Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

स्टूल डीएनए इंटीग्रिटी डिटेक्शन द्वारा कोलोरेक्टल कैंसर जोखिम और व्यापकता का मूल्यांकन

Published: June 8, 2020 doi: 10.3791/59426
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 2Diatech Pharmacogenetics srl

ERRATUM NOTICE

Summary

प्रस्तुत नैदानिक FL-डीएनए किट कोलोरेक्टल कैंसर घावों की उपस्थिति की विश्वसनीय संभावना निर्धारित करने के लिए एक समय की बचत और उपयोगकर्ता के अनुकूल विधि है।

Abstract

आजकल, मल डीएनए अलग और कई तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है । मल में डीएनए के लंबे टुकड़ों का पता क्यूपीसीआर परख द्वारा लगाया जा सकता है, जो पूर्व-नियोप्लास्टिक या नियोप्लास्टिक कोलोरेक्टल घावों की उपस्थिति की विश्वसनीय संभावना प्रदान करता है। फ्लोरेसेंस लांग डीएनए (FL-DNA) नामक यह विधि एक तेज, गैर-आक्रामक प्रक्रिया है जो प्राथमिक रोकथाम प्रणाली पर सुधार है। यह विधि जीनोमिक डीएनए के विशिष्ट लक्ष्यों के मात्रात्मक प्रवर्धन द्वारा मल डीएनए अखंडता के मूल्यांकन पर आधारित है। विशेष रूप से, 200 बीपी से अधिक समय तक डीएनए टुकड़ों का मूल्यांकन बहुत उच्च विशिष्टता वाले कोलोरेक्टल घावों वाले रोगियों का पता लगाने की अनुमति देता है। हालांकि, यह प्रणाली और वर्तमान में उपलब्ध सभी मल डीएनए परीक्षण कुछ सामान्य मुद्दों को प्रस्तुत करते हैं जिन्हें संबोधित करने की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, जिस आवृत्ति पर परीक्षण किए जाने चाहिए और प्रत्येक व्यक्ति के लिए प्रत्येक समय बिंदु पर एकत्र किए गए मल नमूनों की इष्टतम संख्या)। हालांकि, FL-डीएनए का मुख्य लाभ वर्तमान में सीआरसी स्क्रीनिंग कार्यक्रम में उपयोग किए जाने वाले परीक्षण के सहयोग से इसका उपयोग करने की संभावना है, जिसे इम्यूनोकेमिकल-आधारित मल मनोगत रक्त परीक्षण (आईएफओबीटी) के रूप में जाना जाता है। दरअसल, दोनों परीक्षण एक ही नमूने पर किए जा सकते हैं, लागत को कम करने और कोलोरेक्टल घावों की अंतिम उपस्थिति की बेहतर भविष्यवाणी प्राप्त कर सकते हैं।

Introduction

कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) एक बहु-चरण प्रक्रिया से प्राप्त होता है जिसमें स्वस्थ एपिथेलियम धीरे-धीरे एडेनोमा या जंतु में विकसित होता है, जो समय1,,2के साथ घातक कार्सिनोमा में प्रगति करता है। सीआरसी की उच्च घटना दर के बावजूद, पिछले3दशक में मौतों के प्रतिशत में गिरावट देखी गई है । दरअसल, स्क्रीनिंग कार्यक्रमों में अपनाए गए प्रारंभिक नैदानिक उपकरणों के कारण पूर्व-नियोप्लास्टिक एडेनोमा या जंतु4का जल्दी पता लगाया गया है। हालांकि, विभिन्न तकनीकी सीमाओं के कारण, इनमें से कोई भी तरीका इष्टतम नहीं है। दरअसल, संवेदनशीलता और विशिष्टता में सुधार करने के लिए, कई मल डीएनए परीक्षण अकेले या वर्तमान नियमित नैदानिक परीक्षणों5,,6के संयोजन में प्रस्तावित किया गया है ।

