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Cancer Research

便DNA完全性検出による大腸癌リスクと罹患率の評価

Published: June 8, 2020 doi: 10.3791/59426
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 2Diatech Pharmacogenetics srl

ERRATUM NOTICE

Summary

提示された診断FL-DNAキットは、大腸癌病変の存在の信頼性の高い確率を決定するための時間を節約し、ユーザーフレンドリーな方法です。

Abstract

今日では、便DNAは、いくつかの方法で単離し、分析することができます。便中のDNAの長い断片は、前腫瘍性または腫瘍性大腸病変の存在の信頼性の高い確率を提供するqPCRアッセイによって検出することができる。この方法は、蛍光長いDNA(FL-DNA)と呼ばれ、一次予防システム上の改善である迅速で非侵襲的な手順です。この方法は、ゲノムDNAの特異的標的の定量増幅による、便DNA完全性の評価に基づいている。特に、200bpを超えるDNA断片の評価は、非常に高い特異性を有する大腸病変患者の検出を可能にする。しかし、このシステムおよび現在利用可能なすべての便DNA検査は、対処する必要があるいくつかの一般的な問題を提示する(例えば、検査を行う頻度と各個人の各時点で収集された便サンプルの最適な数)。しかし、FL-DNAの主な利点は、免疫化学ベースの便潜血症血液検査(iFOBT)として知られているCRCスクリーニングプログラムで現在使用されている試験と関連してそれを使用する可能性である。実際、両方のテストは、コストを削減し、大腸病変の最終的な存在のより良い予測を達成し、同じサンプルで実行することができます。

Introduction

大腸癌(CRC)は、健康な上皮がゆっくりと腺腫またはポリープに発達する多段階のプロセスから派生し、経時的に悪性癌に進行する11,2。2CRCの高い発生率にもかかわらず、過去10年間で死亡率の低下傾向が観察されました3.実際、スクリーニングプログラムで採用された早期診断ツールは、腫瘍前の腺腫またはポリープの早期発見と除去につながっている4.ただし、技術的な制限が異なるために、これらの方法のどれも最適ではありません。実際、感度と特異性を改善するために、多くの便DNA検査が単独で、または現在のルーチン診断検査55,66と組み合わせて提案されている。

典型的には、健康な粘膜は、アポトーシス大腸細胞の便流に流れ込むが、一方、病気の粘膜は非アポトーシス大腸細胞を剥離する。200bp以上の長さの断片は、非アポトーシスDNAを特徴付ける。このDNAは、ロングDNA(L-DNA)と呼ばれ、CRC早期診断に利用できるバイオマーカーとなっています。L-DNAは便標本から単離し、体外,診断FL-DNA,キット77、8、9、10、11、128,9を用いてqPCRによって定量することができる。10,1112

この試験は、138 bpから339 bpの範囲のFL-DNA断片の検出のための2つのアッセイから構成される。各アッセイは、FL-DNA(FAM)およびスパイクインDNA(HEX)の増幅を可能にします。すべての断片の最適な増幅を確実にするために、検定は2つのアッセイ("A"と"B"という名前)に分かれています。Aアッセイは、APC遺伝子のエキソン14の2つの領域(NM_001127511)とTP53遺伝子のエキソン7の断片(NM_001276760)を検出する。Bアッセイは、APC遺伝子のエキソン14(NM_001127511)と、TP53遺伝子のエキソン5および8の2つの領域(NM_001276760)の断片を検出する。アッセイは検出された領域を区別しない。スパイクインDNAは、オンコリンコスケタサケサケDNAに対応し、手順が適切に行われていることを検証し、偽陰性の結果をもたらす可能性のある阻害剤の存在をチェックすることができます。FL-DNA濃度は、標準曲線法を用いた絶対定量法で評価され、ng/反応として表されます。

FL-DNA法は、免疫化学的に基づく便潜血検査(iFOBT)と組み合わせて、現在CRCスクリーニングプログラムで使用されており、CRCおよび/または高リスク腺腫病変のより良い予測を可能にする非侵襲的で安価な便DNA検査である。

