이 프로토콜은 생체 뇌 슬라이스에서 광유전학 자극을 사용하여 먼 뇌 영역에서 장거리 입력의 세포 유형 특정 기능적 연결을 식별하는 일련의 방법을 설명합니다.
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방법 논문
마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사
이 논문에서
요약
초록
세포 형 특정 시냅스 연결의 지식은 뇌 전체 신경 회로를 이해하기위한 중요한 전제 조건입니다. 장거리 연결의 기능적 조사는 확인된 먼 입력의 특정 자극과 결합된 단 하나 뉴런의 표적으로 한 기록을 요구합니다. 이것은 종종 기존의 전기 자극 기술로 달성하기 어렵다, 수렴 에서 축색은 상류 뇌 영역을 혼합 할 수 있기 때문에 대상 영역에서 혼합 할 수 있습니다. 빛에 민감한 이온 채널의 바이러스 매개 표현을 위한 특정 뇌 영역의 입체 적 표적화는 빛으로 그 지역에서 유래 된 축전의 선택적 자극을 허용합니다. Intracerebral 입체 전염 주사는 두뇌를 통하여 그밖 피질 또는 피질 지역 이외에 전방 thalamic 핵과 같은 잘 분리된 구조물에서 이용될 수 있습니다.
여기서 설명된 것은 마우스 뇌에서 채널로도셉신을 발현하는 바이러스 벡터의 정확한 입체주입을 위한 기술세트이며, 이어서 뇌 슬라이스 제제에서 축사 말단의 광자극이 뒤따른다. 이러한 프로토콜은 간단하고 광범위하게 적용 가능합니다. 세포 내 로 연결된 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록과 결합하여 축삭의 광자극은 기능적 시냅스 연결, 약리학적 특성 및 강도 평가를 감지 할 수 있습니다. 또한, 기록된 뉴런의 바이오시틴 충진은 후배 형성 형 뉴런의 형태학적 식별에 사용될 수 있다.
서론
신경 회로를 이해하려면 뇌 영역 간의 연결을 정의하는 것이 필요합니다. 고전적인 해부학 추적 방법을 사용하면 지역 간 연결을 확립할 수 있으며 병변 연구는 정보 흐름의 계층 적 구성을 이해하는 데 도움이됩니다. 예를 들어, 공간 방향 및 머리 방향 신호에 대한 뇌 회로는 시상에서 구체로의 정보의 방향 흐름을 포함합니다. 이는 하류 등쪽 전구체에서 머리 방향 신호를 저하시키는 전방 등쪽 thalamic 핵(ADN)의 병변 연구뿐만 아니라 해마 격자 세포 신호1,2에의해 입증되었다.
뇌 영역 간의 기능적 연결은 세포 및 세포 내 수준에서 설정하는 것이 더 어렵습니다. 해마에서, 고도로 조직된 해부학은 슬라이스 준비에 있는 전기 시뮬레이션을 사용하여 통로 특정 시냅스 연결을 조사할 수 있습니다. CA1의 지층 라디에이터움에 배치된 자극 전극은CA333로부터샤퍼 부수적 입력을 구체적으로 자극하는데 사용될 수 있다. CA1의 지층 lacunosum 분자에 배치 자극 전극은 CA14,5에대한 천공 경로 ....
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프로토콜
모든 절차는 유럽 공동체 이사회 지침 (2010/63/ EU)에 따라 수행되었으며 파리 데카르트 대학의 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 실험자는 현지 규정을 준수하기 위한 절차에 대한 허가를 받아야 합니다.
1. 실험 계획
- 대상으로 지정할 뇌 영역을 정의합니다. 마우스 뇌아틀라스(15)의도움으로 주사 부위의 입체 좌표를 결정한다. 오른쪽 전방 등쪽 탈라믹 핵(ADN)의 경우 좌표는 -0.82 후방, 0.75 측면, -3.2 깊이(mm)로 브레그마를 기준으로 합니다. 좌표는 다른 나이, 성별 또는 변형의 동물에 대해 조정해야 할 수도 있습니다.
- 파일럿 실험에서 에피오레시현미경으로 관찰 가능한 형광 트레이서(150 ~300 nL)를 주입하여 좌표의 정확한 결과를 확인하고문서화합니다(그림 1A,B).
- 주입할 바이러스 유형을 정의합니다. 바이러스를 생산자가 권장하는 대로 -80°C에서 6 μL aliquots에 저장합니다. 얼음 위에 놓인 1마리의 별칭을 수술실로 가져와 서, 하루에 1-6마리의 동물을 주사하십시오. AAV의 사용에 대한 생물 안전 규정은 국가 또는 기관....
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결과
여기에 제시된 절차는 시상(ADN)의 전방 등쪽 핵에서 GFP에 융합된 청색 광민감 채널로도인 채널로도프신(Chronos)을 발현하기 위해 사용되었으며, 전방 아데노 관련 바이러스의 입체주사에 의해 사용되었다. 입체 좌표는 마우스 뇌 아틀라스에 따라 결정되었고 형광 추적자 플루오로 루비 200 nL를 주입하여 테스트했습니다. 동물은 주사 후 10 분 희생되었고, 뇌는 하룻밤 동안 추출되고 고정되었습니다. 코로나 뇌 섹션은 주사 부위를 검사하기 위해 준비되었고, 이는 ADN에 올바르게 배치되고 제한되었다(도1A,B).
ADN의 뉴런에서 크로노스-GFP를 발현하기 위해, 우리는 AAV5의 300 nL를 주입했다. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH. 주사 후 3 주, 급성 수평 뇌 슬라이스를 준비 했다. 그림 1 C는
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토론
정의된 뇌 영역에서 빛에 민감한 옵신을 발현하는 생체내 바이러스 주사는 장거리 기능적 연결성10,11,17,18의광유전학적 분석을 위한 선택방법이다. 스테레오택시 주사는 정확하게 뇌의 특정 영역을 대상으로 할 수있는 가능성을 제공합니다. 형광 리포터와 함께 opsin의 공동 발현은 정확한 주사 부위의 성공적인 발현 및 확인을 편리하게 평가할 수 있게 한다. AAV 혈청형 2/5의 사용은 전형적으로 표적으로 한 두뇌 지구에 표정을 제한합니다. 이런 식으로, 뉴런의 제한된 인구는 그들의 세포체 및 축사 단말에 있는 빛에 민감한 이온 채널을 표현하는 형질감염됩니다. 후속 생체 내 슬라이스 실험에서, 그것은 그들의 대상 영역에 직접 빛 펄스와 이러한 축 삭 터미널을 자극 하는 수, 사후 synaptically.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 버트 랜드 마톤, 메리 나사르, 리 웬 황, 그리고 장 시몬넷은 기술적 인 도움을 위한 스테레오 탁시컬 주입 프로토콜과 마린 마누엘과 파트리스 제구조의 이전 버전의 개발에 도움을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 교육 및 연구 프랑스 교육부에 의해 지원되었다 (L. R., L. S.), 센터 국립 데 에뛰데스 공간 (M. B.), 및 기관 국립 드 라 레처 그랜트 ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mm 버 | 하버드 기구 | 724962 | |
| 10 µ L Hamilton 주사기 | Hamilton | 1701 RN - 7653-01 | |
| 10X PBS 솔루션 | Thermofisher Scientific | AM9624 | 텍스트 |
| 36% PFA | 시그마-알드리치 | F8775 | |
| 470 nm LED | 케른 리서치 | P1105/470/LED DC/59022m | 은 매칭된 여기 필터 470/40x 및 GFP용 방출 필터와 함께 사용; |
| AAV5입니다. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| 모든 화학 물질 | Sigma | ||
| Bath 온도 조절기 | Luigs & Neumann | SM7 | 세트 34° 씨 |
| 베벨 메탈 니들 | Hamilton | 7803-05 | 33 게이지, 13mm, 포인트 스타일 4-20°C; |
| 큰 가위 | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | 최종 1-3 mg/ml |
| 붕규산 모세 혈 | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm 외부, 0.86 내경 |
| 갈색 불타는 전극 풀러 | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH 인산염 완충 식염수 팩 | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| 관류용 나비 바늘 | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD 카메라 | 안도르 | DL-604M | |
| 컨포칼 현미경 | Zeiss | LSM710 | 20X |
| 곡선 펜치 | FST | 11011-17 | |
| CY5 구성(컨포칼) | 헬륨-네온 633nm(5,0mW) 레이저; 미러: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 구성 (epifluo) | Nikon/Chroma | 형광등 (Intensilight); 여기 필터: BP645/30; 다이크로익 미러: 89100 BS ; 방출 필터: BP705/72 | |
| DAPI | 시그마 | D9542 | |
| DAPI 구성(에피플루오) | 니콘/크로마 | 형광등(인텐시라이트); 큐브: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (여기: BP 377/50; 거울 : BS 409; 방출 : BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| 디지털 핸드 헬드 광학 미터 | ThorLabs | PM100D | 475 nm |
| 이중 egde 스테인레스 스틸 면도날 | 전자 현미경 과학 | 72000 | 슬라이서에서 블레이드의 절반 사용 |
| 이중 형광 단백질 손전등 | 밤바다 | DFP-1 | 여기, 440-460 nm; 유리의 방출 필터, 500nm 장역. |
| EGTA | 시그마 | E4368 | 마지막 0,2 mM |
| Epifluorescence 현미경 | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 또는 20X |
| 여과지 | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | 100 µ에 있는 10 mg를 용해합니다; l 증류수 ; 150-300 nl |
| GFP 구성 주입 (epifluo) | Nikon/Chroma | 형광등(Intensilight); 큐브: 필터 세트 Nikon B-2E/C FITC (여기: BP 465-495; 거울 : BS 505; 방출 : BP 515-555) | |
| 가열판 | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I. / ml | Sanofi | 5 ml 바이알 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | 최종 10 mM |
| 고속 로터리 마이크로 모터 키트 | Foredom | K.1070 | 최대 드릴 속도 38,000 rpm |
| < 강> 내부 용액 화합물 : < / 강> | |||
| 절연 펄스 자극기 | AM 시스템 | 2100 | |
| KCl | 시그마 | P4504 | 최종 1,2 mM |
| 케타민 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10 | % Merial | 100 mg / ml : 희석 1 & 마이크로; l 총 1ml에서 (0,1%) | |
| 라오카인(리도카인) | MSD | 16,22 mg/ml : 총 1ml 4ml로 희석(약 4%) | |
| 수술용 LED 안녕 파워 스폿 | Photonic(Phymep을 통해) | 10044 | |
| LED 전원 공급 장치 | Cairn Research | OptoLED 광원 | |
| 매니퓰레이터 | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | 최종 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | 최종 2 mM |
| 마이크로 온도 조절기 | Physitemp | MTC-1 | |
| 분유 | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | 축삭 악기 | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | 최종 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | 최종 0.4 mM |
| 바늘 홀더/헤모스탯 | FST | 13005-14 | |
| pClamp 획득 소프트웨어 | Axon Instruments | ||
| 연동 펌프 | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 디스플레이에 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | 총 10ml에 8.5mL | |
| 희석 스테레오현미경 VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| 스테레오택시 프레임과 디지털 디스플레이 | Kopf | 모델 940 | 소형 동물 스테레오택시 기구 |
| Streptavidin-Cy3 접합체 | Life technologies | ||
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g 튜브 |
| 봉합사 필라멘트 Ethilon II 4-0 폴리아미드 | Ethicon | F3210 | |
| 주사기 펌프 | kdScientific | Legato 130 - 788130 | 주입 및 회수 모드 사용 |
| 조직 슬라이서 | Leica | VT1200S | 속도 0.07, 진폭 1. |
| 튜빙 | Gilson | F117942, F117946 | 옐로우/블랙, 퍼플/블랙 |
| 정립 현미경 | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry 벤치 흡수지 | Nalgene |
참고문헌
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S.
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재인쇄 및 허가
