Summary
שלושת הצעדים הקריטיים של פרוטוקול זה i) מפתחים את ההרכב הנכון ונקבוביות עקביות הדיו הידרוג תאית, ii) 3D הדפסה של פיגומים לתוך שונות מבנים עם נאמנות בכושר טוב, מידות iii) הוכחת תכונות מכניות בתנאים מדומה הגוף עבור התחדשות הסחוס.
Abstract
עבודה זו מדגים את השימוש תלת מימדי (3D) הדפסה כדי לייצר פיגומים מעוקב נקבובי באמצעות תאית nanocomposite הידרוג דיו, עם מבנה בררניים, תכונות מכניות. Nanocrystals תאית (CNCs, 69.62 wt %) הידרוג מבוסס דיו עם מטריקס (alginate נתרן, ג'לטין) פותחה והודפס 3D לתוך פיגומים עם נקבוביות אחיד, צבע מבנה (110-1,100 מיקרומטר). פיגומים הראה דחיסה מודולוס בטווח של 0.20-0.45 MPa כאשר נבדק ב מדומה ויוו התנאים (מים מזוקקים ב 37 מעלות צלזיוס). גודל הנקבוביות, המודולוס דחיסה של פיגומים 3D תואם לדרישות הדרושים ליישומים התחדשות הסחוס. עבודה זו ממחישה כי מרקם של הדיו יכול להיות נשלט על ידי הריכוז של סימנים מקדימים נקבוביות יכול להיות נשלט על ידי תהליך ההדפסה התלת מימדית, שניהם גורמים אלה בתמורה מגדיר את מכניים המאפיינים של 3D מודפס נקבובי הידרוג לגרדום. ניתן להשתמש בשיטה זו תהליך ולכן כדי לבדות פיגומים מבנית, מאלכוהול מותאם אישית בהתאם לצרכים הספציפיים של חולים.
Introduction
תאית היא רב-סוכר המורכב שרשראות ליניארי של β יחידות D-גלוקוז המקושרות (1-4). הפולימר הטבעי הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ והוא מופק מגוון רחב של מקורות, כולל בעלי חיים ימיים (למשל, tunicates), צמחים (למשל, עץ, כותנה, קש חיטה) ומקורות חיידקים, כגון אצות (למשל, Valonia), פטריות, אפילו אמבה (חד-תאיים )1,2. תאית nanofibers (CNF) ו nanocrystals תאית (CNC) עם ממד אחד לפחות בננו מתקבלים באמצעות טיפולי מכני, חומצה הידרוליזה של תאית. לא רק ברשותם את המאפיינים של תאית, כגון פוטנציאל שינוי כימי, רעילות נמוכה, כימי, מתכלה, מתחדשת, אבל יש גם מאפיינים הננומטרי כמו גבוהה פנים סגולי, תכונות מכניות גבוהה , מאפייני rheological ואופטית. מאפיינים אטרקטיביים אלה הפכו CNFs ו- CNCs מתאים ליישומי ביו, בעיקר בצורה של תלת-ממדי (3D) הידרוג פיגומים3. פיגומים אלו דורשים מידות מותאמות אישית עם מבנה בררניים, נקבוביות מחובררים. הקבוצה שלנו ואחרים דיווחו על תאית נקבובי 3D nanocomposites מוכן דרך הליהוק, electrospinning, ליופיליזציה4,5,6,7,8. עם זאת, לשלוט על המבנה נקבובית, ייצור של גאומטריה מורכבת אינה מושגת באמצעות שיטות מסורתיות.
הדפסה תלת-ממדית היא טכניקת הייצור מוספים, שבהם עצמים תלת-ממדיים נוצרים שכבה על דרך בתצהיר מבוקר-מחשב של דיו9. היתרונות של הדפסת תלת-ממד על טכניקות מסורתיות כולל חופש עיצוב, מאקרו מבוקרת מיקרו מידות, ייצור של ארכיטקטורות מורכבות, התאמה אישית, הפארמצבטית. בנוסף, הדפסת תלת-ממד של CNFs ו- CNCs מציע גם הטיה-induced מערכים של חלקיקים, העדיפו כיוון, נקבוביות הדרגתיות ניתן להרחיב בקלות ל- 3D bioprinting10,11,12, 13 , 14 , 15. הדינמיקה של CNCs יישור במהלך הדפסת תלת-ממד כבר דיווח לאחרונה,16,17. ההתקדמות בתחום של bioprinting יש לאפשר לרקמות מודפס 3D ואיברים למרות האתגר מעורב כגון הבחירה וריכוז של תאים חיים, גורמי גדילה, קומפוזיציה של הדיו המוביל, הדפסה פשוטה, זרבובית קטרים18 19, ,20.
