Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Metoder til test endokrine forstyrrelser i Drosophila melanogaster

Published: July 3, 2019 doi: 10.3791/59535
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1,2
1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

Summary

Hormonforstyrrende stoffer (EDC) udgør et alvorligt problem for organismer og for naturlige miljøer. Drosophila melanogaster er en ideel model til at studere EDC effekter in vivo. Her præsenterer vi metoder til at undersøge endokrine forstyrrelser i Drosophila, adressere EDC effekter på frugtbarhed, frugtbarhed, udviklingsmæssige timing, og levetiden af flue.

Abstract

I de seneste år har der været voksende beviser for, at alle organismer og miljøet er udsat for hormon-lignende kemikalier, kendt som endokrine forstyrrende stof kemikalier (edc'er). Disse kemikalier kan ændre den normale balance af endokrine systemer og føre til negative virkninger, samt et stigende antal hormonelle lidelser i den menneskelige befolkning eller forstyrret vækst og reduceret reproduktion i de vilde dyr arter. For nogle Edc'er, der er dokumenteret sundhedsmæssige virkninger og begrænsninger på deres anvendelse. Men for de fleste af dem er der stadig ingen videnskabelige beviser i denne forstand. For at verificere potentielle endokrine virkninger af et kemikalie i hele organismen, er vi nødt til at teste det i passende modelsystemer, samt i frugtflue, Drosophila melanogaster. Her rapporterer vi detaljerede in vivo protokoller for at studere endokrine forstyrrelser i Drosophila, adressere EDC effekter på frugtbarhed/fertilitet, udviklingsmæssige timing, og levetiden af flue. I de sidste par år, vi brugte disse Drosophila liv træk til at undersøge virkningerne af eksponering for 17-α-ethinylestradiol (EE2), Bisphenol A (BPA), og bisphenol AF (BPA F). Tilsammen dækkede disse analyser alle Drosophila livsstadier og gjorde det muligt at evaluere endokrine forstyrrelser i alle hormon-medierede processer. Fecundity/fertilitet og udviklingsmæssige timing analyser var nyttige til at måle EDC indvirkning på flue reproduktionsevne og på udviklingsmæssige stadier, hhv. Endelig, levetid assay involveret kronisk EDC eksponeringer mod voksne og målte deres overlevelse. Men disse livs træk kan også være påvirket af flere eksperimentelle faktorer, der skulle kontrolleres nøje. Så i dette arbejde, foreslår vi en række procedurer, vi har optimeret til det rigtige resultat af disse assays. Disse metoder gør det muligt for videnskabsfolk at etablere endokrine forstyrrelser for ethvert EDC eller for en blanding af forskellige Edc'er i Drosophila, selv om at identificere den endokrine mekanisme ansvarlig for effekten, yderligere essays kunne være behov for.

Introduction

Menneskelige aktiviteter har i miljøet frigivet en massiv mængde kemikalier, som udgør et alvorligt problem for organismer og for naturlige økosystemer1. Af disse forurenende stoffer anslås det, at omkring 1.000 forskellige kemikalier kan ændre den normale balance af endokrine systemer; Ifølge denne egenskab klassificeres de som endokrine forstyrrende kemikalier (Edc'er). Specifikt, baseret på en nylig definition af endokrine Society, Edc'er er "en eksogen kemiske, eller blanding af kemikalier, der kan forstyrre ethvert aspekt af hormon aktion"2. I løbet af de sidste tre årtier har der været voksende videnskabelige beviser for, at edc'er kan påvirke reproduktion og udvikling af dyr og planter3,4,5,6,7, 8. den er Yderligere, EDC eksponering har været relateret til den stigende forekomst af nogle menneskelige sygdomme, herunder kræft, fedme, diabetes, skjoldbruskkirtel sygdomme, og adfærdsmæssige lidelser9,10,11.