आमतौर पर, स्वस्थ म्यूकोसा मल धारा एपोप्टोटिक कोलोनोसाइट्स में बहाता है, जबकि रोगग्रस्त म्यूकोसा एक्सफोलिएट्स गैर-अपोप्टिक कोलोनोसाइट्स। 200 बीपी या लंबाई में अधिक के टुकड़े गैर-अपोप्टोटिक डीएनए की विशेषता है। इस डीएनए को लॉन्ग डीएनए (एल-डीएनए) कहा जाता है और यह सीआरसी अर्ली डायग्नोसिस के लिए एक उपयोग योग्य बायोमार्कर बन गया है । एल-डीएनए को मल के नमूने से अलग किया जा सकता है और क्यूपीसीआर द्वारा इन विट्रो डायग्नोस्टिक एफएल-डीएनए किट,7,8,9,10,11,12का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है ।

इस परीक्षण में 138 बीपी से लेकर 339 बीपी तक एफएल-डीएनए के टुकड़ों का पता लगाने के लिए दो परख ें होती हैं। प्रत्येक परख FL-डीएनए (FAM) के प्रवर्धन के साथ ही स्पाइक-इन डीएनए (HEX) की अनुमति देता है । सभी टुकड़ों के इष्टतम प्रवर्धन को सुनिश्चित करने के लिए, परीक्षण को दो परखों (नाम "ए" और "बी" में विभाजित किया गया है)। एक परख एपीसी जीन (NM_001127511) के एक्सोन 14 के दो क्षेत्रों और TP53 जीन (NM_001276760) के एक्सोन 7 का एक टुकड़ा का पता लगाता है । बी परख एपीसी जीन (NM_001127511) के एक्सोन 14 के एक टुकड़े और टीपी53 जीन (NM_001276760) के एक्सोन 5 और 8 के दो क्षेत्रों का पता लगाता है । परखों का पता चलने वाले क्षेत्रों में अंतर नहीं है । स्पाइक-इन डीएनए ओंकोरिन्चुस केटा सामन डीएनए से मेल खाता है और सत्यापन को सक्षम बनाता है कि प्रक्रिया ठीक से की गई है और अवरोधकों की संभावित उपस्थिति के लिए जांच करती है, जिससे झूठे नकारात्मक परिणाम मिल सकते हैं। FL-डीएनए एकाग्रता मानक वक्र विधि का उपयोग कर पूर्ण मात्राीकरण द्वारा मूल्यांकन किया जाता है और एनजी/प्रतिक्रिया के रूप में व्यक्त किया जाता है ।

FL-डीएनए विधि एक गैर आक्रामक और सस्ती मल डीएनए परीक्षण है कि, इम्यूनोकेमिकल आधारित मल मनोगत रक्त परीक्षण (iFOBT) के साथ संयुक्त, वर्तमान में सीआरसी स्क्रीनिंग कार्यक्रमों में प्रयोग किया जाता है और सीआरसी और/या उच्च जोखिम वाले adenoma घावों12की बेहतर भविष्यवाणियों के लिए अनुमति देता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

२०१३ और २०१५ के बीच मेलडोला (एफसी, इटली) के इस्टिटो साइंटिफिकरो रोमाग्नोलो प्रति लो स्टूडियो ई ला कुरा देई ट्यूमरी (आईआरएसटी) में मरीजों को भर्ती किया गया । नामांकित रोगियों प्रोटोकॉल IRSTB002 में थे, IRST की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित-IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1) । सभी तरीकों को प्रासंगिक दिशा-निर्देशों और विनियमों के अनुसार किया गया था । सभी रोगियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. मल से डीएनए निष्कर्षण

  1. मल के नमूने तैयार करने के लिए एक किट का उपयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें)। निर्माता के निर्देशों के अनुसार निष्कर्षण प्रदर्शन करके मल सामग्री का चयन करें और उनका इलाज करें। शुद्ध डीएनए को सीधे बढ़ाना या बाद के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. सकारात्मक नियंत्रण, मानकों, स्पाइक-इन डीएनए और नैदानिक नमूनों की तैयारी