נקבוביות ואת חוזק של פיגומים משובי הסחוס הן תכונות חשובות המכתיבה את היעילות והביצועים שלו. גודל הנקבוביות ממלא תפקיד חשוב עבור אדהזיה, בידול, התפשטות של תאים כמו גם לגבי ההחלפה של חומרים מזינים, פסולת מטבולית21. אולם, אין גודל הנקבוביות מובהק זה יכול להיחשב ערך אידיאלי, כמה מחקרים הראה אתריים גבוה עם נקבוביות קטנות יותר בעוד אחרים הראו יותר התחדשות הסחוס עם נקבוביות גדולות יותר. Macropores (< 500 מיקרומטר) להקל על רקמות מינרליזציה, אספקת מזונם, פינוי פסולת, בעוד micropores (150-250 מיקרומטר) להקל על התא מצורף ותכונות מכניות יותר22,23. לגרדום מושתל חייב להיות מספיק מכנית מימי טיפול, ההשתלה, עד להשלמת מטרתו הרצויה. המודולוס compressive צבירה על הסחוס במפרק טבעי הוא דיווח כי בטווח של 0.1-2 MPa תלוי גיל, מין, מיקום שנבדקו4,24,25,26,27 28, ,29.
שלנו הקודם עבודה11, הדפסת תלת-ממד שימש כדי לפברק נקבובי bioscaffolds של תפור כפול interpenetrating רשת פולימר (IPN) מדיו הידרוג המכיל CNCs מחוזק במטריצה של alginate נתרן, ג'לטין. מסלול הדפסה 3D אופטימלי כדי להשיג פיגומים 3D עם נקבוביות אחיד, הדרגתיות מבנים (80-2,125 מיקרומטר) איפה nanocrystals אוריינט רצוי בכיוון ההדפסה (מידת התמצאות בין 61-76%). . הנה, אנו מציגים המשכיות זה לעבוד ומדגים ההשפעה של נקבוביות על התכונות המכאניות של תלת-ממד מודפס הידרוג פיגומים בתנאי גוף מדומה. CNCs היה כאן, דווחו קודם לכן על ידי אותנו להיות cytocompatible ולא רעיל (קרי, גדילת התאים לאחר 15 ימים של דגירה היה אושרו30). יתר על כן, פיגומים הכין דרך להקפיא ייבוש באמצעות את CNCs אותו, alginate נתרן, ג'לטין הראה נקבוביות גבוהה, גבוהה ספיגת של תמיסת מלח מאגר פוספט, cytocompatibility לעבר גזע mesenchymal5. מטרת עבודה זו היא להפגין עיבוד הדיו הידרוג, הדפסת תלת-ממד של פיגומים נקבובי, הבדיקה דחיסה. שרטוטים של המסלול עיבוד מוצג באיור1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מבשרי
- הכנה של השעיה nanocrystals תאית
הערה: בידוד של תאית nanocrystals נעשית על פי הנוהל שדווחו על-ידי מתיו, ואח30.- 17 wt % בתרחיף של תאית nanocrystals ל 2% wt על-ידי הוספת מים כדי להפוך את הנפח הכולל של 2 ל' לערבב ביסודיות באמצעות אולטרה sonication ושימוש אצוות קטנות יותר (250-300 מ ל) עבור ערבוב יעיל מזוקקים.
- עוברים את המתלים sonified דרך מהמגן 10 פעמים, בלחץ של 500-600 בר. בשלב זה, ג'ל שקוף בעובי של 2 wt % תאית nanocrystals מתקבל.
- רכז wt 2% תאית nanocrystals ג'ל ל 11% wt דרך centrifugations ב x 24,500 g עבור ה 1.5 Decant המים בין כל 30 דקות.
הערה: הניסוי ניתן להשהות כאן.
- הכנת מטריצה שלבים
- הכן תמיסה הומוגנית של wt 6% alginate נתרן (SA) במים מזוקקים-60 ° C תחת ערבוב רצוף.
- הכן תמיסה הומוגנית של wt 12% ג'לטין (ג'ל) במים מזוקקים-60 ° C תחת ערבוב רצוף.
הערה: להתכונן נפח של 20 מ"ל מטריקס פתרונות ולאחסן במקרר.
- הכנת crosslinkers
- להכין את הפתרון של 3% wt סידן כלורי במים מזוקקים בטמפרטורת החדר תחת ערבוב רצוף.
- להכין את הפתרון של 3% wt גלוטראלדהיד במים מזוקקים בטמפרטורת החדר תחת ערבוב רצוף.
הערה: להתכונן נפח של 50 מ ל פתרונות crosslinking ולאחסן הטמפרטורה בחדר. עיין טבלה של חומרים למידע הספק. ניתן להשהות כאן ניסוי.