Generelle mekanismer i EDC

På grund af deres molekylære egenskaber opfører edc'er sig som hormoner eller hormon prækursorer3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. I denne forstand, de kan binde til et hormonreceptor og forstyrre endokrine systemer enten ved at efterligne hormon aktivitet eller ved at blokere endogene hormoner binding. I det første tilfælde, efter binding til receptoren, de kan aktivere det som sin naturlige hormon ville gøre. I det andet tilfælde, binding af EDC til receptoren forhindrer bindingen af dens naturlige hormon, så receptoren er blokeret og kan ikke længere aktiveres, selv i nærværelse af sin naturlige hormon3. Som en konsekvens, kan Edc'er påvirke flere processer, såsom syntese, sekretion, transport, metabolisme, eller perifer virkning af endogene hormoner, der er ansvarlige for opretholdelse af homøostase, reproduktion, udvikling og/eller opførsel af organismen. Receptor binding er ikke den eneste metode, der hidtil er beskrevet for Edc'er. Det er nu klart, at de også kan handle ved at rekruttere koaktivatorer eller corepressorer i enzymatiske veje eller ved at ændre epigenetiske markører deregulerende genekspression10,11,12,13 ,14, med konsekvenser ikke kun for den nuværende generation, men også for sundheden for generationer til at komme8.

Drosophila hormoner

De potentielle virkninger af udvalgte Edc'er er blevet undersøgt bredt, både i dyrearter og i flere modelsystemer, hvor endokrine mekanismer er rimeligt velkendte. For hvirvelløse dyr er endokrine systemer, der påvirker vækst, udvikling og reproduktion, blevet udførligt karakteriseret i insekter af flere årsager, hvilket involverer deres omfattende anvendelse inden for biologisk forskning, deres økonomiske betydning og Endelig udvikling af insekticider i stand til at blande sig specifikt med hormonsystemet af skadedyr insekter.

Især blandt insekter, frugtflue D. melanogaster har vist sig at være en meget kraftfuld modelsystem til at vurdere de potentielle endokrine virkninger af edc'er. I D. melanogaster, såvel som i hvirveldyr, spiller hormoner en vigtig rolle i hele livscyklussen. I denne organisme, der er tre vigtigste hormonelle systemer, som involverer steroid hormon 20-hydroxyecdysone (20E)15,16, sesquiterpenoid juvenil hormon (JH)17, og Neuro peptider og peptid/protein hormoner18. Denne tredje gruppe består af flere peptider opdaget for nylig, men klart involveret i et stort udvalg af fysiologiske og adfærdsmæssige processer, såsom lang levetid, homøostase, metabolisme, reproduktion, hukommelse, og lokomotor kontrol. 20E er homologe til kolesterol-afledte steroid hormoner såsom estradiol, mens JH deler nogle ligheder med retinoinsyre; begge af dem er de bedre kendte hormoner i Drosophila19,20. Deres balance er afgørende i at koordinere støbning og metamorfose, samt i at kontrollere flere post-udviklingsmæssige processer, såsom reproduktion, levetid, og adfærd21, således at tilbyde forskellige muligheder for testning endokrine afbrydelse af Drosophila. Yderligere, ecdysteroide hormoner og Jh'er er de vigtigste mål for den såkaldte tredje generations insekticider, der er udviklet til at forstyrre udviklingsmæssige og reproduktive endokrine medierede processer i insekter. Den agonist eller antagonist virkningsmåde af disse kemikalier er velkendt, og dermed kan de tjene som reference standarder for evaluering af virkningerne af potentielle Edc'er om vækst, reproduktion og udvikling af insekter22. F. eks. er methopren, som i vid udstrækning er blevet anvendt til at kontrollere myg og andre akvatiske insekter23,24, en JH agonist og undertrykker 20E-induceret gentransskription og metamorfose.

Ud over hormoner, den nukleare receptor (NR) super familie i Drosophila er også velkendt; Den består af 18 evolutionært bevaret transkription faktorer, der er involveret i at kontrollere hormon-afhængige udviklingsmæssige veje, samt reproduktion og fysiologi25. Disse hormon-NR'er tilhører alle seks undertyper af NR-familien, herunder dem, der er involveret i neurotransmission26, 2 for retinoinsyre NRS, og dem for steroid-NR'er, der i hvirveldyr udgør et af de primære mål for edcs27.