  1. मानकों और नमूनों की तैयारी
    1. सकारात्मक नियंत्रण, मानकों, स्पाइक-इन डीएनए, और सभी नैदानिक नमूनों को तैयार करने के लिए, सकारात्मक नियंत्रण, मानकों और स्पाइक-इन डीएनए का एक बहाना अपकेंद्रित्र, फिर प्रदान किए गए पानी की सही मात्रा को जोड़कर प्रत्येक अभिकर्ता को फिर से निलंबित करें (नीचे देखें)। फिर, ध्यान से सकारात्मक नियंत्रण, मानक, और स्पाइक-इन डीएनए को भंवर, फिर 10 एस के लिए अपकेंद्री। शुष्क अभिकर्मकों के पूर्ण पुनर्निलंबन को प्राप्त करने के लिए, उपयोग से पहले 30 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर तरल अभिकर्मकों को स्टोर करें।
      1. सकारात्मक नियंत्रण एक शुष्क प्रारूप में मानव डीएनए है। प्रत्येक अलीकोट को 750 माइक्रोन पानी के साथ फिर से निलंबित करें।
      2. स्पाइक-इन डीएनए सामन(Oncorhynchus केटा)डीएनए है, जिसका उपयोग मल से निकाले गए डीएनए नमूनों में अवरोधकों की संभावित उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए एक बहिर्जात आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया जाता है। 100 माइक्रोन पानी के साथ प्रत्येक एलिकोट को फिर से निलंबित करें।
    2. मानक वक्र तैयार करने के लिए, स्टॉक समाधान से शुरू होने वाले चार 1:5 कमजोर होने का उत्पादन करें। मानक बिंदु 10 एनजी/प्रतिक्रिया, 2 एनजी/प्रतिक्रिया, ०.४ एनजी/प्रतिक्रिया, और ०.०८ एनजी/प्रतिक्रिया होनी चाहिए ।
  2. 1x स्पाइक-इन डीएनए की तैयारी
    1. उपयोग से पहले स्पाइक-इन डीएनए नियंत्रण को सीधे तैयार करें।
    2. बाँझ पानी के 20 माइक्रोन के साथ FL-DNa स्पाइक के 5 μL मिश्रण द्वारा 1x स्पाइक-इन डीएनए नियंत्रण तैयार करें। 1x स्पाइक-इन डीएनए नियंत्रण नमूनों की संख्या का विश्लेषण किया जाना है, प्लस सकारात्मक नियंत्रण के अनुसार तैयार किया जाएगा ।
  3. नमूनों की तैयारी
    1. 1x स्पाइक-इन डीएनए के 25 माइक्रोन के साथ नमूनों (नैदानिक नमूने या सकारात्मक नियंत्रण) के 75 माइक्रोन मिलाएं, जिससे कुल मात्रा 100 माइक्रोन निकलेगी।

3. क्यूपीसीआर ईज़ी पीजीएक्स का उपयोग करके एफएल-डीएनए मूल्य का प्रवर्धन और निर्धारण

नोट: मानव डीएनए और आंतरिक नियंत्रण को लक्षित करने वाले विशिष्ट प्राइमर और जांच वाले पूर्ण प्रवर्धन मिश्रण को एफएल-डीएनए मिक्स ए और एफएल-डीएनए मिक्स बी मानकों, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों के लिए 8 अच्छी तरह से स्ट्रिप्स में एक लाइओफिलाइज्ड प्रारूप में प्रदान किया जाता है, और नमूनों को दोनों lyophilized घोला जा सकता है के साथ परिलक्षित किया जाना चाहिए । नैदानिक नमूनों को केवल दोनों lyophilized घोला जा सकता है के साथ डुप्लिकेट में परिलक्षित किया जाना चाहिए ।