2. הכנת הידרוג דיו
- הכן 40 מ של הידרוג הדיו במיכל פוליסטירן על ידי ערבוב wt 11% CNC, 6 wt % SA ו- wt 12% ג'ל להשיג רטוב (wt %) ההרכב של CNC/SA/ג'ל/מים: 6.87/1.50/1.50/90.12.
- מחממים את התערובת עד 40 ° צלזיוס, לערבב עם מרית עד עיסה חלקה, מתקבל.
- להעביר את התערובת לתוך מזרק 60 מ. להעביר את התערובת דרך סדרה של חרירי עם קטרים שונים לתוך מזרק 60 מ ל אחר, עם העזרה של קלאמפ מכני. חזור על התהליך עד חוטים בצורה חלקה עם הבלטה של הידרוג דיו מתקבלים. להתחיל עם החרירים בקוטר הגדול של 800 מיקרומטר, ואחריו מיקרומטר 600 ו 400 מיקרומטר.
- בעדינות צנטריפוגה (4000 x g) המזרק עם הידרוג דיו כדי להסיר מילוי אוויר לכוד.
הערה: הניסוי ניתן להשהות כאן.
3. מדידה של מאפייני rheological של הידרוג
NTE: לבצע מאפייני rheological באמצעות גאומטריה חלקה של חרוט על צלחת, CP25-2-SN7617, קוטר 25 מ מ, 2 ° הנומינלי בזווית ובגובה הפער 0.05 מ"מ 25 º C.
- הפעל את rheometer, מדחס אוויר, תיבת בקרת טמפרטורה. אתחל את התוכנה.
- הר בכלי מדידה rheometer ולהגדיר אפס-gap.
- הבלטת כ 1 מ"ל של הדיו הידרוג על הפלטפורמה rheometer.
- למדוד את צמיגות כפונקציה של שיעור הטיה. בחר את הטווח קצב הטיה מ 0.001 עד 1,000.
- אחרי המדידה נעשית, לנקות את הפלטפורמה rheometer, כלי מדידה. הבלטת 1 מ"ל של הידרוג טריים דיו שוב על הרציף rheometer.
- למדוד אחסון מודולים (G′), אובדן מודולים (G″) כפי פונקציה של גזירה בתדר של 1 הרץ. בחר את הטווח גזירה מ-103 עד 107.
- לאחר השלמת הבדיקות, להעתיק את הנתונים לקובץ טקסט, מגרש עקומות rheological לוגריתמי.
4. תיק לקראת הדפסה תלת-ממדית
הערה: התוכנה Cura 2.4.0 משמש לעיצוב תלת-ממד פיגומים (20 מ מ3) יש שלושה סוגים של הנקבוביות. 1-המדים הנקבוביות של 0.6 מ"מ, 2 אחידה הנקבוביות של 1.0 מ מ 3-צבע הנקבוביות של טווח 0.5-1 מ מ.
- הורד הקובץ stereolithography (stl) של קובייה מוצקה thingsinverse.com, פתח את הקובץ ב Cura.
- לחצו על דגם טעון והעברתו X/Y/Z: 0/0/0 מ מ. לחץ על קנה מידה, בטל את הסימון בתיבה עבור קנה מידה אחיד והגדר את הממדים X/Y/Z: 20/20/20 מ מ. לחץ על סובב וסובב את הקוביה על-ידי 45 ° במישור XY.
- בחלונית ' צד ', זרבובית & חומר, בחר 0.4 מ מ ולהדביק את הפרופיל. בחר Discov3ry מלאה המדפסת.
- בחלונית ' צד ', בחר מותאמת אישית עבור הגדרת הדפסה. בסעיף איכות , הזן 0.2 מ מ עבור כל המקטעים sub. בסעיף מעטפת , הזן 0 מ מ עבור כל המקטעים sub. בסעיף חומר , הזן 26 ° C עבור טמפרטורה, 1 מ מ קוטר, 100% לזרום. בסעיף מהירות , להזין 30 מ מ/s מהירות הדפסה ו- 120 מ מ/s כמו מהירות נסיעה. בסעיף התמיכה , בטל את סימון התיבה עבור תמיכה לזמינה. בסעיף אדהזיה הצלחת לבנות , בחר את החצאית, להזין 3 מ מ כמו חצאית מרחק של 150 מ מ אורך החצאית/ברים מינימום.
- על פיגומים עם גודל הנקבוביות אחיד, הזן 0.6 או 1 מ מ מרחק קו Infill ובחרו תבנית Infill רשת.
- פיגומים נקבוביות הדרגתיות, מיזוג וקיבוץ הכלי משמש. קליק ימני המודל טעון, בחר במספר דגמים, הזינו 2 תעיבק קנה המידה של כל דגם כמו X/Y/Z: 20/20/7 מ"מ. מניחים הדגמים אחד על גבי השני. הזן מרחק קו Infill 0.3, 0.5, 0.7 מ מ התחתון, התיכון ודגם טופ, בהתאמה. בחר כל שלושת הדגמים (Ctrl + A), קליק ימני ולחץ על קבוצת מודלים.
