger. Het onderste rechter paneel is de rugzicht van de verbindingsplaat op de X-module. C) het stroomschema van de machine-onderdeel assemblage. Verschillende onderdelen zijn gemarkeerd en benoemd in de afbeelding. Gedetailleerde montage processen werden beschreven in het protocol. De getoonde eenheid is dit cijfer is mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 . Het algehele ontwerp van de automatische haar Touch-Force laad machine. (A) het afgewerkte model K1 Touch machine. De foto is van de voorkant genomen. De bovenste Lineaire Actuator bestuurt de robotarm die horizontaal beweegt en de onderste Lineaire Actuator bestuurt de robotarm die verticaal beweegt. B) de laterale weergave van ontkoppelbaar gerobotiseerde armen. Haar borstels werden vastgeklemd op de robotarmen. (C en D) Foto's die laten zien hoe de menselijke haren borstels de planten raken, die zijn genomen van de voorzijde en de laterale zijde, respectievelijk. E) het zijaanzicht waaruit blijkt hoe de hoogte van de haarborstel op de bekerrand moet worden gezet. Zowel de machine armen als de haar borstels zijn zichtbaar. F) de bedieningsinterface van de model K1-aanraak machine. Een programmeerbare controller (AFPX-C30T) gekoppeld aan een aanraakpaneel (MT6070i) wordt gebruikt om de hele machine te bedienen. Gedetailleerde instellingen en operationele procedures worden beschreven in het protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 . Het vergelijken van de effecten van twee aanraak methoden op thigmomorphogenesis. (A-B) de vergelijking van handmatige wattenstaafje Touch (a) en human hair Touch aangedreven door de automatische Touch-Force laad machine (B), respectievelijk. Box en whisker plots worden getoond in het linker paneel, die de vergelijking van de gemiddelde bolting dag tussen de controlegroep en de aangeraakt groep tonen. Betekent dat ± SE wordt weergegeven. De statistische analyse werd uitgevoerd door de t-toets van een student. Significantie bij p < 0,001 wordt weergegeven als * * *. Kaplan-Meier plots worden in het midden weergegeven, wat het percentage van de bolting planten is gedurende de groeitijd (dagen na inzaaien). Het rechter paneel toont representatieve individuen van ongerepte controle en aangeraakt planten die het verschil tonen in de bout tijd en bloeiwijze stam hoogte. C) de samengevatte tabel: de numerieke getallen in besturings-en aangeraakt kolommen zijn het planten nummer dat wordt gebruikt voor statistische analyse. De Hazard ratio (HR), 95% betrouwbaarheids interval (95% BI) en p -waarde in het deel van univariate Cox Hazard Analysis worden aangeboden. Het bolting risico en de waarschijnlijkheid van planten in de aangeraakt groep waren 31% en 52% in vergelijking met de ongerepte groep, respectievelijk. De risicoanalyse van univariate Cox werd geschat door SPSS. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 . De thigmomorfogenese van mkk1 en mkk2 mutanten, evenals de wild type plant (Col-0) geïnduceerd door de automatische haar aanraking. (A-C) de aspirant-aanraak reactie van Col-0 (a), mkk1 (B) en mkk2 (C) gegenereerd door herhaling van menselijke haar aanrakingen aangedreven door de automatische Touch-Force laad machine. Box en whisker plots worden in het linker paneel weergegeven, wat de vergelijking is tussen de gemiddelde bolting dag tussen de controlegroep en de aangeraakt groep. Betekent dat ± SE wordt weergegeven. De statistische analyse werd uitgevoerd door de t-toets van een student. De * * * en n.s. vertegenwoordigen respectievelijk p < 0,001 en p > 0,05. Kaplan-Meier-plots worden in het midden weergegeven, wat het percentage van de bolting planten is gedurende de groeiperiode (dagen na het zaaien). Het rechter paneel toont representatieve individuen van de ongerepte controle en de aangeraakt planten die het bolting verschil laten zien. Gegevens van mkk1 (B) en mkk2 (C) zijn samengesteld uit respectievelijk twee en drie biologische replicaten. Gedetailleerde planten aantallen die bij elke replicaat worden gebruikt, zijn weergegeven in tabel 1. D) de samengevatte tabel: de getallen onder controle en raak kolommen waren respectievelijk het planten nummer dat in deze twee groepen werd gebruikt/geanalyseerd. De HR, 95% bi en p waarde onder het deel van univariate Cox Hazard Analysis werden aangeboden. Het bolting risico/de waarschijnlijkheid van wild type planten in de aangeraakt groep is 41% in vergelijking met de controlegroep. De risicoanalyse van univariate Cox werd geschat door SPSS. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 . De rozet RADIUS en de oppervlakte-meting voor het definiëren van thigmomorphogenesis. A-B) de rozet RADIUS en het rozet gebied van het wild type werden gemeten op dag 17 en dag 27 na het zaaien van zaden. Staven die in het linkerdeelvenster worden weergegeven, zijn de vergelijkingen van de rozet RADIUS of het rozet gebied tussen respectievelijk de besturings groep en de aangeraakt groep. Betekent dat ± SE wordt weergegeven. De statistische analyse werd uitgevoerd door de t-toets van de student; p < 0,001. De Foto's in het rechterbovenhoek paneel zijn representatieve individuele planten. In de onderstaande samengevatte tabellen wordt het planten nummer weergegeven dat is geanalyseerd in de controlegroep en de aangeraakt groep. De rozet RADIUS (cm) op dag 17 en rozet gebied (cm2) op dag 27 worden ook weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1. De bolting gegevens van verschillende biologische replicaten. De samengevatte tabel bevat twee biologische replicaten van mkk1 en drie biologische replicaten van mkk2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Thigmomorphogenesis is een complexe plantgroei reactie op mechanische perturbations, waarbij een netwerk van cellulaire signalering en de werking van fytohormonen. Het is een gevolg van adaptieve evolutie van planten om te overleven onder de ongewenste omgevingsomstandigheden25,26. Mechanische aanraking, met name menselijke vingeraanraking en hand-held wattenstaafje aanraking, zijn geselecteerd om te bestuderen van deze morfologische veranderingen in eerder thigmomorphogenetische studies14,20. Deze vereenvoudigde versie van touch-Force loading om de reactie van plant Touch te activeren is gemakkelijker te controleren en toe te passen. Bovendien kan dit type Touch-Force laad methode op de een of andere manier de wind-en regen drop-gestimuleerde kracht signalen nabootsen die in de natuurlijke omgeving19worden geproduceerd. De Touch Force is in staat om calcium pieken, induceren eiwit fosforylering14 en de downstream gen expressie bemiddelen Touch Response19. Evenzo kunnen menselijke haar borstels op geautomatiseerde bewegende armen ook de plant Touch Response genereren door de menselijke hand gemanipuleerd aanrakingen te nabootsen. Om de soorten kracht toepassing te diversifiëren, kunnen Watersproeiers en/of wind blowers ook op de robotarmen van de machine worden geïnstalleerd en worden gebruikt voor een fysiologisch experiment (Figuur 2). De unieke eigenschap maakt de automatische mechanische kracht laad machine veelzijdiger in de morfogenetische en fysiologische studies. Het grootste voordeel van deze automatische mechanische kracht laad machine is waarschijnlijk de arbeids vrije, herhaalbare en tijdbesparende functie, die het mogelijk maakt om een specifieke Mutant fenotype selectie uit een groot aantal gemutageniseerde personen uit te voeren. In tegenstelling tot uren van menselijke hand gemanipuleerd aanrakingen, kan de model K1-aanraak machine verschillende mutanten tegelijkertijd aanraken en een rondje aanraken binnen 3 tot 5 minuten voltooien. Het tijdsbestek voor een ronde aanraking hangt grotendeels af van de programma-instelling aan het begin van de behandeling. Als elke afzonderlijke plant 40 keer in een ronde zou worden aangeraakt, zou de model K1-machine slechts 9-15 minuten nodig hebben om drie ronden aanraak behandeling binnen een dag te voltooien. De intervaltijd tussen elke ronde van aanrakingen kan nauwkeurig worden geregeld; het is minder waarschijnlijk voor de mens om een dergelijke precisie te bereiken.
Een andere belangrijke kwestie met betrekking tot de aanraking behandeling is welke fase van de plantengroei de Touch Force moet worden toegepast op. In onze praktijk is het aanraken 14 dagen na het zaaien van zaad voor zowel het wild type als twee mutanten begonnen, omdat de groeipercentages van deze drie genotypen vergelijkbaar zijn. Voor die mutanten die een significant verschil in ontwikkelingstijd van het wild type hebben, kan men een andere eerste dag kiezen om het aanraken te starten. Het uitvoeren van de One-way ANOVA-test op de bout gegevens van zowel wilde type planten als mutanten voor meervoudige vergelijkingen kan14helpen. Deze statistische analyse kan de juiste conclusie bieden over de verschillen in de bout tijd die door genotypes worden gegenereerd. In dit geval moet een multivariate Cox-proportionele gevarenanalyse worden gebruikt om twee variabele parameters te overwegen.