  1. क्यूपीसीआर इंस्ट्रूमेंट और ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    1. ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर खोलें और प्लेट और थर्मल प्रोफाइल स्थापित करें:
      1. प्लेट की स्थापना के रूप में तालिका 1में दिखाया गया है ।
        1. मानकके रूप में कॉलम 1 में सभी आठ पदों के लिए अच्छी तरह से प्रकार सेट करें ।
        2. ए 2 और बी 2 कुओं के लिए अच्छी तरह से टाइप को एनटीसीके रूप में सेट करें।
        3. C2 और D2 (सकारात्मक नियंत्रण) के लिए अज्ञातके रूप में अच्छी तरह से प्रकार सेट करें ।
        4. अज्ञात के रूप में अन्य सभी पदों के लिए अच्छी तरह से प्रकार सेट करें।
        5. सभी 96 पदों का चयन करें, और रंग ों FAM और हेक्सजोड़ें। सिंक प्लेटपर क्लिक करें ।
      2. टेबल 2के अनुसार थर्मल प्रोफाइल सेट करें ।
    2. ट्यूब के नीचे सामग्री लाने के लिए 10 एस के लिए स्ट्रिप्स की आवश्यक संख्या को केंद्राधीक्षक करें।
    3. सामग्री को बनाए रखने के लिए ध्यान देते समय स्ट्रिप्स से सील धीरे-धीरे हटा दें, और संबंधित स्ट्रिप्स में जोड़ें: नकारात्मक नियंत्रण: पानी का 20 माइक्रोन; नमूना: डीएनए के 20 μL; मानक वक्र: मानक 1, 2, 3, या 4 के 20 μL; सकारात्मक नियंत्रण: सकारात्मक नियंत्रण के 20 μL।
    4. कुछ सेकंड के लिए 8 स्ट्रिप फ्लैट ऑप्टिकल कैप और भंवर का उपयोग करके ध्यान से सभी स्ट्रिप्स बंद करें।
    5. 10 एस के लिए स्ट्रिप्स को अपकेंद्रित करें और उन्हें उपकरण में लोड करें। इसके बाद रन शुरू करें।

4. डेटा विश्लेषण

नोट: डेटा विश्लेषण स्वचालित रूप से या मैन्युअल रूप से सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें)के आधार पर किया जा सकता है।