Drosophila som modelsystem til studier af Edc'er

I øjeblikket, på grundlag af molekylære egenskaber, flere miljøagenturer rundt om i verden tillægger potentialet til at blande sig med de endokrine systemer til forskellige menneskeskabte kemikalier. Da Edc'er er et globalt og allestedsnærværende problem for miljøet og for organismer, er det overordnede mål med forskningen på dette område at reducere deres sygdomsbyrde samt at beskytte levende organismer mod deres skadelige virkninger. For at uddybe forståelsen om de potentielle endokrine virkninger af et kemikalie, er det nødvendigt at teste det in vivo. Til dette formål repræsenterer D. melanogaster et gyldigt modelsystem. Til dato er frugtflue blevet flittigt anvendt som in vivo model til at vurdere virkningerne af flere miljømæssige Edc'er; Det er blevet rapporteret, at eksponeringen for flere edc'er, såsom dibutylphthalatfyldte phthalat (DBP)28, Bisphenol a (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-Octylphenol (4-tert-op)29, methylparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31, 32, bis-(2-ethylhexyl) phthalat (dehp)33og 17-α-ethinylestradiol (EE2)34, påvirker metabolisme og endokrine funktioner som i hvirveldyr modeller. Flere grunde har ført til, at det er blevet brugt som model på dette forskningsområde. Ud over en fremragende viden om sine endokrine systemer, yderligere fordele omfatter sin korte livscyklus, lave omkostninger, let manipulerbare genom, en lang historie af forskning, og flere tekniske muligheder (Se FlyBase hjemmeside, http://flybase.org/). D. melanogaster giver også en effektiv model til let at studere Trans generations effekter og befolkningens respons på miljøfaktorer8 og undgår etiske spørgsmål, der er relevante for in vivo-undersøgelser af højere dyr. Desuden, frugtflue deler en høj grad af genbevaring med mennesker, som kan gøre det muligt for Drosophila EDC analyser til at hjælpe med at forudsige eller foreslå potentielle virkninger af disse kemikalier for menneskers sundhed. Ud over at udvide forståelsen om menneskers sundhed virkninger, Drosophila kan bidrage til at vurdere risiciene for EDC eksponering for miljøet, såsom biodiversitet tab og miljøforringelse. Endelig giver frugtfluen den yderligere fordel, at den anvendes i laboratorier, hvor de faktorer, der potentielt påvirker dens udvikling, reproduktion og levetid, kan holdes under kontrol for at tilskrive enhver variation af det stof, der skal testes.

Med dette i tankerne, har vi optimeret enkle og robuste fitness analyser til bestemmelse af EDC effekter på nogle Drosophila hormonelle træk, såsom frugtbarhed/fertilitet, udviklingsmæssige timing, og voksen levetid. Disse analyser har været almindeligt anvendt til nogle edcs23,24,25,26,27. Især har vi brugt følgende protokoller til at vurdere virkningerne af eksponeringen for syntetisk østrogen EE234 og til BPA og til Bisphenol af (BPA F) (ikke-offentliggjorte data). Disse protokoller kan let ændres for at undersøge virkningerne af en given EDC på et tidspunkt, samt de kombinerede virkninger af flere Edc'er i D. melanogaster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. tilberedning af fødevarer