Om het touch-Force-niveau van de menselijke haren die op het model K1-aanraakapparaat zijn gemonteerd in te stellen, hebben we zowel de hoogte (verticale kracht) als de snelheid (horizontale kracht) van de haar borstels aangepast (Figuur 2E). De juiste instellingen werden bepaald op basis van de voorlopige gegevens verzameld uit vele rondes van Force level tests op een Arabidopsis installatie op een elektronische schaal. Zoals we hebben geconstateerd, zal het houden van zowel de haar hoogte als de snelheid ongewijzigd gedurende het gehele Touch Response-experiment een vergelijkbaar en constant thigmomorfogenetisch fenotype produceren tussen replicaten voor een Arabidopsis-lijn. Te zwaar een touch-Force kan de jonge zaailingen doden als de snel bewegende haar borstels kunnen leiden tot verwonden op het oppervlak van een blad. In tegenstelling, te licht een touch-Force is mogelijk niet genoeg om de vertraging van het vastgeschroefd binnen 2 weken na herhaling van aanraken te triggeren. In ons vorige experiment hebben we de juiste belasting van de aanraak kracht vastgesteld op 1-2 MN per aanraking14,19. De haar lengte van 0,5 cm lager dan de bekerrand wordt gebruikt voor het genereren van een vergelijkbare verticale Touch kracht op model K1 machine-gebaseerde haar aanraking met een zachte horizontale bewegende snelheid 5000 mm/min (Figuur 2E). Deze vaste instelling van model K1 machine vermindert de variatie van kracht sterkte als gevolg van de menselijke fout.
Over het algemeen zorgen de haar aanrakingen van de automatische Touch-Force-laad machine voor een gemiddelde drukkracht bij het laden van planten. De precieze Touch-Force toegepast, vooral de horizontale kracht geladen, is moeilijk te berekenen voor een enkel haar of een groep haren op een borstel. Bovendien kan de variantie van de vorm van de plant en de steel hoogte de toepassing van horizontale kracht verstoren. Het meten van dit soort fysieke kracht of stress heeft een nauwkeuriger druksensor nodig die gekoppeld is aan een haar of een groep haartjes. Er wordt aangenomen dat preciezere druksensor en wiskundige modellering zal worden toegepast om de automatische Touch-Force laad machine in de toekomst te verbeteren. De groeiomstandigheden, zoals lichtintensiteit, vocht van bodem en temperatuur van de kas en voedingsstoffen leveren, spelen allemaal een cruciale rol in de ontwikkeling van de Touch Response fenotype. Eventuele stress condities, zoals droogte, zwakke lichtomstandigheden met minder dan 90 μE ∙ m-2∙ s-1, en een hogere of een lagere temperatuur die de normale groei van Arabidopsis kan beïnvloeden, zullen interfereren met de meting van aanraak respons van zowel wild type en mutanten.
Kortom, deze automatische Touch-Force laad machine kan meer arbeidsbesparende en geüniformeerde gemiddelde Touch-Force belasting bieden dan menselijke vingeraanraking en wattenstaafje touch. Verwacht wordt dat de model K1 Touch machine zal worden toegepast in verschillende high-throughput Touch-Force signalering Mutant screening en Touch Response analyse onder agrarische gewassen of waarschijnlijk diermodellen met enkele wijzigingen van de Touch-Force laden Machine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gesteund door de volgende subsidies: 31370315, 31570187, 31870231 (National Science Foundation of China), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (RGC van Hong Kong). Auteurs willen Ju Feng Precision and Automation Technology Limited (Shenzhen, China) bedanken voor hun aanbod van verschillende schema's getoond in Figuur 1.
Schrijvers willen ook S. K. Cheung en W. C. Lee bedanken voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van de Touch-Force loading machine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
References
- Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica. Planta. 114, 143-157 (1973).
- Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. Light and gravity signals synergize in modulating plant development. Frontiers in Plant Science. 5, 563 (2014).
- Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. Mechanism of higher plant gravity sensing. American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).
- Salisbury, F. B. The Flowering Process. , Macmillan. New York. (1963).
- Darwin, C. The Power of Movement in Plants. , Appleton. New York. (1881).
- Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation. Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).
- Telewski, F. W., Jaffe, M. J. Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation. Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).
- Vogel, M. Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values. Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , Germany. (1994).
- Braam, J. In touch: plant responses to mechanical stimuli. New Phytologist. 165, 373-389 (2005).
- Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. Thigmo responses in plants and fungi. American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).
- Telewski, F. W. A unified hypothesis of mechanoperception in plants. American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).
- Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).
- Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes. New Phytologist. 165, 429-444 (2005).
- Wang, K., et al. Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).
- Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants. Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, 524 (1991).
- Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings. Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).
- Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).
- Braam, J., Davis, R. W. Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis. Cell. 60, 357-364 (1990).
- Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests. Current Biology. 22, 701-706 (2012).
- Telewski, F. W., Pruyn, M. L. Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings. Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).
- De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiology. , (2012).
- Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. Survival analysis part I: basic concepts and first analyses. British Journal of Cancer. 89, 232 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods. British Journal of Cancer. 89, 431 (2003).
- Jaffe, M., Forbes, S. Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants. Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).
- Kutschera, U., Niklas, K. J. Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis. Naturwissenschaften. 96, 1339 (2009).