  1. रन के अंत में,"FAM:FL-DNA-A" और"हेक्स: आईसी"के लिए कॉलम ए, सी, ई, जी का चयन करें, और कॉलम बी, डी, एफ, एच के लिए"FAM:FL-DNA-B" और"हेक्स: आईसी"।
  2. कक्षा शुरू राशि के लिए निम्नलिखित सेट राशि:10 एनजी/A1 और B1 कुओं के लिए प्रतिक्रिया, 2 एनजी/C1 और D1 के लिए प्रतिक्रिया, ०.४ एनजी/E1 और F1 के लिए प्रतिक्रिया, और ०.०८ एनजी/G1 और H1 के लिए प्रतिक्रिया ।
  3. एफएएम (FL-DNA A और FL-DNA B) और एचईएक्स (आईसी) दोनों के लिए 150 तक थ्रेसहोल्ड फ्लोरेसेंस मान निर्धारित करें।
  4. बॉक्स रिजल्ट टेबलमेंकॉलम ऑप्शंस पर क्लिक करें । सभी का चयन करें । ठीक है अपने संबंधित Cq (‧R) और के साथ दोनों चैनलों में परिणाम प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: इन मूल्यों की आपूर्ति रियल टाइम पीसीआर इंस्ट्रूमेंट सॉफ्टवेयर द्वारा की जाती है। पिछले प्रवर्धन चक्र के लिए सामान्यीकृत फ्लोरेसेंस मूल्य से मेल खाती है।
  5. बॉक्स रिजल्ट टेबल में, संदर्भ मेनू खोलने के लिए टेबल पर राइट-क्लिक करें और कच्चे डेटा को निर्यात करने के लिए एक्सेल को भेजें पर क्लिक करें।
  6. मानक वक्र की उपयुक्तता को सत्यापित करने के लिए मानकों के मूल्यों की जांच करें।
  7. प्रत्येक FL-डीएनए मिश्रण के लिए, आर2 की जांच करें ["R² (R²)" कॉलम] और दक्षता ["दक्षता (%)) कॉलम] मूल्य। यदि वे एक स्वीकार्य सीमा में हैं, तो निर्माता के निर्देशों(तालिका 3)के अनुसार विश्लेषण के साथ आगे बढ़ना संभव है।
  8. यदि एफएएम चैनल के परिणाम अपेक्षित सीमा में नहीं हैं, तो मानक वक्र के एक बिंदु को छोड़ दें और रन का पुनर्विश्लेषण करें।
  9. शून्य के रूप में "कोई सीक्यू" मूल्यों पर विचार करते हुए, निम्नलिखित सूत्र के साथ नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के मूल्यों का निर्धारण करें:
    Equation 1
    Equation 2
  10. प्राप्त मूल्यों की तुलना तालिका 4में सूचित किए गए मूल्यों से करें ।
  11. यदि प्रतिक्रिया नियंत्रण अपेक्षित मूल्यों की सीमा में हैं, तो नमूनों के विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: सत्यापित करें कि प्राप्त सीक्यू मूल्य वास्तविक प्रवर्धन प्रतिक्रिया (सिग्मोइडल फ्लोरेसेंस वक्र) से उत्पन्न होते हैं, न कि विरूपण साक्ष्य (रैखिक फ्लोरेसेंस वक्र) से।
  12. प्रत्येक FL-डीएनए मिश्रण के लिए नमूने की उपयुक्तता का विश्लेषण करने के लिए, हेक्स चैनल के सीक्यू मूल्यों की तुलना करें। यदि मूल्य 16 है, तो नमूनों के विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें। यदि मूल्य & 16 है या कोई सीक्यू नहीं है, तो एफएल-डीएनए स्पाइक की वितरण त्रुटि के कारण इसकी संभावना है। इसलिए नमूनों का विश्लेषण करना संभव नहीं है।
  13. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके सकारात्मक नियंत्रण के "हेक्स" चैनल में सीक्यू मूल्यों के औसत की गणना करें:
    Equation 3
  14. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके नमूना प्रतिकृति के "हेक्स" चैनल में सीक्यू मूल्यों के औसत की गणना करें:
    Equation 4
  15. निम्नलिखित सूत्र के अनुसार ‧CqHEX मानों की गणना करें:
    Equation 5
  16. तालिका 5में सूचित किए गए नमूनों के मूल्यों की तुलना करें।
  17. प्रत्येक मिश्रण (मिक्स ए और मिक्स बी) के लिए, तालिका 6 में रिपोर्ट किए गए लोगों के साथ एफएएम चैनल के सीक्यू मूल्यों की तुलना करें।
  18. प्रत्येक उपयुक्त नमूने के FL-डीएनए मूल्य को निर्धारित करने के लिए, शून्य के रूप में "कोई सीक्यू" मूल्यों को ध्यान में रखते हुए निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें:
    Equation 6
    Equation 2
    नोट: कोलोरेक्टल कैंसर जोखिम और व्यापकता Rengucci एट अल द्वारा प्राप्त Fagan nomogram परिणामों के अनुसार iFOBT और FL-डीएनए मूल्यांकनका एक समारोह है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का कार्यप्रवाह चित्र 1में दिखाया गया है । कार्यप्रवाह इन चरण परिणामों के अनुसार दो नियंत्रण चरण और विभिन्न कार्य प्रदान करता है। सबसे पहले, यदि कोई नमूना अनुपयुक्त नियंत्रण प्रस्तुत करता है, तो प्रवर्धन दोहराया जाना चाहिए। दूसरा, यदि प्रवर्धन बाधित है, तो नमूने को शुरुआत से फिर से संसाधित किया जाना चाहिए या मूल्यवान नहीं के रूप में वर्गीकृत किया जाना चाहिए।