  1. Til vedligeholdelse af lageret og til vækst af larve skal der anvendes et korn mel, der indeholder 3% pulveriseret gær, 10% saccharose, 9% forooked majsmel, 0,4% agar, derefter kaldet majsmel medium (cm).
    1. Sæt 30 g gær i 100 mL ledningsvand, Bring det i kog og lad det koge i 15 min.
    2. Hver for sig blandes godt 90 g forkogt majsmel, 100 g sukker og 4 g agar i 900 mL ledningsvand.
    3. Bring opløsningen i kog, Sænk varmen og kog i 5 minutters omrøring kontinuerligt.
    4. Efter 5 minutter tilsættes den varme gær opløsning og simre i en anden 15 min.
    5. Sluk for varmekilden og lad opløsningen køle til omkring 60 °C.
    6. Tilsæt 5 mL/L 10% methyl4-hydroxybenzoat i ethanol, Bland grundigt og lad det sidde i 10 min.
      Bemærk: Vær forsigtig med mængden af methyl4-hydroxybenzoat, da en høj koncentration af fungicid kan være dødelig for larver.
    7. Mediet dispenseres i hætteglas/flasker: 8 mL i hvert flyve hætteglas (25 mm x 95 mm), 3 mL i hvert flyve hætteglas (22 mm x 63 mm) og 60 mL i hver flue flaske (250 mL).
    8. Dæksel hætteglas med oste bouillon og lad dem tørre ved stuetemperatur (RT) i 24 timer før opbevaring.
    9. Kalibrer eksperimentelt korrekt konsistens og hydrering af CM ved at ændre enten den anvendte agar og/eller køle-/tørrings tiderne.
      Bemærk: ikke-tilsluttede, boxed og indpakkede hætteglas er stabile i ca. 15 dage ved 4 °C.
  2. For Drosophila voksne, brug et medium, der indeholder 10% pulveriseret gær, 10% saccharose, 2% agar, derefter kaldet voksen medium (AM).
    1. 10 g pulveriseret gær blandes, 10 g saccharose, 2 g agar i 100 mL destilleret vand.
    2. Bring blandingen i kog to gange, med en 3 minutters interval, eller indtil agar er opløst, ved hjælp af en mikrobølgeovn.
    3. Når opløsningen afkøles til 60 °C, tilsættes 5 mL/L 10% Methyl4-hydroxybenzoat i ethanol, blandes grundigt og dispenseres i hætteglas (10 mL pr. hætteglas).
    4. Dæksel hætteglas med oste loth og lad dem tørre på RT i 24 timer før opbevaring.
      Bemærk: unplugged, boxed og indpakkede hætteglas er stabile i ca. 15 dage ved 4 °c.
  3. For fecunditet/fertilitet assay, brug Drosophila tomatsaft-cornmeal medium.
    1. Hæld 70 ml varm mad fra majsmel i et 100 ml bægerglas, og tilsæt 30 ml tomatsaft (30% v/v).
    2. Bland grundigt med en foodprocessor og pipet 3 mL i små hætteglas.
    3. Dæksel hætteglas med oste bouillon og lad dem tørre ved RT i 24 timer før opbevaring.
      Bemærk: unplugged, boxed og indpakkede hætteglas er stabile i ca. 15 dage ved 4 °c.
  4. Til embryo opsamling anvendes agar-plader med 3% agar, 30% tomatsauce og 3% sukker.
    Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at lave bobler, når du hælder mediet i pladerne.

2. Drosophila EDC dosering

  1. Forbered en passende stamopløsning, der opløser det valgte EDC i det passende opløsningsmiddel. For EE2 (molekylvægt 296,403) opløses 1,48 g i 10 mL 100% ethanol for at fremstille en 0,5 M stamopløsning og opbevares ved-80 °C.
    Forsigtig: Edc'er betragtes som miljøforurenende stoffer, og der bør træffes forholdsregler i håndteringen af dem.
  2. EE2 stamopløsningen fortyndes i 10% ethanol i vand (v/v) for at opnå en 100 mM opløsning. Der fremkomme næste fortyndinger (0,1 mM, 0,5 mM og 1 mM) i CM fødevarer, begyndende med den laveste koncentration og med den samme endelige koncentration af solvens for hver behandlingsgruppe. For kontrolglassene anvendes samme volumen af solvensen alene.
    Bemærk: det anbefales at holde den endelige koncentration af solvensen så lav som muligt, idet der tages hensyn til, at den endelige koncentration af ethanol ikke må overstige 2% i flue foder.
  3. Der tilsættes en opløsning, der indeholder den rette fortynding af det valgte EDC til fødevaren, der er baseret på majs, før størkning, blandes grundigt med en foodprocessor, dispenseres med 10 mL i hætteglassene, dækkes med bomulds gaze og tørres ved RT i 16 timer, før det tages i brug.
    Bemærk: brug dette medium umiddelbart efter tilberedningen.
  4. Til voksen opdræt forberedes forskellige arbejds EE2 opløsninger (henholdsvis 10 mM, 50 mM og 100 mM) i 10% ethanol i vand (v/v) og lag 100 μL af hver på overfladen af AM for at opnå den ønskede koncentration af EE2 (0,1 mM , 0,5 mM og 1 mM). Til kontrol brug samme volumen af solvensen alene.
    Bemærk: alternativt tilsættes opløsningen med den højre fortynding af det valgte EDC til en lille mængde am i et 50 ml konisk rør, hvirvlen grundigt og stratificerer 1 ml af det på overfladen af am-hætteglassene.
    1. Dæksel hætteglas med bomulds gaze, tillade tørring ved RT for 12-16 h under blid agitation og bruge dem straks.
      Bemærk: tørringsprocessen skal justeres eksperimentelt, fordi den er afhængig af den omgivende luftfugtighed.
  5. Til fodring assay tilsættes både opløsningen, der indeholder den højre fortynding af det valgte EDC (EE2 0,1 mM, 0,5 mM og 1 mM) og en farvning fødevarer (f. eks det røde farvestof No. 40 ved 1 mg/mL)35 til cm før størkning, blandes kraftigt med en foodprocessor og derefter fjerner e i hætteglas.