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Protocol

患者は、2013年から2015年の間にメルドラ(FC、イタリア)のロスタジオeラキュラデイ腫瘍(IRST)あたりイストティトゥエティフィティノロロで募集されました。登録された患者は、IRST - IRCCS AVRの倫理委員会によって承認されたプロトコルIRSTB002に入った(25/10/2012、ver.すべての方法は、関連するガイドラインと規制に従って行われました。書面によるインフォームド・コンセントは、すべての患者から得られました。

1. 便からのDNA抽出

  1. キットを使用して、スツールサンプルを準備します (「材料表」を参照)。メーカーの指示に従って抽出を行って、便の材料を選択し、治療します。精製したDNAを直接増幅するか、-20°Cで保存して、その後の分析を行います。

2. 陽性対照、標準、スパイクインDNA、臨床サンプルの調製

  1. 標準およびサンプルの作成
    1. 陽性対照、標準、スパイクインDNA、およびすべての臨床サンプルを調製するために、遠心分離機は陽性対照、標準、スパイクインDNAのアリコートを作成し、次に提供された水の正しい量を加えることによって各試薬を再中断する(下記参照)。次いで、陽性対照、標準、スパイクインDNAを慎重にボルテックスし、次いで遠心分離機を10sにします。乾燥試薬の完全な再懸濁液を達成するために、使用前に30分間室温(RT)で液体試薬を保管してください。
      1. 陽性の対照は、乾燥した形式のヒトDNAである。各アリコートを750μLの水で再中断します。
      2. スパイクインDNAはサケ(Oncorhynchusケタ)DNAであり、便から抽出されたDNAサンプル中の阻害剤の存在を検証するために外因性内部制御として使用される。各アリコートを100μLの水で再中断します。
    2. 標準曲線を調製するには、ストック溶液から始まる4つの1:5希釈液を生成する。標準ポイントは、10 ng/反応、2 ng/反応、0.4 ng/反応、および0.08 ng/反応でなければなりません。
  2. 1xスパイクインDNAの調製
    1. スパイクインDNAコントロールを直接使用する前に準備してください。
    2. FL-DNaスパイク5μLと滅菌水20μLを混合して、1xスパイクインDNAコントロールを準備します。1xスパイクインDNAコントロールサンプルの数は、分析するサンプルの数に加えて、陽性対照に従って調製されます。
  3. サンプルの調製
    1. 75 μLのサンプル(臨床サンプルまたは陽性対照)を25 μLの1xスパイクインDNAと混合し、合計体積100 μLを生成します。

qPCRイージーPGXを用いたFL-DNA値の増幅と決定

注:ヒトDNAと内部制御を標的とする特異的プライマーおよびプローブを含む完全な増幅混合物は、FL-DNAミックスAおよびFL-DNAミックスB.スタンダード、陽性および陰性対照、およびサンプルを両方の凍結乾燥混合物で増幅しなければならない8つのウェルストリップで凍結乾燥された形式で提供される。臨床サンプルは、両方の凍結乾燥した混合物との重複でのみ増幅されなければならない。

  1. qPCR 計測器およびオペレーティングソフトウェアの資料表を参照してください。
    1. オペレーティング ソフトウェアを開き、プレートと熱プロファイルを設定します。
      1. 表 1に示すようにプレートを設定します。
        1. 列 1 の 8 つの位置すべてに対して、井戸のタイプを標準として設定します。
        2. A2 ウェルと B2 ウェルの井戸タイプをNTCとして設定します。
        3. C2 と D2 の井戸の種類 (正のコントロール) を[不明]に設定します。
        4. その他のすべてのポジションの井戸タイプを不明に設定します。
        5. 96 ポジションをすべて選択し、色素FAMとHEXを追加します。[プレートの同期] をクリックします。
      2. 表 2に従って熱プロファイルを設定します。
    2. チューブの底に内容物をもたらすために10 sのためのストリップの必要数を遠心分離します。
    3. 内容物を保持するために注意を払いながら、ストリップからシールを静かに取り外し、それぞれのストリップに追加:負のコントロール:20 μLの水。サンプル:20μLのDNA。標準曲線:標準1、2、3、または4の20 μL。陽性制御:20μLの正のコントロール。
    4. 8ストリップの平らな光学キャップと渦を数秒間使用して、すべてのストリップを慎重に閉じます。
    5. 10 sのストリップを遠心分離し、機器にロードします。次に、実行を開始します。