चित्रा 2 सकारात्मक और नकारात्मक नमूनों द्वारा उत्पादित फ्लोरेसेंस घटता दिखाता है। (क)दिखाया गया एक उपयुक्त सकारात्मक नमूने का एक उदाहरण है। हेक्स चैनल पर नमूना संकेत स्वीकार्य सीमा के भीतर है। सकारात्मक संकेत FAM चैनल पर दहलीज से ऊपर है । (ख)दिखाया गया एक उपयुक्त नकारात्मक/सकारात्मक नमूने का एक उदाहरण नहीं है । नमूना संकेत हेक्स चैनल पर स्वीकार्य सीमा के भीतर है। नकारात्मक नियंत्रण संकेत FAM चैनल पर दहलीज से नीचे है । (ग)दिखाया गया है एक उपयुक्त नमूना नहीं का एक उदाहरण है । नमूना संकेत हेक्स चैनल पर स्वीकार्य सीमा के भीतर नहीं है; इस प्रकार, एक संभावित अवरोध ग्रहण किया जा सकता है। निष्कर्षण से शुरू होने वाले इस नमूने को दोहराया जाना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: FL-डीएनए क्वांटिफिकेशन के लिए वर्कफ्लो । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरेसेंस घटता मिक्स ए (या मिक्स बी) लक्ष्य जीन (चैनल FAM) और आंतरिक नियंत्रण (चैनल HEX) के प्रवर्धन दिखा। (क) एफएल-डीएनए पॉजिटिव सैंपल । (ख) एफएल-डीएनए निगेटिव सैंपल । (ग) नमूना प्रवर्धन का अवरोध। लाल वक्र: सकारात्मक नियंत्रण; हरा वक्र: नकारात्मक नियंत्रण; काला वक्र: नैदानिक नमूना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 एक्स
एक मानक 1 पानी डीएनए2 डीएनए4 डीएनए6 डीएनए8 डीएनए10 डीएनए12 डीएनए14 डीएनए16 डीएनए18 डीएनए20 1 FL-डीएनए मिक्स ए
बी मानक 1 पानी डीएनए2 डीएनए4 डीएनए6 डीएनए8 डीएनए10 डीएनए12 डीएनए14 डीएनए16 डीएनए18 डीएनए20 2 FL-डीएनए मिक्स बी
सी मानक 2 स्थिति डीएनए2 डीएनए4 डीएनए6 डीएनए8 डीएनए10 डीएनए12 डीएनए14 डीएनए16 डीएनए18 डीएनए20 3 FL-डीएनए मिक्स ए
D मानक 2 स्थिति डीएनए2 डीएनए4 डीएनए6 डीएनए8 डीएनए10 डीएनए12 डीएनए14 डीएनए16 डीएनए18 डीएनए20 4 FL-डीएनए मिक्स बी
ई मानक 3 डीएनए1 डीएनए3 डीएनए5 डीएनए7 डीएनए9 डीएनए11 डीएनए13 डीएनए15 डीएनए17 डीएनए19 डीएनए21 5 FL-डीएनए मिक्स ए
F मानक 3 डीएनए1 डीएनए3 डीएनए5 डीएनए7 डीएनए9 डीएनए11 डीएनए13 डीएनए15 डीएनए17 डीएनए19 डीएनए21 6 FL-डीएनए मिक्स बी
जी मानक 4 डीएनए1 डीएनए3 डीएनए5 डीएनए7 डीएनए9 डीएनए11 डीएनए13 डीएनए15 डीएनए17 डीएनए19 डीएनए21 7 FL-डीएनए मिक्स ए
एच मानक 4 डीएनए1 डीएनए3 डीएनए5 डीएनए7 डीएनए9 डीएनए11 डीएनए13 डीएनए15 डीएनए17 डीएनए19 डीएनए21 8 FL-डीएनए मिक्स बी

तालिका 1: नियंत्रण, वक्र और नमूनों के वितरण के साथ सेट-अप प्लेट। कॉलम एक्स पट्टी के शीर्ष पर अंकित संख्या को इंगित करता है।

चरण तापमान और समय
हॉट स्टार्ट (1 चक्र) 5 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस
प्रवर्धन (40 चक्र) 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस
15 एस के लिए 54 डिग्री सेल्सियस
45 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस (डेटा संग्रह)

तालिका 2: डीएनए प्रवर्धन के लिए थर्मल प्रोफाइल।

Table 3
तालिका 3: मानक वक्र की उपयुक्तता को सत्यापित करने के लिए मानकों के हेक्स और एफएएम चैनल मूल्यों की सीमा।