- לשמור את המודלים שבכרטיס בטוח דיגיטלי (SD). Cura לשמור באופן אוטומטי את הקובץ gcode הוא לקריאה על-ידי המדפסת.
5. 3D הדפסה פיגומים נקבובי
- להכניס את הצינור העברה בעל זרבובית, להתחבר אליו 400 זרבובית מיקרומטר. רמת הצלחת לבנות כדי לקבל את המרחק הנכון בין הצלחת לבנות ו זרבובית.
- לטעון את המזרק centrifuged לתוך הדיו וחבר אותו לצד השני של הצינור העברה.
- הכנס את כרטיס ה-SD לתוך המדפסת, בחר נקה מהר ולהתחיל מנקה את הדיו הידרוג עד שהוא מתחיל הבלטה של הצינור. המשך טיהור למשך 2-3 דקות לקבל זרם הומוגנית.
- של כרטיס ה-SD, בחר קבצים שנשמרו עבור פיגומים נקבוביות אחיד ולא הדרגתי ולהתחיל הדפסה. לפקוח עין על שיעור ההבלטה. במידת הצורך, התאם את מהירות וקצב זרימת בהתאם. לשימוש גודל הנקבוביות קטן יותר, מהירות גבוהה יותר בשילוב עם קצב הזרימה נמוך (50 מ מ/s ו-70%).
הערה: אל תיגע פיגומים מודפס 3D.
6. Crosslinking של תלת-ממד מודפס פיגומים
- בתום ההדפסה התלת-ממד, בעדינות להוסיף טיפות של wt 3% CaCl2 אל הגרדום עד שיהפוך רטוב לגמרי. המתן 5 דקות.
- להעביר בזהירות רבה לגרדום מהמדפסת במיכל 50 מ ל מלא wt 3% CaCl2. תשאיר את זה בן לילה.
- לשטוף ביסודיות עם מים מזוקקים ולהעביר לגרדום מיכל 50 מ עם 3 wt % גלוטראלדהיד מילוי. תשאיר את זה בן לילה.
- לשטוף ביסודיות ולאחסן לגרדום מודפס 3D במים מזוקקים.
7. דחיסת בדיקות
הערה: בצע דחיסה בדיקות עם תא מטען N 100 במים ב 37 º C.
- למלא את המיכל מצויד דחיסה מועמסת צלחת הבסיס עם 2 ל' מים ולהתחיל מערכת החימום כדי להגיע 37 מעלות צלזיוס.
- לאתחל את התוכנה Bluehill יוניברסל ולהגדיר את שיטת הבדיקה. בחר הדגימה מלבני הגיאומטריה ובחר את האפשרות להזין מידות לפני בדיקת כל דגימה. הגדר את קצב זן 2 מ"מ/min וסוף תוצאה כמו זן compressive 80% יחד עם כוח N 90.
- באזור ' מידות ', בחר כוח, עקירה, מתח compressive, זן compressive. בחר באפשרות כדי לייצא נתונים כקבצי טקסט להתוויה בעתיד.
- להגדיר נקודת האפס הרחבה באמצעות הפקדים jog להוריד צלחת גלגל נוהג קרוב ככל האפשר ללוחית.
- למדוד ורשום את הממדים של הדגימות להיבדק.
- טמפרטורת המים מגיעה ל- 37 ° C, מניחים את הדגימה על הבסיס. אבטח את הדגימה על-ידי הזזת את הצלחת גלגל נוהג כך הוא מתחיל לגעת המדגם.
- להזיז את המים הרותחים, כך הצלחות עם באמצע המדגם אותם שקועים בתוך המים.
- הזן מדגם וממדיו. התחל את הבדיקה.
- בתום הבדיקה, קודם להעביר את המים הרותחים למטה ולאחר מכן הרם את הצלחת גלגל נוהג.
- להסיר את הדגימה וחתיכות שלה, אם בכלל, לנקות את הצלחות בשני ולטעון מדגם חדש.
- לאחר כל הדגימות נבדקים, לייצא את הנתונים הגולמיים. מגרש מתח compressive נ' זן compressive עקומות ולקבוע המודולוס המשיק compressive-עומס בערכים של 1-5% ל- 25-30%.
הערה: הנח את הקוביה הדרגתי כך כי החורים גדולים יותר מול צלחת הבסיס של נייר מכתבים.