4. データ分析

注: データ分析は、ソフトウェアに応じて自動的に、または手動で実行できます(資料表を参照)。

  1. 実行の最後に、列 A、C、E、G を選択し、"FAM: FL-DNA-A" および"HEX: IC"を選択し、列 B、 D、F、H の"FAM: FL-DNA-B" および"HEX: IC"を選択します。
  2. 標準数量開始量:A1およびB1ウェルの10ng/反応、C1およびD1の場合は2 ng/反応、E1とF1の場合は0.4 ng/反応、G1とH1の場合は0.08 ng/反応を設定します。
  3. FAM(FL-DNA AおよびFL-DNA B)およびHEX(IC)チャネルの両方で、蛍光閾値を150に設定します。
  4. [結果テーブル] ボックスで、[列オプション|すべて選択 |Okは、それぞれのCq(ΔR)とΔR最後の値で両方のチャンネルで結果を得るために。
    注: これらの値は、リアルタイム PCR 計測器ソフトウェアによって提供されます。ΔRは最後の増幅サイクルに正規化された蛍光値に対応する。
  5. [結果テーブル] ボックスでテーブルを右クリックしてコンテキスト メニューを開き、[Excel に送信] をクリックして生データをエクスポートします。
  6. 標準の値を確認して、標準曲線の適合性を確認します。
  7. FL-DNAミックスごとに、R2[R²(ΔR)]列と効率[効率(%)]を確認してください。2] 列の値。許容範囲内であれば、製造元の指示に応じて分析を進めることが可能です (表3)。
  8. FAMチャンネルの結果が期待される範囲にない場合は、標準曲線の1点を省略し、実行を再分析します。
  9. 「Cqなし」の値をゼロと見なして、次の式で負と正のコントロールの値を決定します。
    Equation 1
    Equation 2
  10. 取得した値を、表 4で報告された値と比較します。
  11. 反応制御が期待値の範囲内にある場合は、サンプルの分析を進めます。
    注: 得られた Cq 値が、実際の増幅反応 (シグモイド蛍光曲線) から生成され、アーティファクト (線形蛍光曲線) から生成されないことを確認します。
  12. FL-DNAミックスごとのサンプルの適合性を分析するには、HEXチャネルのCq値を比較します。値が ≥16 の場合は、サンプルの分析を続行します。値が <16 であるか、Cq がない場合は、FL-DNA スパイクのディスペンシング エラーが原因である可能性があります。そのため、サンプルを分析することはできません。
  13. 次の式を使用して、正のコントロールの「HEX」チャネルの Cq 値の平均を計算します。
    Equation 3
  14. 次の式を使用して、サンプルの複製の「HEX」チャネルのCq値の平均を計算します。
    Equation 4
  15. 以下の式に従って、[CqHEX]の値を計算します。
    Equation 5
  16. サンプルのΔCqHEX値と表5に記載されているものを比較してください。
  17. 各ミックス(ミックスAとミックスB)について、FAMチャンネルのCq値と表6に示された値を比較します。
  18. 適切な各サンプルのFL-DNA値を決定するには、以下の式を使用して、「Cqなし」の値をゼロと考えます。
    Equation 6
    Equation 2
    注:大腸癌リスクおよび有病率は、Rengucciらが得たFaganノモグラム結果によるiFOBTおよびFL-DNA評価の関数である(表7)。

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Representative Results

このプロトコルのワークフローを図 1に示します。ワークフローには、2 つの制御ステップと、これらのステップの結果に応じた異なるアクションが用意されています。まず、サンプルが不適切なコントロールを提示する場合、増幅を繰り返す必要があります。第二に、増幅が阻害された場合、サンプルは最初から再処理されるか、または価値がないものとして分類されなければならない。