Table 4
तालिका 4: रन की उपयुक्तता को सत्यापित करने के लिए नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रणों के हेक्स और एफएएम चैनल मूल्यों की सीमा।

Table 5
तालिका 5: नमूना विश्लेषण की उपयुक्तता को सत्यापित करने के लिए नमूनों के हेक्स और एफएएम चैनल मूल्यों की सीमा।

Table 6
तालिका 6: एफएएम चैनल के मिक्स ए और मिक्स बी सीक्यू मूल्यएफएल-डीएनए विश्लेषण की उपयुक्तता को सत्यापित करने के लिए।

Table 7
तालिका 7: आईएफओबीटी और एफएल-डीएनए मूल्यों के एक समारोह के रूप में कैंसर जोखिम मूल्यांकन। आईएफओबीटी और एफएल-डीएनए मूल्यों के बीच संबंध के अनुसार, तालिका कोलोरेक्टल नियोप्लास्टिक घावों की संभावना का अनुमान लगाती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि मैनुअल और अर्ध - स्वचालित दृष्टिकोणों द्वारा निकाले गए मल का डीएनए अखंडता विश्लेषण कोलोरेक्टलघावों 7,8,9,109,,11,12का शीघ्र पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक उपकरण का प्रतिनिधित्व कर सकता है । कोलोरेक्टल कैंसर का पता लगाने के लिए वर्षों से आणविक, नॉनइनवेसिव स्क्रीनिंग परीक्षण विकसित किए गए हैं, लेकिन अन्य स्क्रीनिंग परीक्षणों की तुलना में समय लेने वाले दृष्टिकोणों और खराब लागत प्रभावशीलता के कारण इन तरीकों का व्यापक प्रसार सीमित है।

यह दृष्टिकोण अपेक्षाकृत सस्ता है और समय लेने वाला भी नहीं है। यह भी कुछ मैनुअल चरणों की आवश्यकता होती है एक नई प्रक्रिया के कारण कोलोरेक्टल घावों का पता लगाने में सटीकता में वृद्धि हुई है । यहां वर्णित दृष्टिकोण कम मैनुअल चरणों के साथ तेजी से है, और यह प्रति सप्ताह कई नमूनों पर आसानी से प्रदर्शन करने में सक्षम है। डीएनए निष्कर्षण विशेष मुद्दों को पेश नहीं करता है और आसान मैनुअल चरणों या एक स्वचालित उपकरण के उपयोग के माध्यम से किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध मामले में, स्वचालित डीएनए निष्कर्षण साधन निर्धारित करना आवश्यक है, जो सबसे प्रजनन योग्य परिणामों के लिए अनुमति देता है। डीएनए निष्कर्षण का सबसे महत्वपूर्ण कदम डीएनए निष्कर्षण से पहले मल और इसके भंडारण की विधि का संग्रह है। मल को जमे रहने और जितनी जल्दी हो सके निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ने की सलाह दी जाती है।

एक और महत्वपूर्ण मुद्दा प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं के संभावित अवरोधकों द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाता है। मल निष्कर्षण जीनोमिक डीएनए को शुद्ध करने में सक्षम नहीं है, क्योंकि अशुद्धियां सही प्रवर्धन प्रतिक्रिया से समझौता करती हैं। इस संबंध में, प्रोटोकॉल में प्रतिक्रिया अवरोधकों की उपस्थिति/अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए स्पाइक-इन डीएनए के उपयोग की आवश्यकता होती है ।

हाल ही में जब तक, मल मनोगत रक्त परीक्षण स्क्रीनिंग कार्यक्रमों में कोलोरेक्टल घावों का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाने वाला मुख्य दृष्टिकोण है; हालांकि, यह सटीकता के मामले में कुछ सीमाएं प्रस्तुत करता है। कोलोरेक्टल कैंसर के निदान के लिए एक वैकल्पिक रणनीति मल में उत्सर्जित एक्सफोलिएटेड कोशिकाओं से डीएनए के विश्लेषण पर आधारित है। पिछले एक साल में कई दृष्टिकोणों का मूल्यांकन किया गया है, लेकिन स्क्रीनिंग कार्यक्रमों में उपयोग के लिए कोई भी उपलब्ध नहीं है।