3. opdræt fluer

  1. Brug en robust isogene stamme, som Oregon R, vedligeholdes af flere generationer i laboratoriet.
  2. Hold fluer i en furet, temperaturkontrolleret inkubator, med en naturlig 12 t lys: 12 h mørk fotoperiode ved 25 °C i hætteglas, der indeholder CM mad.
  3. I hver analyse anvendes hætteglas ved RT.

4. fodring analyse

Bemærk: Denne analyse anbefales at teste, hvis tilstedeværelsen af den valgte EDC i mediet kunne påvirke fodring af fluer.

  1. Put 15 unge fluer i hætteglas, der indeholder CM suppleret med forskellige koncentrationer af det valgte EDC og en farvning fødevarer. Tillad fluer at fodre på mediet i 1 dag.
    Bemærk:for eksempel anvendes rødt farvestof nr. 4035 (1 mg/ml).
  2. Put 15 unge fluer i hætteglas, der indeholder CM suppleret med opløsningsmidlet alene og en farvning fødevarer til kontrol. Tillad fluer at fodre på mediet i 1 dag.
  3. Anesthetize individuelt hver gruppe af fluer med ether.
    1. Overfør fluer af hver gruppe til en cylindrisk glasbeholder (etherizer) med en tragt indsat i den åbne ende, inverterer hætteglasset over tragten og forsigtigt tappe de to containere sammen for at gøre fluerne falder i etherizer.
      Bemærk:  Tragten vil forhindre dem i at komme ud af etherizer.
    2. Banke flyver ned ved forsigtigt at tappe etherizer på en blød overflade, såsom en mus-pad, og hurtigt udskifte tragten med en ether-gennemblødt bomuld og gaze stik.
    3. Vent ca. 1 min. indtil fluerne falder til bunden og stopper med at bevæge sig.
      Bemærk: må ikke overskride den tid eller fluer vil dø.
  4. Put immobiliserede fluer under et stereo-mikroskop og Sammenlign abdominal farvning af hver behandlingsgruppe med hensyn til kontrolgruppen.