図2は、陽性および陰性サンプルによって生成される蛍光曲線を示す。(A)図示は、適切な陽性サンプルの一例である。HEXチャンネルのサンプル信号は許容範囲内です。正の信号が FAM チャネルのしきい値を超えています。(B)示されているのは、適切な陰性/陽性でないサンプルの一例である。サンプル信号は、HEXチャネル上で許容範囲内にあります。負の制御信号が FAM チャネルのしきい値を下回っています。(C)図示は、不適切なサンプルの一例である。サンプル信号がHEXチャンネルで許容範囲内にありません。したがって、潜在的な阻害が想定され得る。このサンプルは、抽出から始めて繰り返す必要があります。

Figure 1
図1:FL-DNA定量のワークフローこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:ミックスA(またはミックスB)標的遺伝子(チャネルFAM)および内部制御(チャネルHEX)の増幅を示す蛍光曲線。(A)FL-DNA陽性試料。(B) FL-DNA陰性試料。(C)サンプル増幅の抑制。赤い曲線:正のコントロール;緑の曲線: 負のコントロール;黒いカーブ:臨床サンプル。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 X
A 標準 1 水 DNA2 DNA4 DNA6 DNA8 DNA10 DNA12 DNA14 DNA16 DNA18 DNA20 1 FL-DNAミックスA
B 標準 1 水 DNA2 DNA4 DNA6 DNA8 DNA10 DNA12 DNA14 DNA16 DNA18 DNA20 2 FL-DNAミックスB
C スタンダード2 Pos DNA2 DNA4 DNA6 DNA8 DNA10 DNA12 DNA14 DNA16 DNA18 DNA20 3 FL-DNAミックスA
D スタンダード2 Pos DNA2 DNA4 DNA6 DNA8 DNA10 DNA12 DNA14 DNA16 DNA18 DNA20 4 FL-DNAミックスB
E スタンダード3 DNA1 DNA3 DNA5 DNA7 DNA9 DNA11 DNA13 DNA15 DNA17 DNA19 DNA21 5 FL-DNAミックスA
F スタンダード3 DNA1 DNA3 DNA5 DNA7 DNA9 DNA11 DNA13 DNA15 DNA17 DNA19 DNA21 6 FL-DNAミックスB
G スタンダード4 DNA1 DNA3 DNA5 DNA7 DNA9 DNA11 DNA13 DNA15 DNA17 DNA19 DNA21 7 FL-DNAミックスA
H スタンダード4 DNA1 DNA3 DNA5 DNA7 DNA9 DNA11 DNA13 DNA15 DNA17 DNA19 DNA21 8 FL-DNAミックスB

表1:制御、曲線、サンプルの分布を備えたプレートを設定します。列 X は、ストリップの上部に刻印された番号を示します。

ステップ 温度と時間
ホットスタート(1サイクル) 95°C 5分間
増幅(40サイクル) 95°C 15s
54°C 15s
60 °C(45s)(データ収集)

表2:DNA増幅のための熱プロファイル。

Table 3
表3:標準曲線の適合性を検証するための規格のHEXおよびFAMチャネル値の範囲。

Table 4
表4:負と正の制御のHEXおよびFAMチャンネル値の範囲で、走行の適合性を検証する。

Table 5
表5:サンプル分析の適合性を検証するためのサンプルのHEXおよびFAMチャネル値の範囲。

Table 6
表6:FAMチャネルのAとミックスBCq値を混合して、FL-DNA分析の適合性を検証する。

Table 7
表7:iFOBTおよびFL-DNA値の機能としての癌リスク評価iFOBTとFL-DNA値の関係に応じて、表は大腸新生物病変の確率を推定する。

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Discussion

これまでの研究では、手動および半自動アプローチによって抽出された便のDNA完全性分析は、大腸病,,,変7、8、9、10、11、128,9の早期発見のための代替ツールを表すことができることが実証されている。7101112分子的、非侵襲的なスクリーニング検査は、大腸癌の検出のために長年にわたって開発されてきたが、これらの方法の普及は、他のスクリーニング検査と比較して時間のかかるアプローチとコスト効率の悪さのために限られている。