FL-डीएनए अखंडता मूल्य एक उपयोगी विकल्प है, जो मानक स्क्रीनिंग iFOBT परीक्षण मूल्य के साथ संयोजन में, ट्यूमर की उपस्थिति की भविष्यवाणी कर सकते है और/या उच्च जोखिम adenomas11,,12 द्वारा एक Fagan Nomogram दृष्टिकोण10 (तालिका 7)। यह दृष्टिकोण केवल उपयोग किए जाने वाले मानक दृष्टिकोण की तुलना में नैयोनिप्लास्टिक घाव उपस्थिति की संयुक्त परीक्षण संभावना का अनुमान लगाता है।

यह जानकारी एक उपयुक्त कोलोनोस्कोपी के अलावा नैदानिक परीक्षणों की योजना बनाने और इसकी निगरानी को निजीकृत करने में चिकित्सकों की मदद कर सकती है। दरअसल, FL-डीएनए किट मैनुअल चरणों को सरल बनाता है और स्थिर और सुसंगत परिणाम सुनिश्चित करता है। हालांकि, कुछ मुद्दों को विधि की नैदानिक सटीकता में सुधार करने के लिए स्पष्ट किया जाना बाकी है । उदाहरण के लिए, जिस आवृत्ति पर परीक्षण किए जाने चाहिए और प्रत्येक व्यक्ति के लिए विशिष्ट टाइमपॉइंट पर विश्लेषण करने की आवश्यकता वाले मल नमूनों की संख्या को सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए। यह देखते हुए कि इस परीक्षण को आईएफओबीटी के साथ मिलकर किया जाना चाहिए, एक विधि जिसके लिए हर 2 साल में संग्रह की आवश्यकता होती है, जैसा कि कई स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल में मानक है, वर्तमान स्क्रीनिंग परीक्षणों के प्रतिस्थापन या विकल्प के रूप में इस परीक्षण की प्रभावशीलता को सत्यापित करने के लिए आवश्यक है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

मौरा मेंघी डायटेक फार्माकोजेनेटिक्स एसआरएल की पूर्णकालिक कर्मचारी हैं।

Acknowledgments

लेखकों को कोई पावती नहीं है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Absolute Ethanol (quality of analytical degree) Reagent required for DNA extraction
Benchtop centrifuge  Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction
EasyPGX analysis software version 2.0.0 Diatech Pharmacogenetics RT800-SW Analysis software 
EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips Diatech Pharmacogenetics RT803 Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX qPCR instrument 96  Diatech Pharmacogenetics RT800-96 Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX ready FL-DNA Diatech Pharmacogenetics RT029 Kit required for the Real Time PCR assay
Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Powder-free disposable gloves Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
QIAamp Fast DNA Stool Qiagen 51604 Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool
Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Thermal block e.g. EasyPGX dry block Diatech Pharmacogenetics RT801 Instrument required for DNA extraction
Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml  Diatech Pharmacogenetics RT802 Instrument required for DNA extraction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
  2. Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
  3. SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2019).
  4. Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
  5. Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
  6. Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
  7. Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
  8. Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
  9. Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
  10. Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
  11. De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
  12. Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).

Tags

कैंसर रिसर्च इश्यू 160 स्टूल डीएनए इंटीग्रिटी कोलोरेक्टल कैंसर के घाव हाई रिस्क कोलोरेक्टल एडेनोमा डायग्नोस्टिक कोलोरेक्टल कैंसर मेथड क्यूपीसीआर एफएल-डीएनए आईएफओबीटी

Erratum

Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 09/28/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.

The first affiliation was updated from:

Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)

to:

Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

स्टूल डीएनए इंटीग्रिटी डिटेक्शन द्वारा कोलोरेक्टल कैंसर जोखिम और व्यापकता का मूल्यांकन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rengucci, C., De Maio, G., Menghi,… More

Rengucci, C., De Maio, G., Menghi, M., Benzi, F., Calistri, D. Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. J. Vis. Exp. (160), e59426, doi:10.3791/59426 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter