Utvärdering av kolorektal cancer risk och prevalens av avföring DNA Integrity Detection

Summary

Den presenterade diagnostiska FL-DNA kit är en tidsbesparande och användarvänlig metod för att bestämma den tillförlitliga sannolikheten för förekomsten av kolorektal cancer skador.

Abstract

Numera kan avförings-DNA isoleras och analyseras med flera metoder. De långa fragmenten av DNA i avföringen kan detekteras genom en qPCR-analys, vilket ger en tillförlitlig sannolikhet för närvaron av pre-neoplastiska eller neoplastiska kolorektal lesioner. Denna metod, som kallas fluorescens lång DNA (FL-DNA), är en snabb, icke-invasiv förfarande som är en förbättring av det primära förebyggande systemet. Denna metod bygger på utvärdering av fekal DNA-integritet genom kvantitativ förstärkning av specifika mål för genomiskt DNA. I synnerhet gör utvärderingen av DNA-fragment längre än 200 bp för detektering av patienter med kolorektal skador med mycket hög specificitet. Detta system och alla tillgängliga avförings-DNA-tester uppvisar dock några allmänna frågor som måste åtgärdas (t.ex. hur ofta tester bör utföras och optimalt antal avföringsprover som samlas in vid varje tidpunkt för varje individ). Den största fördelen med FL-DNA är dock möjligheten att använda det i samband med ett test som för närvarande används i CRC screening program, känd som immunokemiska-baserade fekal ockulta blodprov (iFOBT). Faktum är att båda testerna kan utföras på samma prov, minska kostnaderna och uppnå en bättre förutsägelse av den eventuella förekomsten av kolorektal skador.

Introduction

Kolorektal cancer (CRC) härrör från en flerstegsprocess där friska epitel långsamt utvecklas till adenom eller polyper, som utvecklas till maligna carcinom över tiden^1,2. Trots CRC: s höga incidens, en nedåtgående trend i andelen dödsfall har observerats under det senaste decenniet³. Faktum är att tidiga diagnostiska verktyg som antagits i screening program har lett till tidig upptäckt och avlägsnande av pre-neoplastiska adenom eller polyper⁴. På grund av de olika tekniska gränserna är dock ingen av dessa metoder optimal. För att förbättra känsligheten och specificiteten har många avförings-DNA-tester föreslagits ensamma eller i kombination med aktuella rutinmässiga diagnostiska tester^5,,6.

Typiskt, friska slemhinnan skjul i fekal ström apoptotiska kolonocyter, medan sjuka slemhinnan exfolierar icke-apoptotiska kolonocyter. Fragment av 200 bp eller mer i längd karakterisera icke-apoptotiska DNA. Detta DNA kallas lång DNA (L-DNA) och har blivit en utilizable biomarkör för CRC tidig diagnos. L-DNA kan isoleras från avföringsprovet och kvantifieras genom qPCR med hjälp av ett in vitro-diagnostiskt FL-DNA-kit^{7,,8,,9,,10,,11,12}.

Testet består av två analyser för detektion av FL-DNA-fragment från 138 bp till 339 bp. Varje analys möjliggör förstärkning av FL-DNA (FAM) samt spike-in DNA (HEX). För att säkerställa optimal förstärkning av alla fragment har testet delats upp i två analyser (med namnet "A" och "B"). A-analysen detekterar två regioner av exon 14 av APC genen (NM_001127511) och ett fragment av exon 7 av TP53 genen (NM_001276760). B-analysen detekterar ett fragment av exon 14 av APC genen (NM_001127511) och två regioner av exons 5 och 8 av TP53 genen (NM_001276760). Analyserna skiljer inte mellan de regioner som upptäckts. Det instämda DNA:n motsvarar Oncorhynchus keta lax-DNA och möjliggör kontroll av att förfarandet har gjorts på rätt sätt och kontrollerar eventuell förekomst av hämmare, vilket kan ge falska negativa resultat. FL-DNA-koncentrationen utvärderas med absolut kvantifiering med hjälp av standardkurvan och uttrycks som ng/reaktion.

FL-DNA-metoden är ett icke-invasivt och billigt avförings-DNA-test som i kombination med det immunokemiska fekala ockulta blodprovet (iFOBT) för närvarande används i CRC-screeningprogram och möjliggör bättre förutsägelser av CRC och/eller högriskadenomlesioner¹².