5. fecunditet/fertilitets analyse

  1. For hver EDC-koncentration forberedes 3 hætteglas med fluer, derefter kaldet forældre hætteglas, med 8 hunner og 4 hanner i 10 mL CM/EDC fødevarer; til kontrol forberede 6 hætteglas fluer med 8 hunner og 4 hanner i 10 mL CM mad suppleret med opløsningsmiddel. Bag fluer i en inkubator ved 25 °C.
    Bemærk: undgå overbelægning af larver under deres udvikling, og forsøg at anvende ensartede larve tætheder på tværs af behandlingerne.
  2. Efter 4 dage, fjerne forældre og returnere hætteglassene i inkubator for 5 flere dage.
  3. I den sene eftermiddag på dagen 9, fjerne alle nye fluer fra hætteglassene og sætte hætteglassene i en inkubator ved 18 °C natten.
    Bemærk: Denne fjernelse skal gøres meget omhyggeligt, kontrol af overfladen af mediet godt.
    1. Om morgenen på dag 10, for hver behandlingsgruppe, indsamle jomfru hunner og unge hanner i to grupper, under lys CO2 anæstetisering. Tilfældigt underopdele hver gruppe af fluer i små undergrupper (10 hunner og 20 hanner pr. hætteglas) i uafhængige hætteglas fyldt med frisk tilsvarende CM.
      1. Gentag trin 5.3.1 pas på både omhyggeligt at fjerne alle fluer fra hætteglassene 8-10 h før opsamling og efterlade hætteglas ved 18 °C, indtil der opnås mindst 30 jomfru hunner og 30 hanner for hver EDC koncentrationer og mindst 90 jomfru hunner og 90 hanner til kontrol.
    2. Huset disse grupper af fluer ved 25 °C, indtil de er i alderen 4 dage efter eclosion, overføre dem til nye hætteglas, der indeholder frisk tilsvarende medium hver to dage.
      Bemærk: 4 dage er tilstrækkelig tid for fluerne til at blive modne voksne, men det er meget langt fra begyndelsen af senescens.
    3. Efter to dage skal det sikres, at der ikke er nogen larver i hætteglassene af hunner. Hvis de gør, fluerne er ikke brugbare, fordi de ikke er jomfruer og skal kasseres.
  4. Brug 20 enkelt fluer af hvert køn for hver behandlingsgruppe til at oprette 20 enkelt krydser i små hætteglas indeholdende frisk CM-tomat medium uden EDC, som beskrevet nedenfor.
    1. Til hver behandlingsgruppe tildeles en anden serie af sekventielle tal, som entydigt identificerer den og mærker de respektive hætteglas; f. eks. Gruppe1 (solvens alene) fra 1 til 20, gruppe 2 (EDC-koncentration x) fra 20 til 40 og så videre.
    2. Lav et fertilitets regneark for at registrere de forskellige serier, der hver svarer til en behandlingsgruppe.
    3. For hvert køn bedøve alle fluer, der tilhører hver behandlingsgruppe under lys CO2 og tilfældigt overføre dem som følger.
      1. Overfør én solvent behandlet kvinde til et lille hætteglas, der indeholder frisk CM-tomat medium uden EDC, og tilsæt en solvent behandlet mand til kontrol korset.
        Bemærk: tomatsaft bør tilsættes til medium under tilberedningen, fordi mørkt medium øger kontrasten med de hvide embryoner.
      2. Overfør en EDC-behandlet kvinde til et lille hætteglas, der indeholder frisk CM-tomat uden EDC, og tilsæt én solvent behandlet mand til hver behandling.
      3. Overfør en EDC-behandlet mand til et lille hætteglas, der indeholder frisk CM-tomat-medium uden EDC, og tilsæt én solvent behandlet kvinde til hver behandling.
    4. Hus alle disse enkelt Kors ved 25 °C.
  5. Overfør hvert parrings par til friske CM-tomat hætteglas uden EDC hver dag i de efterfølgende ti dage. Mærk de replikerede hætteglas i hver serie sekventielt; f. eks. 1-a, 1b, 1c...... 20A, 20b, 20c og rapportere disse tal på fertilitets regnearket.
  6. Visuelt inspicere hvert hætteglas hver dag for æggene og rapportere deres antal på fertilitets regnearket.
  7. Gem hvert hætteglas og, når nye fluer begynder at dukke op, også registrere det daglige antal voksne progenier i løbet af 10 dage periode. Efter 10 dage fra den indledende parring, fjerne forældrene.
    Bemærk: kassér hætteglasset, hvor den ene eller begge forældre døde; i tilfælde af flugt fra den ene eller begge forældre, inkludere i analysen alle data indtil den dag, hvor de var gået tabt.
  8. Summen af det daglige antal æg og det daglige antal voksne afkom fra hver behandlingsgruppe for at opnå den totale frugtbarhed/fertilitet, det gennemsnitlige æg og den voksne afkom med en flue i ti dage og forholdet mellem det samlede afkom og det samlede antal æg, der er lagt. Beregn forskellene i procent af hver behandlings værdi i forhold til kontrolelementet.
  9. Udfør tre uafhængige eksperimenter for hver gruppe af fluer, ved at bruge mindst 10 fluer for hver behandlingsgruppe.
  10. Udfør statistisk analyse for at sammenligne de forskellige grupper.

6. udviklingsmæssig timing

Bemærk: I de to følgende alternative protokoller evalueres den udviklingsmæssige timing ved at tælle både antallet af pupper, der dannes pr. dag, og antallet af voksne afkom pr. dag.

  1. Protokol for eclosion-analyse 1
    1. For hver behandlingsgruppe, oprette 10 hætteglas af unge (< 2 dage), raske fluer, hver med 6 hunner og 3 hanner i 10 ml majsmel mad uden EDC.
    2. Lad fluer på mad i 24 timer, og give dem mulighed for at parre sig.
    3. Der tilberedes 10 parallelle hætteglas pr. behandlingsgruppe med 10 mL af hver frisk kornmelmad suppleret med forskellige EDC-koncentrationer eller solvensen alene til kontrol. Transfer parret flyver til disse nye hætteglas.
      Bemærk: for hver behandlingsgruppe tildeles en anden serie af sekventielle numre, som entydigt identificerer den og mærker de respektive hætteglas.
    4. Lav et udviklings regneark for at optage de forskellige serier.
    5. Lad fluer til at lægge æg til 16 h. Fjern derefter forældrene fra hætteglassene.
      Bemærk: Den forælder fluer kan bruges til at gentage trin 6.1.5, ved at overføre dem til andre tilsvarende hætteglas.
    6. Der inkube hætteglas i 3-4 dage ved 25 °c, eller indtil der ikke er flere pupper-former. Hver dag tæller antallet af nypupper i hvert hætteglas og rapporterer det på det udviklingsmæssige regneark. For at undgå at tælle den samme Pupa to gange, skal du skrive et nummer i rækkefølge ved hver Pupa med en permanent markør på ydersiden af hætteglasset.
    7. Startende fra dag 9, tælle dagligt antallet af nye voksne indtil ikke flere voksne dukket op, og rapportere det på det udviklingsmæssige regneark.
    8. Ud fra disse rådata beregnes den gennemsnitlige larve periode, den gennemsnitlige puppe-periode, samt forskellene i procentdelen af hver behandling med hensyn til kontrol.
    9. Udfør tre uafhængige eksperimenter for hver gruppe af fluer, ved at bruge mindst 5 hætteglas til hver behandlingsgruppe.
    10. Udfør statistisk analyse for at sammenligne de forskellige grupper.
  2. Eclosion-analyse protokol 2
    1. Bageste unge og raske kvindelige (ca. 150) og mandlige (ca. 50) flyver på en samling bur (tabel af materialer) med agar-tomat medium suppleret med frisk bager gær pasta (3 g bager gær i 5 ml vand), derefter kaldet æglæggende bakke, i 2 dage ved 25 °C.
    2. I løbet af disse 2 dage, tillader fluer at akklime til buret i et mørkt, roligt sted, før du begynder ægsamling, og ændre lægge bakken to gange om dagen.
    3. På den tredje dag, ændre lægge bakken tidligt om morgenen. Efter 1 h, Udskift den æglæggende bakke, kassere disse lagt æg.
    4. Lad fluer til at lægge æg til 2 h og erstatte med frisk æglæggende bakke.
      Bemærk: Ved dag 3, en god æglæggende bakke skal producere 100-200 æg i 2 h.
    5. For hver behandlingsgruppe, forberede en serie af 3 60 mm retter, der indeholder tomat majsmel mad suppleret med den tilsvarende EDC koncentration eller med opløsningsmiddel alene og rapportere hver serie i udviklingsmæssig timing regneark. Alternativt, hvis det foretrækkes, brug hætteglas i stedet for retter.
    6. Saml forsigtigt æg under et mikroskop ved hjælp af en pensel eller en sonde og overfør dem til toppen af mediet i hver skål/hætteglas. For at lette optælling, på lægge bakken, arrangere æg i 5 grupper af 10 hver og overføre dem en ad gangen.
      Bemærk: Gentag trin 6.2.4 så mange gange, som det er nødvendigt for at få tilstrækkeligt med embryoner.
    7. Hus alle disse retter/hætteglas ved 25 °C. Opbevar også hver lægge bakke ved 25 °C, og Tæl det samlede antal æglagte æg.
    8. Efter 24-30 h, check hver skål/hætteglas under en stereo mikroskopi og tælle både antallet af hvide, ubefrugtede æg og antallet af mørke døde embryoner.
    9. Antallet af hvide, ubefrugtede æg trækkes fra de 50 overførte æg for at opnå den samlede værdi af embryonerne pr. fad/hætteglas. Antallet af mørke døde embryoner kan bruges til at bestemme potentielle EDC toksiske virkninger under embryogenese.
    10. Gentag trin 6.1.6-6.1.10 af Eclosion-assay protokol 1.