תחילה לאבטח לגרדום בין אוחז, ואז התחל/הפסק המדידה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CNCs מבוסס nanocomposite הידרוג דיו מראה של גזירה-ניוטונית חזקים דליל התנהגות (איור 2). צמיגות לכאורה של 1.55 × 105 Pa.s בקצב הטיה נמוך (0.001 s-1) טיפות על ידי חמישה סדרי גודל לערך של Pa.s 22.60 בקצב הטיה של 50 s-1 (≈50 s-1 להיות שיעור טיפוסי הטיה מנוסים במהלך הדפסת תלת-ממד)31 . הדיו הידרוג תערוכות viscoelastic התנהגות מוצק, כמו אחסון המודולוס G' (4.42 × 107 הרשות הפלסטינית) הוא בסדר גודל גדול יותר המודולוס אובדן G ' (8.26 × 106 הרשות הפלסטינית)-גזירה נמוכה, עם ערך מתח דינאמי תשואה מוגדרים היטב (G'= G ') של4 5.59 × 10 הרשות (איור 2b). 3D מודפס הידרוג nanocomposite נקבובי פיגומים הם באיור איור 3. עבור כל פיגומים המודפס, הצורה ואת מימדים היטב נשמרות לאחר ההדפסה, כמו גם לאחר crosslinking כפול. גודל הנקבוביות פיגומים, 110-1,100 מיקרומטר, הם בטווח של 100-400 מיקרומטר הנחשב תקן ביצוע עבור התחדשות הסחוס32.
פיגומים מודפס 3D נבדקו במצב דחיסה. זהו המצב המועדף על בדיקות מכניות לחומרים הסחוס כי תפקידו של הסחוס טבעי הוא לשאת משאות לדחיסת. כדי לחקות את התנאים ויוו, פיגומים נבדקו במים ב 37 º C. טבלה 1 , איור 4 מייצג את הנתונים compressive השיג עבור nanocomposite נקבובי שונים פיגומים הידרוג בקצב זן של 2 מ מ/דקה. במחירים מתח נמוך (1-5%), המודולוס compressive (~ 0.17 MPa) דומה פחות או יותר לכל סוגי פיגומים נקבובי. זה מראה כי הטבע אלסטי של הדיו הידרוג נשמרת אפילו ב- הנוכחות של macropores... עם זאת, במחירים למתח גבוה (25-30%), המודולוס הגבוהה של 0.45 MPa מתקבל עבור הפניה לגרדום עם אין נקבוביות. עם זאת, ברגע מגדיל גודל הנקבוביות, המודולוס פוחתת, בשל הירידה בצפיפות המציינת את היחס הצפוי בין נקבוביות פיגומים ולמאפיינים מכני. במקרה של פיגומים נקבובי הדרגתיות, המודולוס הוא גבוה יותר (MPa 0.34) לעומת פיגומים נקבובי אחיד (0.20 ו 0.26 MPa) עקב הנוכחות של הנקבובית בגדלים קטנים יותר, קירות מוצקים יותר. יתר על כן, המודולוס compressive של הידרוג תלת-ממד פיגומים מתגבר ככל עליות קצב דחיסה (איור 4b), מפגין, מחקה את viscoelasticity של רקמות הסחוס טבעי הנחשב לטובת טעינה מיסב פיגומים33. המודולוס compressive של 0.20 MPa בקצב זן של 2 מ מ/דקה עולה ל 0.35 MPa ב- 5 מ מ/דקה נוספת עולה ל MPa 0.47 ב- 120 מ מ/דקה ו היא בטווח שדווחו עבור סחוס טבעי (קרי, compressive מודולוס של 0.1-2 מגפ ס).