Protocol

Patienterna rekryterades till Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) i Meldola (FC, Italien) mellan 2013 och 2015. Inskrivna patienter var i protokoll IRSTB002, godkänd av etikkommittén för IRST - IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). Alla metoder har utförts i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter.

1. DNA-extraktion från avföring

1. Använd ett kit för att förbereda avföringsprover (se Tabell över material).) Välj och behandla fekala materialet genom att utföra extraktionen enligt tillverkarens anvisningar. Förstärk det renade DNA:t direkt eller förvara det vid -20 °C för efterföljande analys.

2. Beredning av positiv kontroll, standarder, spike-in DNA och kliniska prover

1. Beredning av standarder och prover
   1. För att förbereda den positiva kontrollen, standarder, spike-in DNA, och alla kliniska prover, centrifug en aliquot av positiv kontroll, standarder, och spike-in DNA, sedan återsuspendera varje reagens genom att lägga till rätt mängd medföljande vatten (se nedan). Sedan, försiktigt virvel den positiva kontrollen, standard och spike-in DNA, sedan centrifug för 10 s. För att uppnå en fullständig resuspension av de torra reagenserna, förvara vätskereagenserna i rumstemperatur (RT) i 30 min före användning.
      1. Den positiva kontrollen är mänskligt DNA i ett torrt format. Resuspend varje alikvot med 750 μL vatten.
      2. Spike-in DNA är lax (Oncorhynchus keta) DNA, som används som en exogen intern kontroll för att kontrollera eventuell förekomst av hämmare i DNA-prover som utvinns ur avföring. Resuspend varje alikvot med 100 μL vatten.
   2. För att förbereda standardkurvan, producera fyra 1:5 utspädningar från stamlösningen. Standardpunkterna måste vara 10 ng/reaktion, 2 ng/reaktion, 0,4 ng/reaktion och 0,08 ng/reaktion.
2. Beredning av 1x spike-in DNA
   1. Förbered spike-in DNA-kontrollen direkt före användning.
   2. Förbered 1x spike-in DNA-kontrollen genom att blanda 5 μl FL-DNa spike med 20 μL sterilt vatten. Antalet 1x spike-in DNA-kontrollprover kommer att beredas enligt antalet prover som ska analyseras, plus den positiva kontrollen.
3. Beredning av prover
   1. Blanda 75 μL av proverna (kliniska prover eller positiv kontroll) med 25 μL 1x spike-in DNA, vilket ger en total volym på 100 μL.

3. Förstärkning och bestämning av FL-DNA-värdet med qPCR Easy PGX

OBS: Kompletta amplifieringsblandningar som innehåller specifika grundfärger och sonder som riktar sig mot det mänskliga DNA:et och den interna kontrollen tillhandahålls i ett frystorkat format i 8 brunnsremsor för FL-DNA Mix A och FL-DNA Mix B. Standarder, positiva och negativa kontroller, och proverna måste förstärkas med båda frystorkade blandningar. Endast kliniska prover får förstärkas i två exemplar med båda frystorkade blandningar.

1. Se tabellen över material för qPCR-instrument och operativsystem.
   1. Öppna operativsystemet och ställ in skylten och värmeprofilen:
      1. Ställ in plattan enligt tabell 1.
         1. Ange brunnstypen för alla åtta positionerna i kolumn 1 som standard.
         2. Ställ in brunnstypen för A2- och B2-brunnarna som NTC.
         3. Ange brunnstypen för C2 och D2 (de positiva kontrollerna) som Okänd.
         4. Ange brunnstypen för alla andra positioner som Okänd.
         5. Välj alla 96 positioner och lägg till Dyes FAM och HEX. Klicka på Synkroniseringsplatta.
      2. Ställ in värmeprofilen enligt tabell 2.
   2. Centrifugera det nödvändiga antalet remsor för 10 s för att få innehållet till botten av röret.
   3. Ta försiktigt bort tätningarna från remsorna, samtidigt som du är uppmärksam på att behålla innehållet, och tillsätt till respektive remsor: negativ kontroll: 20 μL vatten; Prov: 20 μl DNA. Standardkurva: 20 μl standard 1, 2, 3 eller 4. positiv kontroll: 20 μl positiv kontroll.
   4. Stäng försiktigt alla remsor med 8 band platta optiska lock och virvel i några sekunder.
   5. Centrifugera remsorna i 10 s och lasta in dem i instrumentet. Starta sedan körningen.

4. Dataanalys

Dataanalys kan utföras automatiskt eller manuellt beroende på programvaran (se Materialförteckningen).

1. I slutet av körningen väljer du kolumnerna A, C, E, G för "FAM: FL-DNA-A" och "HEX: IC"och kolumnerna B, D, F, H för "FAM: FL-DNA-B" och "HEX: IC".
2. Ställ in följande för standardkvantiteterna Startbelopp:10 ng/reaktion för A1- och B1-brunnar, 2 ng/reaktion för C1 och D1, 0,4 ng/reaktion för E1 och F1 och 0,08 ng/reaktion för G1 och H1.
3. Ange tröskelfluorescensvärden till 150 för både FAM-kanaler (FL-DNA A och FL-DNA B) och HEX (IC).
4. Klicka på Result Table Kolumnalternativ | Välj Alla | Ok för att hämta resultaten i båda kanalerna med sina respektive Cq (∆R) och ∆R sista värden.
   Dessa värden levereras av PCR-instrumentprogramvaran i realtid. ΔR sist motsvarar fluorescensvärdet som normaliserats till den senaste förstärkningscykeln.
5. Högerklicka på tabellen i rutan Resultattabell för att öppna snabbmenyn och klicka på Skicka till Excel för att exportera rådata.
6. Kontrollera standardernas värden för att kontrollera standardkurvans lämplighet.
7. För varje FL-DNA-blandning, kontrollera kolumnen R² ["R² (∆R)" och effektivitet ["Effektivitet (%)" kolumn]-värden. Om de befinner sig inom ett godtagbart intervall är det möjligt att fortsätta med analysen i enlighet med tillverkarens anvisningar (tabell 3).
8. Om resultaten av FAM-kanalen inte ligger i det förväntade intervallet utelämnar du en punkt i standardkurvan och analyserar körningen igen.
9. Bestäm värdena för de negativa och positiva kontrollerna med följande formel, med tanke på "No Cq"-värdena som noll:
   
   
10. Jämför de erhållna värdena med de värden som rapporteras i tabell 4.
11. Om reaktionskontrollerna ligger inom intervallet för förväntade värden, fortsätt med analysen av proverna.
    OBS: Kontrollera att de Cq-värden som erhålls genereras från en verklig förstärkningsreaktion (sigmoidal fluorescenskurva) och inte från en artefakt (linjär fluorescenskurva).
12. Om du vill analysera provets lämplighet för varje FL-DNA-blandning jämför du Cq-värdena för HEX-kanalen. Om värdet är ≥16, fortsätt med analysen av proverna. Om värdet är <16 eller om det inte finns någon Cq beror det sannolikt på ett dispenseringsfel i FL-DNA Spike. Därför är det inte möjligt att analysera proverna.
13. Beräkna medelvärdet av Cq-värdena i den positiva kontrollens "HEX"-kanal med hjälp av följande formel:
    
14. Beräkna medelvärdet av Cq-värdena i provets "HEX"-kanal med hjälp av följande formel:
    
15. Beräkna ∆CqHEX-värdena enligt följande formel:
    
16. Jämför ∆CqHEX-värdena för proverna med de som rapporteras i tabell 5.
17. Jämför FAM-kanalens Cq-värden för varje blandning (Mix A och Mix B) med de som rapporteras i tabell 6.
18. För att bestämma FL-DNA-värdet för varje lämpligt prov, använd följande formel, med tanke på "No Cq"-värdena som noll:
    
    
    OBS: Risk och prevalens för kolorektal cancer är en funktion av iFOBT- och FL-DNA-utvärderingar enligt Fagan nomogram-resultaten från Rengucci et al.¹² (tabell 7).

Representative Results

Arbetsflödet för detta protokoll visas i figur 1. Arbetsflödet innehåller två kontrollsteg och olika åtgärder enligt dessa stegresultat. Om ett prov visar olämpliga kontroller måste förstärkningen upprepas. För det andra, om förstärkningen hämmas, måste provet upparbetas från början eller klassificeras som inte värdefullt.

Figur 2 visar fluorescenskurvorna som produceras av positiva och negativa prover. (A) Visas är ett exempel på ett lämpligt positivt prov. Provsignalen på HEX-kanalen ligger inom det acceptabla intervallet. Den positiva signalen ligger över tröskelvärdet på FAM-kanalen. (B)Visas är ett exempel på ett lämpligt negativt/inte positivt prov. Provsignalen ligger inom det acceptabla intervallet på HEX-kanalen. Den negativa kontrollsignalen ligger under tröskelvärdet på FAM-kanalen. (C)Visas är ett exempel på ett icke-lämpligt prov. Provsignalen ligger inte inom det godtagbara intervallet på HEX-kanalen. således kan en potentiell hämning antas. Detta prov måste upprepas med början från extraktionen.

