Summary
이 프로토콜은 생체 뇌 슬라이스에서 광유전학 자극을 사용하여 먼 뇌 영역에서 장거리 입력의 세포 유형 특정 기능적 연결을 식별하는 일련의 방법을 설명합니다.
Abstract
세포 형 특정 시냅스 연결의 지식은 뇌 전체 신경 회로를 이해하기위한 중요한 전제 조건입니다. 장거리 연결의 기능적 조사는 확인된 먼 입력의 특정 자극과 결합된 단 하나 뉴런의 표적으로 한 기록을 요구합니다. 이것은 종종 기존의 전기 자극 기술로 달성하기 어렵다, 수렴 에서 축색은 상류 뇌 영역을 혼합 할 수 있기 때문에 대상 영역에서 혼합 할 수 있습니다. 빛에 민감한 이온 채널의 바이러스 매개 표현을 위한 특정 뇌 영역의 입체 적 표적화는 빛으로 그 지역에서 유래 된 축전의 선택적 자극을 허용합니다. Intracerebral 입체 전염 주사는 두뇌를 통하여 그밖 피질 또는 피질 지역 이외에 전방 thalamic 핵과 같은 잘 분리된 구조물에서 이용될 수 있습니다.
여기서 설명된 것은 마우스 뇌에서 채널로도셉신을 발현하는 바이러스 벡터의 정확한 입체주입을 위한 기술세트이며, 이어서 뇌 슬라이스 제제에서 축사 말단의 광자극이 뒤따른다. 이러한 프로토콜은 간단하고 광범위하게 적용 가능합니다. 세포 내 로 연결된 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록과 결합하여 축삭의 광자극은 기능적 시냅스 연결, 약리학적 특성 및 강도 평가를 감지 할 수 있습니다. 또한, 기록된 뉴런의 바이오시틴 충진은 후배 형성 형 뉴런의 형태학적 식별에 사용될 수 있다.
Introduction
신경 회로를 이해하려면 뇌 영역 간의 연결을 정의하는 것이 필요합니다. 고전적인 해부학 추적 방법을 사용하면 지역 간 연결을 확립할 수 있으며 병변 연구는 정보 흐름의 계층 적 구성을 이해하는 데 도움이됩니다. 예를 들어, 공간 방향 및 머리 방향 신호에 대한 뇌 회로는 시상에서 구체로의 정보의 방향 흐름을 포함합니다. 이는 하류 등쪽 전구체에서 머리 방향 신호를 저하시키는 전방 등쪽 thalamic 핵(ADN)의 병변 연구뿐만 아니라 해마 격자 세포 신호1,2에의해 입증되었다.
뇌 영역 간의 기능적 연결은 세포 및 세포 내 수준에서 설정하는 것이 더 어렵습니다. 해마에서, 고도로 조직된 해부학은 슬라이스 준비에 있는 전기 시뮬레이션을 사용하여 통로 특정 시냅스 연결을 조사할 수 있습니다. CA1의 지층 라디에이터움에 배치된 자극 전극은CA333로부터샤퍼 부수적 입력을 구체적으로 자극하는데 사용될 수 있다. CA1의 지층 lacunosum 분자에 배치 자극 전극은 CA14,5에대한 천공 경로 입력을 활성화합니다. 전기 자극은 축슨 터미널에서 신경 전달 물질 방출을 활성화; 그러나, 그것은 통로의 축색뿐만 아니라 자극 부위 근처 소마타와 뉴런을 활성화. 따라서 전형적으로 신피질의 경우와 같이, 기원의 다른 영역의 섬유가 표적 구조에서 혼합될 때 정의된 뇌 영역에서 구심질을 연구하기 위한 제한된 사용이다.
뉴런은 또한 빛으로 자극될 수 있습니다. 광학 적 방법은 하나 또는 두 광자 레이저 스캐닝과 결합 될 수있는 케이지 조미료의 광 활성화를 포함한다. 여러 밀접하게 이격된 부위는 조직에 기계적 손상 없이 순차적으로 자극될 수 있다6. 이것은 성공적으로 시 냅 스 수용 체를 매핑 뿐만 아니라 개별 뉴런을 활성화 하는 데 사용 되었습니다7. 글루타메이트 무식은 로컬 회로 해석에 사용될 수 있지만 장거리 입력의 특정 활성화는 허용되지 않습니다.
신경 회로에서 장거리 연결의 조사를 위한 선택의 방법은 바이러스 매개 채널로도프신 발현의 사용이다. 여기에 설명된 바와 같이 생체 내 입체 주사를 사용하여, 광 문이 닫힌 이온 채널의 발현은 원하는 뇌 영역으로 표적화되고 공간적으로 제한될 수 있다. 이러한 방식으로, 채널러도셉신은 한 영역에서 표적으로 흥분제 또는 억제 연결을 매핑하는 데 효과적이다. 형질감염된 축사 단자는 뇌 슬라이스 제제에서 빛으로 자극될 수 있고, 판독으로 패치 클램프 기록은 뇌의 특정 회로 성분의 기능 및 강점을 검사할 수 있다8. 바이러스의 입체 적 주입과 결합 된 광유전학적 접근법은 전례없는 특이성 및 유전 적 대조군9을제공합니다. 빛을 자극하면 시간적 및 공간 적정밀도가 10,11로높아집니다.
예비는 해마및 파라해마 형성의 전이에서 6층 피질 구조이다12,13. 그것은 ADN11에서 중요한 시냅스 입력을 수신하지만 또한 몇몇 다른 피질 및 피질 영역(14)에서. 따라서, 서브실 슬라이스 내의 탈라믹 축사 단자의 선택적 자극은 전기 자극이나 글루타메이트 무형화로는 불가능하다. 이 프로토콜에 설명된 방법은 빛 문이 닫힌 채널을 발현하는 바이러스 벡터의 정확한 입체 적 주사를 사용하여 뇌 영역 (ADN 및 presubiculum) 사이의 기능적 연결을 결정하는 방법입니다. 또한 설명된 것은 뇌 슬라이스 제제에서 시냅스 후 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록과 결합된 표적 영역에서 뉴런을 투사하는 축세포 말단의 광자극이다.
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Protocol
모든 절차는 유럽 공동체 이사회 지침 (2010/63/ EU)에 따라 수행되었으며 파리 데카르트 대학의 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 실험자는 현지 규정을 준수하기 위한 절차에 대한 허가를 받아야 합니다.
1. 실험 계획
- 대상으로 지정할 뇌 영역을 정의합니다. 마우스 뇌아틀라스(15)의도움으로 주사 부위의 입체 좌표를 결정한다. 오른쪽 전방 등쪽 탈라믹 핵(ADN)의 경우 좌표는 -0.82 후방, 0.75 측면, -3.2 깊이(mm)로 브레그마를 기준으로 합니다. 좌표는 다른 나이, 성별 또는 변형의 동물에 대해 조정해야 할 수도 있습니다.
- 파일럿 실험에서 에피오레시현미경으로 관찰 가능한 형광 트레이서(150 ~300 nL)를 주입하여 좌표의 정확한 결과를 확인하고문서화합니다(그림 1A,B).
- 주입할 바이러스 유형을 정의합니다. 바이러스를 생산자가 권장하는 대로 -80°C에서 6 μL aliquots에 저장합니다. 얼음 위에 놓인 1마리의 별칭을 수술실로 가져와 서, 하루에 1-6마리의 동물을 주사하십시오. AAV의 사용에 대한 생물 안전 규정은 국가 또는 기관에 따라 달라질 수 있으며 PSM 2 후드의 사용이 필요할 수 있습니다.
참고: 시냅신 프로모터의 통제 하에 녹색 형광 단백질에 융합된 빠른 채널로도스핀-2 변이체인 크로노스를 발현하는 AAV2/5 혈청형을 사용합니다: AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.
2. 입체 외과
- 안정적인 표준 실험실 벤치에 펌프 홀더가 장착된 스테레오택프레임을 설치합니다. 동물의 머리가 배치 될 영역을 명확하게 볼 수 있도록 입체 경을 조정합니다. 조명을 위해 LED 광원을 사용합니다. 수술의 첫 번째 단계에 필요하지 않은 펌프 홀더에 액세스하기 위해 스테레오스코프를 멀리 돌십시오.
- 펌프 홀더에 33G 경발 금속 바늘이 장착 된 10 μL 해밀턴 주사기를 설치하십시오. 물로 배출 시스템을 테스트합니다.
- 케타민 염산염과 자일라진을 혼합하여 복강 내 주사로 4-5주 된 C57BL6 마우스를 마취시금(각각 100 mg/kg 및 10 mg/kg). 케타민 1 mL과 자일라진 0.5 mL의 8.5 mL의 0.9 % NaCl을 혼합하여 준비하십시오. 이것은 10 mg /mL 케타민과 1 mg / mL 자일라진을 혼합하여 생성합니다. 이 혼합물의, 동물의 체중의 그램 당 복 강 10 μL 주입. 마취 기간은 약 1 시간입니다.
- 동물이 발가락 핀치로 잘 마취되었는지 확인합니다. 그런 다음 호흡을 촉진하기 위해 혀를 당깁니다. 두개골 머리를 면도하십시오.
- 리도카인 염산염 20 μL (4 mg / mL; 2 mg / kg)을 국소 마취를 위해 머리 의 피부 아래에 주입하고 효과가 시작될 때까지 5 분 기다립니다. 건조로 인한 눈 손상을 방지하려면 국소 안과 연고로 눈을 가립니다.
- 두개골을 노출하려면 작은 수술 가위로 두피에 직선 컷을 만듭니다. 동물을 스테레오택시 프레임에 놓고 귀 바를 실제 귀에 약간 rostral삽입하여 뼈에 놓고 피부를 당겨 두개골에 잘 접근 할 수 있습니다. 제자리에 조입니다. 코 조각을 설치합니다.
- 높이 조절 된 지원을 사용하여 머리 의 수준에서 동물의 몸을 수평으로 유지하십시오. 생리적 온도에서 유지하기 위해 마우스 아래에 가열 패드를 놓습니다.
- 0.9% NaCl을 면봉으로 적용하여 두개골을 청소하여 뼈에서 부드러운 조직을 제거합니다. 수술의 나머지 부분에 대한 스테레오스코프를 사용합니다.
- 브레그마-람다 축이 평평해지되도록 두개골을 조정하여 코와 치아 조각을 위또는 아래로 움직입니다. 이것은 코 수준의 조정 에 따라 변경됩니다 모두 bregma와 람바의 반복적인 측정을 필요로합니다.
- 두개골에 사출 부위의 위치를 찾습니다. 사후 및 내측 좌표에 따라 주사 부위 위의 주사 바늘을 조정하고 일회용 바늘로 두개골을 표시하십시오. 주사 바늘을 4cm 위쪽으로 이동합니다.
- 드릴이 있는 0.5mm 버를 사용하여 최대 속도의 절반으로 마크에 1mm 직경의 개두피를 실현하십시오. 면봉은 종이 조직으로 결국 출혈.
- 펌프로 완전히 배출하여 보관을 위해 해밀턴 주사기에 포함된 물을 비웁습니다. 바늘만 물로 채워집니다. 바늘은 순수한 탈이온수로 각 사용 사이에 세척됩니다. 살균은 필요하지 않습니다.
- 이 일에 사용되는 바이러스의 aliquot을 가져 가라. 바이러스 성 용액이 더 이상 동결되지 않고 냉각 된 상태로 유지되었는지 확인하십시오 (얼음에 0 °C에 가깝습니다). 소량의 마이크로파이펫으로 700 nL를 얻기 위해 얼음에서 잠시 만 제거하십시오. 파라핀 필름 5cm x 5cm 조각에 방울을 입금하십시오. 거품을 만들지 마십시오. 얼음에 다시 남아있는 바이러스 성 솔루션을 넣어.
참고: 드롭 볼륨은 원하는 주입 량보다 커야 합니다(주입된 200 nL의 경우 700 nL). 이는 이송 중에 일부 액체가 분실된 경우에 대비하여 안전마진을 부여하고 진행하기 전에 작은 시험 배출(단계 2.16)을 수행할 수 있게 한다. - 개두량 위에 파라핀 필름을 놓습니다. 전방 후방 및 측면 위치를 변경하지 않고 바이러스 용액의 드롭에 바늘을 급락.
- 펌프의 "인출" 기능을 사용하여 파라핀 필름에 배치된 약 500 nL의 바이러스 용액으로 주사기를 채웁니다. 시각적 제어 (스테레오 스코프)에서이 작업을 수행, 드롭이 사라보고, 공기를 흡인하지 않도록하십시오.
- 주사기가 올바르게 채워졌는지 확인합니다. 플런저를 아래로 운전하여 50 nL의 작은 액체 방울을 시각적 제어하에 배출하여 배출 시스템의 작동 여부를 확인합니다. 드롭을 닦으하십시오.
- 바늘을 선택한 깊이로 뇌에 삽입하고, 입체 장치의 등쪽 복부 축을 시계 방향으로 제어하는 손잡이를 돌려서. "달리기" 버튼을 누른다(150nL 주입된 볼륨당 속도 15nL/min). 소량(사용된 바이러스에 따라 50-300 nL)은 자동 펌프로 10분 이상 천천히 배출됩니다.
- 사출 부위에서 누출되지 않도록 주사 후 10 분 기다립니다. 그런 다음, 도르소 복부 축을 시계 반대 방향으로 제어하는 손잡이를 돌려 3-5 분 동안 바늘을 천천히 제거합니다.
- 주사기를 동물에서 멀리 떨어진 스테레오택 프레임의 수직 부분을 회전시다. 즉시 막힘을 방지하기 위해, 여러 번 비우고 깨끗한 증류수로 바늘을 씻어. 물로 채워진 주사기를 보관합니다.
- 스테레오택 프레임에서 마우스를 분리합니다. 4-0 폴리 아미드 봉합 필라멘트로 피부를 봉합하십시오. 2-1-1 표준 수술 매듭으로 묶여 서너 개의 stiches를 만드십시오.
- 마우스를 마취에서 완전히 깨어날 때까지 가열된 케이지에 넣고 바닥에 놓인 페트리 접시에 물과 담근 음식을 제공합니다. 열원이 케이지 아래에 있으면 스페이서 그리드를 사용하여 과열을 방지하십시오.
참고 : 현지 지침에 따르면, 케토 프로 펜 (2-5 mg / kg, 피하) 또는 buprenorphine (0.05-0.1 mg / kg, 피하)의 단일 용량은 통증을 방지하기 위해 적용 될 수있다. - 동물이 완전히 깨어있을 때, 홈 케이지로 되돌리고 특히 주입 다음 날에 그 웰빙을 모니터링하십시오. 통증의 징후를 확인합니다. 어떤 행동 수정이 관찰되는 경우에, 동물은 그것의 체중을 감시하기 위하여 칭량됩니다.
- 사용되는 바이러스에 따라 전체 발현 시간이 다를 수 있습니다. 여기서는 AAV5의 발현을 위해 3주가 허용됩니다. Syn.Chronos-GFP.
3. 급성 슬라이스 기록 및 고정을위한 솔루션
- 10x 농축 절삭 솔루션(125mMM NaCl, 25mM MM KCl, 2.5mM KCl, 25mMNaHCO3,1.25mMNaH2PO4 및 2.5mM D-포도당) 및 인공 뇌척수액(ACSF) 용액(124mMM NaCl, 2.5mM, 2.5MM, KCl) 용액의 재고 솔루션을 준비합니다. NaHCO3,1 mM NaH2PO4, 및 11 mM D-포도당) 전기 생리학 실험 전에 순수한 탈이온수에서. 이러한 솔루션을 CaCl 2 및 MgCl2 없이1L 병에 4°C로 보관하십시오.
- 실험 당일, 절단 용액과 ACSF 10x의 재고 용액을 각각 0.5L의 최종 부피로 희석합니다. 마그네틱 교반기로 교반하고 95 %/5 % O2/CO2로버블링하여 산소화합니다. 이원용 이온을 첨가하여 절단 용액의 최종 농도0.1 mM CaCl2 및 7 mM MgCl2, ACSF의 경우 2mMCaCl2 및 2 mM MgCl2를 얻습니다.
- 포함 칼륨 글루코네이트 기반 파이펫 솔루션을 준비 : 135 mM K-글루코네이트, 1.2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2,4 mM MgATP, 0.4 mM Tris-GTP, 10 mM Na2-phosphocreatine, 그리고 2.7-7.1 mM 바이오시틴 포스트 혹 세포 형태 학적 계시. 용액의 pH를 7.3으로 조정하고 삼투압을 290 mosm으로 조정합니다. -20 °C에서 1 mL 알리쿼트 보관하십시오.
- BupH PBS 드라이 블렌드 파우더 파우치를 증류수 500 mL에 희석하여 0.1 M 인산나트륨, 0.15 M NaCl, pH 7.2를 생성하여 0.1 M PBS를 준비합니다.
- 4% PFA 용액 1L을 준비하려면 증류수에서 36% 액체 PFA 111 mL및 10x PBS 용액 90 mL를 희석하십시오.
- 0.1 M PBS의 500 mL에 150g의 자당을 함유 한 30 % 자당 용액을 준비하십시오.
4. 뇌 조각의 준비
- 관류 전에 흡수성 벤치 용지로 벤치 공간을 준비하십시오.
- 중력 공급 관류를 위해 벤치 위에 약 1m 의 물방울을 설치하십시오. 24G 나비 바늘을 부착하십시오.
- 얼음으로 진동의 절단 챔버를 둘러싸고 냉동실에 보관하십시오.
- 수술에 사용되는 동일한 케타민 자일라진 혼합물의 복강 내 주사로 마우스를 마취시. 집게로 발가락을 꼬집어 마취의 단계를 평가하십시오. 완전히 잠들면 100 μL의 헤파린(5000 U.I./mL)을 복강 내 주사하십시오.
- 흡수성 종이에 접착 테이프로 동물을 고정하고 뒷면에 놓습니다. 다이어프램에서 위쪽으로 작은 가위로 왼쪽과 오른쪽의 갈비뼈를 절단하여 흉부 케이지를 엽니다. 접착제 테이프의 도움으로 흉부 케이지를 열어 두지 않도록 하십시오.
- 하강 대동맥을 지혈으로 고정하고 심장의 좌심실을 통해 4 °C 냉각 및 산소화 (95 %/5 % O2/CO2)로24 G 나비 바늘을 통해 용액을 절단합니다. 5 s 후, 작은 가위로 오른쪽 심방을 엽니 다.
- 관류 5 분 후, 장기가 무혈일 때 관류를 중지하십시오. 큰 가위로 동물을 참수하고 페트리 접시에 4 °C 냉각 및 산소 절단 용액에 머리를 침지.
- 뇌를 추출하려면 목에서 코로 피부를 자른 다음 두개골에서 마지막 척추를 가위로 잘라냅니다. 수동으로 피부를 철회하고 작은 가위를 사용하여 두개골을 열고, 꼬리에서 로스트랄까지, 눈 사이를 위쪽으로 자르는 것입니다.
- 정수리 뼈와 구부러지거나 뼈 집게가 있는 정면 뼈의 꼬리 부분을 조심스럽게 제거합니다. 뇌와 두개골 바닥 사이에 악기를 삽입하고 후각 전구, 시신경 및 기타 두개골 신경 및 소뇌를 절제하여 작은 둥근 주걱으로 뇌를 추출하십시오.
- 비커에 얼음 차가운 절단 용액 (4 °C)에 뇌를 부드럽게 침수. 뇌를 필터 용지에 놓아 피질 표면을 부드럽게 건조시도록 합니다. 수평 뇌 조각을 절단하기 위해, 블레이드를 향한 꼬리 측면과 함께, 진동의 표본 홀더에 뇌 피질 아래로 접착제.
- 뇌가 완전히 침수되도록 얼음 차가운 산소 절단 솔루션으로 절단 챔버를 채웁니다. 슬라이스에 잠재적인 왼쪽-오른쪽 모호성을 피하기 위해 왼쪽 반구 (주입 된 측면에 반대)에 컷을 확인합니다.
주의: 항상 용액에 산소를 공급하고 빛에 노출되지 않도록 슬라이스를 보호하십시오. - 1mm 진폭에서 0.07 mm/s의 속도로 진동으로 300 μm 두께의 슬라이스를 잘라냅니다. 이 단계에서형광손전등(440-460 nm)과 해당 필터 안경(500 nm 롱 패스)을 사용하여 시상에서 크로노스-GFP 발현을 간략하게 확인하는 것이 좋습니다.
- 메스로 해마 부위를 분리하고 목욕 온난화 (34 °C), 산소화 (95 %/ 5 % O2/CO2)ACSF로 채워진 비커에 위치한 챔버로 옮김을 옮김.
- 15 분 후, 가열 된 수조에서 챔버를 가지고 슬라이스가 실온에서 휴식을 취하게, 여전히 사용 될 때까지 적어도 45 분 동안 산소.
5. 전체 셀 패치 클램프 기록
- 맞춤형 유리 이송 파이펫으로 해마 복합체를 함유한 뇌 조각을 수직 현미경에 장착된 기록 챔버로 부드럽게 옮김을 전달합니다. 전사 피펫은 고무 파이펫 전구에 부착된 단축된 파스퇴르 파이펫(내경 6.5mm)으로 만들어집니다. 34°C(데온) ACSF로 95%/5% O2/CO2로 버블링된 녹음챔버(3mL)를 지속적으로 침전시킴. 연동 펌프의 속도를 2-3 mL/min으로 설정합니다.
- 파란색 LED 조명(470nm)으로 관심 있는 지역의 축단 말단에서 크로노스-GFP 발현을 간략하게 검토하고 4배 의 목표로 관찰합니다. GFP 형광은 적절한 방출 필터를 통해 시각화되며 컴퓨터 화면에 CCD 카메라 이미지가 표시됩니다.
- U자형 백금 와이어로 만든 슬라이스 앵커를 슬라이스에 단단히 간격을 둔 나일론 스트링("하프")으로 고정합니다.
- 63배 몰입 목표로 변경하고 초점을 조정합니다. 크로노스-GFP를 표현하는 축색을 확인하고 패치 기록을 위해 피라미드 형 뉴런을 선택하십시오.
- 목표를 위쪽으로 이동합니다.
- 보로실리케이트 유리에서 갈색 불타는 전극 풀러를 사용하여 파이펫을 당깁니다. 풀러는 팁 직경이 약 1 μm인 파이펫을 생산하도록 설정되어 있습니다. K-글루코네이트 기반 내부 솔루션으로 파이펫을 채웁니다.
- 파이펫 홀더를 헤드 스테이지에 장착합니다. 챔버에서 파이펫을 낮추고 목표 아래 팁을 찾습니다. 파이펫 저항은 3-8 MΩ 사이여야 합니다. 파이펫에서 용액 유출의 콘을 볼 수 있도록 주사기와 빛 양압을 적용하고 점진적으로 피펫과 슬라이스의 표면에 목표를 낮춥니다.
- 전압 클램프 구성으로 셀을 패치 : 식별 된 뉴런에 접근하고 섬세하게 소마에 파이펫 팁을 누릅니다. 양압은 멤브레인 표면에 보조개를 생성해야합니다. 기가옴 씰(>1 GΩ 저항)을 만들기 위해 압력을 해제합니다. 일단 밀봉되면 유지 전압을 -65 mV로 설정합니다. 음압의 날카로운 펄스로 멤브레인을 파괴 : 이것은 파이펫 홀더에 연결된 튜브에 강한 흡입을 적용하여 달성된다.
- 전체 세포 전류 클램프 모드에서 과분극화 및 탈분극 전류 단계에 대한 뉴런의 반응을 기록합니다(도2A).
참고: 이 프로토콜은 셀의 활성 및 수동 내장 특성을 결정하는 데 사용됩니다. 사용자 정의 작성 MATLAB 루틴은 오프라인 분석10,16에사용됩니다. - 크로노스를 발현하는 구심성 섬유의 전계 475 nm LED 자극에 대한 전류 또는 전압 클램프 의 내시경 반응기록. 20 Hz에서 2 ms 의 시간 의 10 자극의 열차로 자극(그림 2B,C). 광도는 0.1-2 mW에서 다를 수 있습니다.
참고: 광도는 목표 아래에 위치한 포토다이오드 센서가 장착된 디지털 핸드헬드 광학 파워 콘솔로 측정되었습니다. 2-4 ms의 응답 대기 는 단시 냅 스 연결에 대 한 특성입니다. - 장거리 구심질및 기록된 뉴런 사이의 시냅스 전달의 성질을 조사하기 위해, 상이한 약리학적 인 약리제가 사용될 수 있다. 약리학적으로 네트워크 활성화를 통한 간접 반응과 직접적이고 단시냅스반응을 구별하기 위해 ACSF에 1 μM TTX 및 100 μM 4-AP를 추가합니다.
참고 : 글루타메이트 수용체 차단제의 목욕 응용 프로그램은 방출되는 신경 전달 물질의 특성과 후유증 수용체의 정체성을 결정할 수 있게 합니다. 예를 들어, AMPA 형 글루타메이트 수용체는 APV(100 μM)에 의해 NBQX(10 μM) 및 NMDA 수용체에 의해 차단될 것이다. 연구의 목적에 따라, 프로토콜은 시간이 지남에 따라 시냅스 반응 또는 응답 역학의 전압 의존성을 조사하기 위해 생각될 수 있다. - 원래 ACSF 용액으로 세척하여 다른 세포를 패치하거나, 4% PFA로 채워진 작은 바이알에 바이오시틴이 채워진 뉴런을 함유하는 슬라이스를 옮김을 전달한다.
- 4% PFA에서 하룻밤 고정한 후, 슬라이스를 0.1 M PBS(5분 동안 2회, 20분 동안 1x)로 세척합니다.
- 4 °C에서 30 % 자당에 보관하십시오.
6. 바이오시틴 계시
- 바이오시틴으로 채워진 뉴런을 함유한 고정 된 조각을 유리 블레이드에 30 % 자당 한 방울로 옮기고 3 주기의 동결 해동을 수행하십시오 : 자당 방울이 완전히 얼 때까지 스티로폼 상자에 1 분 동안 건조 얼음에 블레이드를 놓습니다. 블레이드를 손바닥에 대고 눌러 해동합니다.
- 슬라이스를 0.1M PBS(5분 2x, 1시간 1분, 50분)로 3x 로 부드럽게 저어주세요. 마지막 세탁시 2h를 초과하지 마십시오.
- 2% 분유(20 mL에서 0.4 g)를 함유하는 교반 완충액에서 RT에서 슬라이스를 미리 배양하여 비특이적 부위와 0.5% 트리톤 X100(20 mL에서 0.1 mL)을 포화시키고 0.1 M PBS로 멤브레인을 투과시킵니다.
- 2% 분유, 1% 트리톤 X100, 스트렙타비딘-Cy5 컨쥬게이트(1/500), DAPI(1/1000)를 0.1 M PBS에서 함유하는 용액에서 4°C에서 밤새 배양하고 부드럽게 교반하였다.
- 슬라이스를 0.1M PBS로 3회 세척합니다(5분 동안 2회, 2시간 동안 1x). 마지막 세척은 배경 얼룩을 줄이기 위해 최대 4 시간까지 더 오래 지속될 수 있습니다.
- 슬라이스를 장착하기 전에, PBS로 채워진 챔버에서 표시된 세포를 포함하는 슬라이스의 측면을 식별하기 위해 Cy5 형광 마커를 관찰하도록 구성된 10x 배율에서 에피노레시전 현미경을 사용하십시오.
- 슬라이스를 블레이드에 옮기고, 셀 면을 위로 옮기고, 종이 티슈로 건조시키고, 고저항 장착 매체를 사용하여 장착합니다.
- Cy5 및 DAPI 구성에서 10배 배율로 에피플루온 현미경을 사용하여 세포체 위치를 검사하고 GFP 구성에서 미세한 체세포, 축축축, 및 20x에서 현저한 구심체 또는 고분해능 공초점 현미경을 관찰하고, 수지상 형태학(그림 2D,E). 필터 설정은 재질 표에자세히 설명되어 있습니다.
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Representative Results
여기에 제시된 절차는 시상(ADN)의 전방 등쪽 핵에서 GFP에 융합된 청색 광민감 채널로도인 채널로도프신(Chronos)을 발현하기 위해 사용되었으며, 전방 아데노 관련 바이러스의 입체주사에 의해 사용되었다. 입체 좌표는 마우스 뇌 아틀라스에 따라 결정되었고 형광 추적자 플루오로 루비 200 nL를 주입하여 테스트했습니다. 동물은 주사 후 10 분 희생되었고, 뇌는 하룻밤 동안 추출되고 고정되었습니다. 코로나 뇌 섹션은 주사 부위를 검사하기 위해 준비되었고, 이는 ADN에 올바르게 배치되고 제한되었다(도1A,B).
ADN의 뉴런에서 크로노스-GFP를 발현하기 위해, 우리는 AAV5의 300 nL를 주입했다. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH. 주사 후 3 주, 급성 수평 뇌 슬라이스를 준비 했다. 그림 1 C는 녹색GFP 발현과 함께 오른쪽 반구에 thalamic 주입 사이트를 포함하는 뇌 슬라이스를 보여줍니다. 4x 목적을 갖춘 에피형광 현미경으로 검사한 결과, GFP 표지된 thalamic 축색은 전형물(그림1C,D)에서관찰되었습니다. 탈라믹 축색은 전형의 표면층 I 및 III를 조밀하게 내첩화시켰다(도1D).
층 III에서 의 subicular 뉴런의 활성은 전체 세포 패치 클램프 구성에 기록되었다. 막 전위 변화를 기록하면서 과분극 화 및 탈분극 전류 단계를 적용하였다(도2A). 데이터는 활성 및 수동 멤브레인 특성의 나중에 오프라인 분석을 위해 컴퓨터에 저장되었습니다. Subicular 층 III 주요 세포는 전형적으로 -63 mV에 가까운 부정적인 휴식 전위를 소유하고 발사 임계값에 막 전위를 구동하기 위하여 요구된 탈분극 전류 주입. 해당 고유 속성에 대한 전체 설명이게시되었습니다 11.
크로노스-GFP를 발현하는 ADN 축삭 단말자극은 현재 클램프 모드에서 서브스큘러 층 III 주요 세포에서 흥분후 시냅스 전위(EPSPs)를 유도하였다(도2B). 광강도에 따라 EPSP는 동작 전위 임계값에 도달할 수 있습니다. 시냅스 후 전류(EPSCs)가 유도됨에 따라 전압 클램프 모드에서도 후시내 반응이 관찰되었다(도2C). 빛 자극에 의해 유발된 EPSCs의 발병 대기는 짧고(중앙값, 1.4 ms10),thalamic 축색과 층 III subsubcular 뉴런 사이의 직접적인 시냅스 접촉을 나타낸다. TTX-4AP 조건에서 지속 EPSCs는 이 단시냅스 활성화를 확인했습니다. 이 세포가 규칙적인 발사 패턴으로 구심성 축색의 빛 자극에 안정적으로 반응했다는 점은 주목할 만합니다.
그림 1 : 내공성 해막핵(ADN)의 입체전성 주사. (A) 주사의 개략적 표현. (B) 관상 섹션에서 플루오로 루비로 주사 부위 확인. 인세트는 브레그마에서 의 전방 등도 수준과 거리를 나타냅니다. (C)시상에서 AAV-크로노스-GFP 주사 후 수평 슬라이스. 동측 예비측에 대한 축삭 투영에 유의해야 한다. 슬라이스의 왼쪽에 절개는(검은색 삼각형으로 표시) 반대반구를 표시합니다. (B, C) 배율 막대 1 mm.(D) 서브피일 층으로 ADN 돌기를 가진(C)에서 인셋의 확대뷰. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 서브내층 III 뉴런: 내재특성, 탈라믹 구심질의 빛 자극에 대한 반응, 세포 형태학의 사후 폭로. (A) 현재 단계의 과분극 및 탈분극을 위한 층 III 뉴런의 발사 패턴 및 막 전위 변형. (B, C) 층 III 뉴런의 반응(B)전류 클램프 및(C)전압 클램프 모드에 기록된 탈라믹 축의 2 ms 빛 자극(blue bar). (D, E) 층 III 피라미드 뉴런 (흰색, 채워진 노란색 삼각형으로 표시) Chronos-GFP를 표현 하는 thalamic 축 에 의해 둘러싸여 (녹색) DAPI 염색과 subsubicular 표면 층에서 (파란색) 에피소네시스 현미경으로 이미지 된 수평 슬라이스 ( D, 스케일 바 = 100 μm) 및 고배율에서 공초점 현미경(E,스케일 바 = 50 μm). (A)의 셀은 채워진 노란색 삼각형으로 표시됩니다. 부분적으로 채워진 두 번째 뉴런은 빈 노란색 삼각형으로 표시된 이 조각에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
정의된 뇌 영역에서 빛에 민감한 옵신을 발현하는 생체내 바이러스 주사는 장거리 기능적 연결성10,11,17,18의광유전학적 분석을 위한 선택방법이다. 스테레오택시 주사는 정확하게 뇌의 특정 영역을 대상으로 할 수있는 가능성을 제공합니다. 형광 리포터와 함께 opsin의 공동 발현은 정확한 주사 부위의 성공적인 발현 및 확인을 편리하게 평가할 수 있게 한다. AAV 혈청형 2/5의 사용은 전형적으로 표적으로 한 두뇌 지구에 표정을 제한합니다. 이런 식으로, 뉴런의 제한된 인구는 그들의 세포체 및 축사 단말에 있는 빛에 민감한 이온 채널을 표현하는 형질감염됩니다. 후속 생체 내 슬라이스 실험에서, 그것은 그들의 대상 영역에 직접 빛 펄스와 이러한 축 삭 터미널을 자극 하는 수, 사후 synaptically 연결 된 뉴런의 패치 클램프 기록을 통해 성공적인 시 냅 스 전송을 읽는 동안. 위의 프로토콜은 강력하고 편리하며 몇 가지 추가 참고 사항으로 성공적인 실험의 성능에 도움이 될 수 있습니다.
마취의 다른 모형은 이용될 수 있습니다. 여기에 기재된 케타민-자일라진 조합의 복강 내 주사는 사용하기 쉬운 단기 마취로 편리한 진통19. 마취의 깊이 그리고 내구는 어느 정도 다를 수 있습니다. 경우에 따라, 프로토콜 동안 케타민 자일라진의 또 다른 반 복용량을 주입 해야 할 수 있습니다. Isoflurane 마취는 더 빨리 유도하고 더 나은 마취의 깊이를 통제하는 좋은 대안이 될 수 있습니다. 주사 부위의 좌표는 마우스 뇌 아틀라스의 도움으로 결정될 수 있다. 실제로 필요한 경우 좌표를 테스트하고 조정해야 합니다.
깨끗한 작업 환경도 중요합니다. 장갑, 몹 캡 및 실험실 코트를 포함한 일회용 보호 장비를 사용하는 것이 좋습니다. 입체 프레임에 동물을 배치 할 때, 특별한주의는 크게 마취의 효율성을 향상시킬 동물의 편안함에 지불해야한다. 동물의 몸은 머리와 목에 정렬해야합니다. 개두술 전에 동물을 포지셔닝하는 데 가장 중요한 단계는 bregma-lambda 축의 조정입니다. 깊은 뇌 구조를 대상으로 특히, 심지어 작은 편차는 뇌로 주입 바늘을 낮출 때 오류를 생성합니다. 어떤 경우에는 의도적으로 경사 바늘 궤적을 선택하고 계산할 수 있습니다.
사출 부피는 정확하게 국부된 opsin 발현을 얻기 위한 결정적인 인자이다. 작은 볼륨은 엄격하게 제한된 형질전환 영역을 특권화하는 데 이상적입니다. 볼륨이 높을수록 큰 대상 영역의 전체 범위를 커버하는 데 유용할 수 있습니다. 중격(18)과같은 넓은 면적을 커버해야 하는 경우, 인접한 좌표의 범위와 함께 여러 개의 작은 주사를 배치하는 것이 도움이 될 수 있다. 생체외 전기생리학적 기록까지의 간격도 중요하다. 전체 표현식에 필요한 최소 시간이 필요합니다. 동안 3 주 이러한 실험에 대 한 최적의 지연 될 것 같다11,필요한 지연 바이러스에 따라 달라질 수 있습니다., 그것의 혈 청 유형, 그리고 후 면 뇌 영역까지의 거리.
여기에 설명 된 접근 방식은 형질 전환 동물주사와 결합 될 때 훨씬 더 강력합니다. 이전 연구는 GABAergic 뉴런의 아류형에 대해 상이한 마우스 라인을 악용하여, 패치 클램프기록20에대한 PV- 또는 SST 발현 인터뉴런을 구체적으로 표적으로 하기 위해. 인접한 PV 및 피라미드 뉴런 또는 SST 및 피라미드 뉴런의 동시 이중 기록은 두 개의 뉴런 유형11사이의 장거리 입력의 강점을 비교할 수 있게 한다. 이 결과 하나의 뉴런 유형에 대 한 표준화. 이 표준화는 opsins의 발현 수준이 다른 동물 또는 다른 조각 사이에서 변화하는 경우에 특히 중요합니다.
슬라이스 상태는 고품질 패치 클램프 레코딩에 필수적입니다. 슬라이스의 지속적인 산소화는 매우 중요하며, 느린 절삭 속도는 슬라이스 표면 품질을 크게 향상시킵니다. 300 μm의 슬라이스 두께는 세포체가 있는 피라미드 뉴런, 수지상 및 국소 축색 파급 효과 및 국소 시냅스 연결을 포함하여 수평 사전 섹션의 미세 회로 무결성을 어느 정도 보존합니다. 구심성 섬유의 활성화를 유도하기 위해 선택된 광 게이트 채널의 유형은 자극 파라미터(지속 시간, 광 강도)에 크게 영향을 미칩니다. 크로노스는 청색 광에 민감한 채널로도이집신이며, 광범위한 조명 파장은 활성화에 사용할 수 있습니다(0.05 mW/mm2의최소 광도에서도 최대 500nm, 최대 530 nm21에서 활성화 ). 또한, 크로노스는 고주파 자극과 장거리 프로젝션22의안정적인 활성화를 가능하게 하는 고전적인 ChR2에 비해 빠른 역학 특성을 가지고 있습니다. Chrimson의 표현과 함께, 적색 이동 opsin 변이체, 별개의 신경 인구의 독립적인 광학 여기가 가능해진다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 버트 랜드 마톤, 메리 나사르, 리 웬 황, 그리고 장 시몬넷은 기술적 인 도움을 위한 스테레오 탁시컬 주입 프로토콜과 마린 마누엘과 파트리스 제구조의 이전 버전의 개발에 도움을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 교육 및 연구 프랑스 교육부에 의해 지원되었다 (L. R., L. S.), 센터 국립 데 에뛰데스 공간 (M. B.), 및 기관 국립 드 라 레처 그랜트 ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN - 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 - 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
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