このアプローチは比較的安価で、時間がかかりすぎない。また、手動での手順をほとんど必要とせず、新しい手順のために大腸病変を検出する精度が向上しました。ここで説明するアプローチは、手動の手順が少なく高速であり、週に多くのサンプルで簡単に実行できます。DNA抽出は特定の問題を提示せず、簡単な手動ステップまたは自動機器の使用によって行うことができます。後者の場合、自動DNA抽出装置を決定する必要があり、最も再現性の高い結果を得ることができます。DNA抽出の最も重要なステップは、DNA抽出前の便の収集と貯蔵方法です。スツールを凍結し、できるだけ早く抽出を進めておくことをお勧めします。

もう一つの重大な問題は、増幅反応の可能な阻害剤によって表される。この便抽出はゲノムDNAを精製することができないため、不純物は正しい増幅反応を損なう。この点に関して、このプロトコルは、反応阻害剤の有無を検証するためのスパイクインDNAの使用を必要とする。

最近まで、便潜血検査はスクリーニングプログラムで大腸病変を検出するために使用される主なアプローチである。しかし、それは精度の面でいくつかの制限を提示します。大腸癌の診断のための代替戦略は、便中に排泄された剥離細胞からのDNAの分析に基づいています。過去1年間にいくつかのアプローチが評価されましたが、スクリーニングプログラムでは使用できません。

FL-DNA完全性値は、標準的なスクリーニングiFOBT試験値と組み合わせて、Fagan Nomogramアプローチ10によって腫瘍および/または高リスク腺腫11、12,12の存在を予測することができる有用な代替手段であり得る(表7)。このアプローチは、腫瘍性病変存在の組み合わせ試験確率を推定し、単独で使用される標準的なアプローチと比較して診断精度を向上させる。

この情報は、適切な大腸内視鏡検査とその監視のパーソナライズに加えて、診断テストを計画する臨床医に役立つ可能性があります。実際、FL-DNAキットは手動ステップを簡素化し、安定した一貫した結果を保障する。しかし、メソッドの診断精度を向上させるために、いくつかの問題が明確に残っています。たとえば、テストを実行する頻度や、各個人の特定のタイムポイントで分析する必要がある便サンプルの数は慎重に選択する必要があります。この試験はiFOBTと同時に行わなければならないことを考えると、多数のスクリーニングプロトコルで標準的であるように、2年ごとに収集を必要とする方法は、現在のスクリーニング試験の代替または代替としてこの試験の有効性を検証するために必要である。

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Disclosures

マウラ・メンギはディアテック薬理学s srlの正社員です。

Acknowledgments

著者は謝辞を持っていません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Absolute Ethanol (quality of analytical degree) Reagent required for DNA extraction
Benchtop centrifuge  Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction
EasyPGX analysis software version 2.0.0 Diatech Pharmacogenetics RT800-SW Analysis software 
EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips Diatech Pharmacogenetics RT803 Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX qPCR instrument 96  Diatech Pharmacogenetics RT800-96 Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX ready FL-DNA Diatech Pharmacogenetics RT029 Kit required for the Real Time PCR assay
Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Powder-free disposable gloves Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
QIAamp Fast DNA Stool Qiagen 51604 Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool
Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Thermal block e.g. EasyPGX dry block Diatech Pharmacogenetics RT801 Instrument required for DNA extraction
Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml  Diatech Pharmacogenetics RT802 Instrument required for DNA extraction

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References

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Tags

癌研究、問題160、便DNA完全性、大腸癌病変、高リスク大腸腺腫、診断大腸癌法、qPCR、FL-DNA、iFOBT

Erratum

Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 09/28/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.

The first affiliation was updated from:

Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)

to:

Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

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Rengucci, C., De Maio, G., Menghi, M., Benzi, F., Calistri, D. Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. J. Vis. Exp. (160), e59426, doi:10.3791/59426 (2020).

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