Figur 1: Arbetsflöde för FL-DNA kvantifiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Fluorescenskurvor som visar förstärkning av målgener (mix A) (eller mix B) (kanal FAM) och intern kontroll (kanal HEX). (A) FL-DNA-positivt prov. B) Negativt FL-DNA-prov. (C) Hämning av provförstärkning. Röd kurva: positiv kontroll; grön kurva: negativ kontroll; svart kurva: kliniskt prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

X

A

Standard 1

Vatten

DNA2 (PÅ)

DNA4 (PÅ)

DNA6 (PÅ)

DNA8 (PÅ)

DNA10 (PÅ)

DNA12 (PÅ)

DNA14 (på andra)

DNA16 (PÅ)

DNA18 (PÅ)

DNA20

1

FL-DNA Mix A

B

Standard 1

Vatten

DNA2 (PÅ)

DNA4 (PÅ)

DNA6 (PÅ)

DNA8 (PÅ)

DNA10 (PÅ)

DNA12 (PÅ)

DNA14 (på andra)

DNA16 (PÅ)

DNA18 (PÅ)

DNA20

2

FL-DNA Blandning B

C

Standard 2

Pos

DNA2 (PÅ)

DNA4 (PÅ)

DNA6 (PÅ)

DNA8 (PÅ)

DNA10 (PÅ)

DNA12 (PÅ)

DNA14 (på andra)

DNA16 (PÅ)

DNA18 (PÅ)

DNA20

3

FL-DNA Mix A

D

Standard 2

Pos

DNA2 (PÅ)

DNA4 (PÅ)

DNA6 (PÅ)

DNA8 (PÅ)

DNA10 (PÅ)

DNA12 (PÅ)

DNA14 (på andra)

DNA16 (PÅ)

DNA18 (PÅ)

DNA20

4

FL-DNA Blandning B

ᵉ

Standard 3

DNA1 (PÅ)

DNA3 (PÅ)

DNA5 (PÅ)

DNA7 (PÅ)

DNA9 (PÅ)

DNA11 (PÅ)

DNA13 (PÅ)

DNA15 (PÅ)

DNA17 (PÅ)

DNA19

DNA21 (PÅ ANDRA)

5

FL-DNA Mix A

F

Standard 3

DNA1 (PÅ)

DNA3 (PÅ)

DNA5 (PÅ)

DNA7 (PÅ)

DNA9 (PÅ)

DNA11 (PÅ)

DNA13 (PÅ)

DNA15 (PÅ)

DNA17 (PÅ)

DNA19

DNA21 (PÅ ANDRA)

6

FL-DNA Blandning B

G

Standard 4

DNA1 (PÅ)

DNA3 (PÅ)

DNA5 (PÅ)

DNA7 (PÅ)

DNA9 (PÅ)

DNA11 (PÅ)

DNA13 (PÅ)

DNA15 (PÅ)

DNA17 (PÅ)

DNA19

DNA21 (PÅ ANDRA)

7

FL-DNA Mix A

H

Standard 4

DNA1 (PÅ)

DNA3 (PÅ)

DNA5 (PÅ)

DNA7 (PÅ)

DNA9 (PÅ)

DNA11 (PÅ)

DNA13 (PÅ)

DNA15 (PÅ)

DNA17 (PÅ)

DNA19

DNA21 (PÅ ANDRA)

8

FL-DNA Blandning B

Tabell 1: Ställplåt med fördelning av kontroll, kurva och prover. Kolumn X anger det nummer som är märkt på remsans ovankant.

Steg	Temperatur och tid
Varmstart (1 cykel)	95 °C i 5 min
Förstärkning (40 cykler)	95 °C för 15 s 54 °C för 15 s 60 °C för 45 s (Datainsamling)

Tabell 2: Termisk profil för DNA-förstärkning.

Tabell 3: Standardernas intervall för HEX- och FAM-kanalvärden för att kontrollera standardkurvans lämplighet.

Tabell 4: Intervall för HEX- och FAM-kanalvärden för negativa och positiva kontroller för att kontrollera körningens lämplighet.

Tabell 5: Provernas intervall för HEX- och FAM-kanalvärden för att kontrollera provanalysens lämplighet.

Tabell 6: Blanda A- och Mix B Cq-värden på FAM-kanalen för att kontrollera att FL-DNA-analysen är lämplig.