איור 1 . שרטוטים של המסלול עיבוד. () הכנת הדיו הידרוג nanocomposite. (b). פיגומים נקבובי הדפסת תלת-ממד. (ג) crosslinking כפול של תלת-ממד מודפס פיגומים. (ד) דחיסה בדיקה של תלת-ממד פיגומים נקבובי במים ב 37 º C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . יומן – רישום החלקות של דיו הידרוג nanocomposite. () צמיגות לעומת הטיה rate ו- (b) G' ו- G ' לעומת גזירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 -3D מודפס פיגומים נקבובי. סולם: 500 מיקרומטר. () הפניה בלי חורים. גודל הנקבוביות של 1 מ מ (b). גודל הנקבוביות של 0.60 mm (c). (ד) הדרגתי נקבוביות 110-800 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . מתח נציג-זן עקומות עבור תלת-ממד מודפס nanocomposite נקבובי הידרוג פיגומים. () בקצב קבוע זן של 2 מ מ/ש (b)-זן שונה הנקבוביות המחירים עבור 1 מ"מ גודל לגרדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| גודל הנקבוביות היעד (מיקרומטר) | גודל הנקבוביות הממוצע (מיקרומטר) | מודולוס compressive-זן 1-5% (MPa) | מודולוס compressive ב- 25-30% זן (MPa) |
| הפניה | 0 | 0.19 ± 0.04 | 0.45 ± 0.03 |
| 1,000 | 850-1,100 | 0.17 ± 0.02 | 0.2 ± 0.01 |
| 600 | 480-650 | 0.16 ± 0.01 | 0.26 ± 0.05 |
| מעבר צבע | 110-800 | 0.16 ± 0.01 | 0.34 ± 0.04 |
טבלה 1. דחיסת נתונים עבור תלת-ממד מודפס nanocomposite הידרוג פיגומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדפסה תלת-ממדית דורש מתאימים מאפייני rheological הידרוג הדיו. הדיו צמיגות גבוהה ידרוש בלחצים קיצוניים לשחול שלה בזמן צמיגות נמוכה דיו לא ישמור על צורתו לאחר שחול. צמיגות של הדיו הידרוג יכול להיות נשלט באמצעות הריכוז של החומרים. לעומת שלנו הקודם עבודה11, התוכן מוצק של הדיו הידרוג הוא גדל מ- 5.4 ל 9.9% wt וכתוצאה מכך דיו הידרוג מרוכזים אשר מסייע לשיפור הרזולוציה של לגרדום המודפס. זה עשוי לציין כי, בניגוד CNFs גמיש ארוך, רוד נוקשה כמו CNCs יכול לייצר דיו כשהתוכן מוצק גבוה יותר-צמיגות נתון עקב היעדרויות מעימותים פיזיים14. היבט חשוב נוסף המשפיעות שמשטחו הוא ההומוגניות של הדיו. צוין כי חימום הדיו הידרוג בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס מקדמת הומוגני מערבוב של CNCs עם השלב מטריקס. כדי להבטיח המשך את החלקות של הדיו הידרוג, זה עבר דרך סדרה של חרירי, החל הקוטר הכי גדול של 800 מיקרומטר, ואז מיקרומטר 600 מיקרומטר 400 סוף סוף. במהלך מעברים אלה, הצינור יכול להיות סתומות המציין את הנוכחות של גושים גדולים אבל אחרי אלה עובר הדיו הידרוג extruded ללא מאמץ, בדמות פילמנט רציף. התנועה החרירים כדי להשיג בונה מודפס 3D הוא גם חשיבות רבה כמצוין על-ידי עבודה קודמות שלנו11. מסלול זרבובית יש להימנע תנועות חוזרות ונשנות, התצהירים עודף הדיו הידרוג כך נשמר את הרזולוציה של ההדפסה התלת-ממד.
נקבוביות בשנת פיגומים הידרוג מודפס 3D הוא בתוך הטווח המקובל לעומת יישוב שהנקבוביות הן (טבלה 1). לא ניתן לצפות התאמה מדויקת בשל מהות הדיו הידרוג נפיחות. מרקם של הדיו הידרוג הוא גורם חשוב במיוחד כאשר crosslinking לשעבר-באתרו חייב להיעשות, קרי crosslinking לאחר ההדפסה של הבונה תלת-ממד. צוין כי הדיו הידרוג מרוכז מספיק (תוכן מוצק של 9.9 wt %) כדי לשמור על צורה, מבנה וממדים במהלך ולאחר תהליך ההדפסה.
גודל הנקבוביות לגרדום ממלא תפקיד חיוני תא אינטראקציות, דיפוזיה חמצן, פינוי פסולת יחד עם תכונות מכניות שלה לבצע ולתמוך את הפונקציונליות הרצויה. פיגומים עם נקבוביות הדרגתיות יש היכולת לייצג טוב יותר את התנאים ויוו בפועל שבו תאים נחשפים שכבות של רקמות שונות עם שלל מאפיינים מבניים22,23,34. נקבוביות ואת תכונות מכאניות הקשורות הפוך אבל ההרכב של לגרדום הידרוג יכול לשחק תפקיד חשוב. CNCs נבחר המרכיב העיקרי של הדיו הידרוג בגלל35,2,36שלה ידועים תכונות מכניות. הדיו הידרוג מפוברק כאן, להחזיק את האלסטיות שלו כבר הנוכחות של הנקבוביות, כולל גודל הנקבוביות אופטימלית של (110-1,100 מיקרומטר), של מודולוס compressive מתאימים (0.20-0.45 MPa) הדרושים ליישומים התחדשות הסחוס.
דחיסה בדיקה נעשתה במים, בטמפרטורה של הגוף כדי לחקות את התנאים ויוו ככל האפשר. שלב הייבוש לא היה מעורב בין הדפסת תלת-ממד בדיקות מכניות. ברקמות טבעי, הדרגתי נקבוביות הוא ציין ולא גודל הנקבוביות אחידה אחת. אותו הדבר נכון עבור דחיסה ערכים עבור הנשיאה הטבעי רקמות, כפי המודולוס compressive תלוי הגיל, מין המיקום שנבדקו.