Tabell 7: Cancerriskutvärdering som en funktion av iFOBT- och FL-DNA-värden. Enligt förhållandet mellan iFOBT och FL-DNA värden, tabellen uppskattar sannolikheten för kolorektal neoplastiska skador.

Discussion

Tidigare studier har visat att DNA-integritetsanalys av avföring som extraherats genom manuella och halvautomatiska metoder kan utgöra ett alternativt verktyg för tidig upptäckt av kolorektal lesioner^{7,,8,,9,10,11,12}. Molekylära, noninvasive screening tester har utvecklats under åren för att upptäcka kolorektal cancer, men den utbredda spridningen av dessa metoder är begränsad på grund av tidskrävande metoder och dålig kostnadseffektivitet jämfört med andra screeningtester.

Detta tillvägagångssätt är relativt billigt och inte alltför tidskrävande. Det har också ökad noggrannhet i att upptäcka kolorektal skador på grund av ett nytt förfarande som kräver några manuella steg. Den metod som beskrivs här är snabb med färre manuella steg, och det kan enkelt utföras på många prover per vecka. DNA-extraktionen ger inga särskilda problem och kan utföras genom enkla manuella steg eller användning av ett automatiskt instrument. I det senare fallet är det nödvändigt att bestämma det automatiska DNA-extraktionsinstrumentet, vilket möjliggör de mest reproducerbara resultaten. Det mest kritiska steget i DNA-extraktion är insamling av avföring och metod för dess lagring före DNA-extraktion. Det är lämpligt att hålla avföringen frusen och fortsätta med extraktion så snart som möjligt.

En annan kritisk fråga representeras av möjliga hämmare av förstärkningsreaktionerna. Fekalextraktionen kan inte rena det genomiska DNA:et, eftersom föroreningar äventyrar den korrekta förstärkningsreaktionen. I detta avseende kräver protokollet användning av spike-in DNA för att kontrollera förekomsten /frånvaron av reaktionshämmare.

Tills nyligen är det fekala ockulta blodprovet den huvudsakliga metoden som används för att upptäcka kolorektal lesioner i screeningprogram; även om det innehåller vissa gränser när det gäller noggrannhet. En alternativ strategi för diagnos av kolorektal cancer bygger på analys av DNA från exfolierade celler utsöndras i avföring. Flera metoder har utvärderats under det senaste året, men ingen är tillgängliga för användning i screening program.

FL-DNA-integritetsvärdet kan vara ett användbart alternativ, som i kombination med standardscreening iFOBT testvärde, kan förutsäga förekomsten av tumörer och/eller högriskadenom^11,12 av en Fagan Nomogram-metod¹⁰ (Tabell 7). Detta tillvägagångssätt uppskattar den kombinerade testsannolikheten för neoplastisk lesion närvaro, förbättra diagnostisk noggrannhet jämfört med standardmetoden som används ensam.

Denna information kan hjälpa kliniker att planera diagnostiska tester utöver en lämplig koloskopi och anpassa dess övervakning. FL-DNA-kitet förenklar de manuella stegen och säkerställer stabila och konsekventa resultat. Vissa frågor återstår dock att klargöra för att förbättra metodens diagnostiska noggrannhet. Till exempel bör den frekvens vid vilken testerna ska utföras och antalet avföringsprover som måste analyseras vid specifika tidpunkter för varje individ väljas noggrant. Med tanke på att detta test måste utföras samtidigt med iFOBT är en metod som kräver insamling vartannat år, vilket är standard i ett stort antal screeningprotokoll, nödvändig för att kontrollera testets effektivitet som ersättning eller alternativ till de aktuella screeningtesterna.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free)			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Absolute Ethanol (quality of analytical degree)			Reagent required for DNA extraction
Benchtop centrifuge			Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction
EasyPGX analysis software version 2.0.0	Diatech Pharmacogenetics	RT800-SW	Analysis software
EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips	Diatech Pharmacogenetics	RT803	Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX qPCR instrument 96	Diatech Pharmacogenetics	RT800-96	Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX ready FL-DNA	Diatech Pharmacogenetics	RT029	Kit required for the Real Time PCR assay
Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL)			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Powder-free disposable gloves			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
QIAamp Fast DNA Stool	Qiagen	51604	Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool
Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL)			Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Thermal block e.g. EasyPGX dry block	Diatech Pharmacogenetics	RT801	Instrument required for DNA extraction
Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml	Diatech Pharmacogenetics	RT802	Instrument required for DNA extraction