היתרון עם המחקר המוצג כאן הוא נקבוביות הסופי והערכים מודולוס compressive של לגרדום נקבובי 3D יכול להיות נשלט אישית דרך הידרוג דיו הרכב ואת תהליך ההדפסה התלת-ממד. פרוטוקול זה גמיש, ניתן לשנות לפי דרישות ספציפיות. הדפסה תלת-ממדית טכניקה חזקה, ניתן לסייר בעתיד לפתח פיגומים עם תכונות ההלחנה מבניים מורכבים. רב גשמי dispensing יכול להציג את המהפכה על ידי שליטה ההרכב של פיגומים, ריכוז של תאים או גורמי גדילה, תכונות מבניות, כגון כיוון או נקבוביות, תכונות מכניות וקצב השפלה שונים חלקי המבנה התלת-ממד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך כלכלית על ידי קנוט וקרן אליס ולנברג (ולנברג עץ מרכז המדע), מועצת המחקר השבדי, VR (Bioheal, להחיות 2016-05709 ולא להחיות 2017-04254).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mL syringe | Structur3D Printing | ||
| Alginic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | 9005-38-3 | |
| Anhydrous calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamps, three pronged, Talon | VWR | 241-0404 | 102 mm, Dual adjustment clamp, large, clamp extension 127 mm |
| Cura 2.4.0 | Ultimaker | Free slicing software | |
| Discov3ry Complete | Structur3D Printing | Ultimaker 2+ 3D printer integrated with Discov3ry paste extruder | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Glutaraldehyde solution 50 wt. % in H2O | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| homogenizer | SPX | APV-2000 | |
| Instron 5960 | Instron | Instron 5960, Biopuls Bath, 100 N load cell, 37 °C, | |
| Physica MCR 301 rheometer | Anton Paar | CP25-2-SN7617, gap height 0.05 mm, 25 °C | |
| Sorvall Lynx 6000 centrifuge | AB Ninolab | s/n 41881692 | F12-rotor (6x500 ml) |
| stainless steel nozzle | Structur3D Printing | 800, 600 and 400 µm | |
| thingsinverse | MakerBot's | sharing and downloading 3D printable things in form of stl files | |
| ultra sonication | Qsonica, LLC | Q500 | |
| Unbarked wood chips | Norway spruce(Picea abies) | dry matter content of 50–55% |
References
- Moon, R. J., Martini, A., Nairn, J., Simonsen, J., Youngblood, J. Cellulose nanomaterials review: structure, properties and nanocomposites. Chemical Society Reviews. 40 (7), 3941-3994 (2011).
- Dufresne, A. Nanocellulose: a new ageless bionanomaterial. Materials Today. 16 (6), 220-227 (2013).
- Chinga-Carrasco, G. Potential and limitations of nanocelluloses as components in biocomposite inks for three-dimensional bioprinting and for biomedical devices. Biomacromolecules. 19 (3), 701-711 (2018).
- Naseri, N., Poirier, J., Girandon, L., Fröhlich, M., Oksman, K., Mathew, A. P. 3-Dimensional porous nanocomposite scaffolds based on cellulose nanofibers for cartilage tissue engineering: tailoring of porosity and mechanical performance. Royal Society of Chemistry Advances. 6 (8), 5999-6007 (2016).
- Naseri, N., Deepa, B., Mathew, A. P., Oksman, K., Girandon, L. Nanocellulose-Based Interpenetrating Polymer Network (IPN) Hydrogels for Cartilage Applications. Biomacromolecules. 17 (11), 3714-3723 (2016).
- Naseri, N., Mathew, A. P., Girandon, L., Fröhlich, M., Oksman, K. Porous electrospun nanocomposite mats based on chitosan-cellulose nanocrystals for wound dressing: effect of surface characteristics of nanocrystals. Cellulose. 22 (1), 521-534 (2015).
- Xing, Q., Zhao, F., Chen, S., McNamara, J., DeCoster, M. A., Lvov, Y. M. Porous biocompatible three-dimensional scaffolds of cellulose microfiber/gelatin composites for cell culture. Acta Biomaterialia. 6 (6), 2132-2139 (2010).
- Nandgaonkar, A., Krause, W., Lucia, L. Fabrication of cellulosic composite scaffolds for cartilage tissue engineering. Nanocomposites for musculoskeletal tissue regeneration. , Elsevier. 187-212 (2016).
- Gross, B. C., Erkal, J. L., Lockwood, S. Y., Chen, C., Spence, D. M. Evaluation of 3D printing and its potential impact on biotechnology and the chemical sciences. Analytical Chemistry. 86 (7), 3240-3253 (2014).
- Markstedt, K., Mantas, A., Tournier, I., Martínez Ávila, H., Hägg, D., Gatenholm, P. 3D bioprinting human chondrocytes with nanocellulose-alginate bioink for cartilage tissue engineering applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
- Sultan, S., Mathew, A. P. 3D printed scaffolds with gradient porosity based on a cellulose nanocrystal hydrogel. Nanoscale. 10, 4421-4431 (2018).
- Sultan, S., Siqueira, G., Zimmermann, T., Mathew, A. P. 3D printing of nano-cellulosic biomaterials for medical applications. Current Opinion in Biomedical Engineering. 2, 29-34 (2017).
- Sultan, S., Abdelhamid, H. N., Zou, X., Mathew, A. P. CelloMOF: Nanocellulose Enabled 3D Printing of Metal-Organic Frameworks. Advanced Functional Materials. , 1805372-1805384 (2018).
- Siqueira, G., et al. Cellulose Nanocrystal Inks for 3D Printing of Textured Cellular Architectures. Advanced Functional Materials. 27 (12), 1604619-1604629 (2017).
- Wang, J., et al. All-in-One Cellulose Nanocrystals for 3D Printing of Nanocomposite Hydrogels. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2353-2356 (2018).
- Hausmann, M. K., et al. Dynamics of Cellulose Nanocrystal Alignment during 3D Printing. ACS Nano. 12 (7), 6926-6937 (2018).
- Liu, Y., et al. Nanoscale assembly of cellulose nanocrystals during drying and redispersion. ACS Macro Letters. 7 (2), 172-177 (2018).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature communications. 5, 3935 (2014).
- Xia, Z., Jin, S., Ye, K. Tissue and organ 3D bioprinting. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (4), 301-314 (2018).
- Zhang, Q., Lu, H., Kawazoe, N., Chen, G. Pore size effect of collagen scaffolds on cartilage regeneration. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2005-2013 (2014).
- Loh, Q. L., Choong, C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: role of porosity and pore size. Tissue Engineering, Part B: Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).
- Bružauskaitė, I., Bironaitė, D., Bagdonas, E., Bernotienė, E. Scaffolds and cells for tissue regeneration: different scaffold pore sizes-different cell effects. Cytotechnology. 68 (3), 355-369 (2016).
- Zhang, L., Hu, J., Athanasiou, K. A. The role of tissue engineering in articular cartilage repair and regeneration. Critical Reviews™ in Biomedical Engineering. 37 (1-2), (2009).
- Athanasiou, K., Rosenwasser, M., Buckwalter, J., Malinin, T., Mow, V. Interspecies comparisons of in situ intrinsic mechanical properties of distal femoral cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 9 (3), 330-340 (1991).
- Schinagl, R. M., Gurskis, D., Chen, A. C., Sah, R. L. Depth-dependent confined compression modulus of full-thickness bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 15 (4), 499-506 (1997).
- Athanasiou, K., Niederauer, G., Schenck, R. Biomechanical topography of human ankle cartilage. Annals Biomedical Engineering. 23 (5), 697-704 (1995).
- Athanasiou, K. A., Liu, G. T., Lavery, L. A., Lanctot, D. R., Schenck, R. C. Biomechanical topography of human articular cartilage in the first metatarsophalangeal joint. Clinical Orthopaedics and Related Research. 348, 269-281 (1998).
- Guilak, F., Jones, W. R., Ting-Beall, H. P., Lee, G. M. The deformation behavior and mechanical properties of chondrocytes in articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (1), 59-70 (1999).
- Mathew, A. P., Oksman, K., Karim, Z., Liu, P., Khan, S. A., Naseri, N. Process scale up and characterization of wood cellulose nanocrystals hydrolysed using bioethanol pilot plant. Industrial Crops and Products. 58, 212-219 (2014).
- Compton, B. G., Lewis, J. A. 3D-printing of lightweight cellular composites. Advanced Materials. 26 (34), 5930-5935 (2014).
- Sarem, M., Moztarzadeh, F., Mozafari, M. How can genipin assist gelatin/carbohydrate chitosan scaffolds to act as replacements of load-bearing soft tissues. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 635-643 (2013).
- Chia, H. N., Hull, M. Compressive moduli of the human medial meniscus in the axial and radial directions at equilibrium and at a physiological strain rate. Journal of orthopaedic research. 26 (7), 951-956 (2008).
- Zhang, K., Fan, Y., Dunne, N., Li, X. Effect of microporosity on scaffolds for bone tissue engineering. Regenerative biomaterials. 5 (2), 115-124 (2018).
- Lin, N., Dufresne, A. Nanocellulose in biomedicine: Current status and future prospect. European Polymer Journal. 59, 302-325 (2014).
- Domingues, R. M., Gomes, M. E., Reis, R. L. The potential of cellulose nanocrystals in tissue engineering strategies. Biomacromolecules. 15 (7), 2327-2346 (2014).