7. levetid protokol

  1. Sæt 20 hætteglas fluer med 8 hunner og 4 hanner og hus ved 25 °C i CM (10 mL hver).
  2. Efter 4 dage kasseres fluer og anbringes hætteglassene tilbage i inkubatoren.
    Bemærk: disse fluer kan bruges til at starte forfra for at få andre alders synkroniserede kohorter af fluerne.
  3. I den sene eftermiddag på dagen 9, fjerne alle nye fluer fra hætteglassene og returnere hætteglas til inkubator.
    Bemærk: et par voksne bør begynde at eclose så tidligt som den niende dag; kassere disse fluer gør det muligt at indsamle et maksimalt antal synkroniserede fluer, undgå den skødesløse udvælgelse af tidlige emergent.
  4. 16-24 h senere, overføre de voksne fluer (1 dag gammel) af begge køn i fire grupper af 250 mL flasker indeholdende AM mad suppleret med tre forskellige EDC koncentrationer og en med opløsningsmidlet alene. Hvis det er nødvendigt, indsamle en anden batch den næste dag.
  5. Vedligehold fluer ved 25 °C i 2-3 dage for at give dem mulighed for at parre sig.
    Bemærk: dagen for overførsel til am Food hætteglas svarer til den første dag i voksenalderen.
  6. Efter to-tre dage, sortere hver kohorte af fluer med sex i to grupper under lys CO2 anæstetisering. Tilfældigt underopdele hvert køn i fem hætteglas per behandling med en densitet på 20 individer pr. hætteglas, indtil der er tre replikater af 5 parallelle hætteglas for hvert køn pr hver behandling.
    Bemærk: Arbejd med små grupper af fluer for at forhindre mulige langvarige helbredsproblemer på grund af lang eksponeringstid til CO2.
  7. Forbered et levetid regneark, hvor antallet af døde fluer fratrækkes antallet af overlevende fluer til den tidligere overførsel, på en sådan måde, at automatisk få antallet af overlevende ved hver overførsel.
  8. Transfer flyver til nye hætteglas, der indeholder den tilsvarende mad hver 3 dage på samme tid og kontrollere for døden.
    Bemærk: overførslen skal finde sted uden anæstesi, der kan have en langsigtet negativ effekt på flyve levetid.
    1. Ved hver overførsel, registrere alder af fluer og antallet af døde fluer.
      Bemærk: antallet af overlevende fluer beregnes automatisk i regnearket, men det anbefales at kontrollere det visuelt. Fluer, der ved et uheld både undslippe eller dø under overførslen bør ikke overvejes. Vær omhyggelig med ikke at tælle to døde fluer, der transporteres til det nye hætteglas, der rapporterer denne note i regnearket.
    2. Gentag trin 7,8 og 7.8.1, indtil alle fluer dør.
  9. For hver behandlingsgruppe, oprette en overlevelses kurve som vist i figur 6, for at vise overlevelse sandsynlighed for en flue på et bestemt tidspunkt.
  10. Udføre tre uafhængige eksperimenter for hver behandling gruppe af fluer, ved hjælp af 100 nyligt eclosed fluer for hvert eksperiment.
  11. Forbered et bord til at rapportere den gennemsnitlige levetid (gennemsnitlige overlevelses dage for alle fluer for hver gruppe), den halve død tid (tidsperiode i dage, der kræves for at nå 50% dødelighed) og den maksimale levetid (maksimale antal dage, der er nødvendige for at nå 90% dødelighed).
  12. Beregn forskellene i procent mellem hver behandlingsgruppe i forhold til kontrolgruppen.
  13. Udfør statistisk analyse for at sammenligne de forskellige behandlingsgrupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette afsnit rapporteres de vigtigste trin i ovennævnte protokoller i form af forenklede ordninger. I betragtning af at fluer har tendens til at undgå ubehagelige forbindelser, den første ting at gøre, er at assay smagen af den valgte EDC. Dette kan gøres ved at blande en fødevare farve (for eksempel, rød mad Dye No. 40)35 med den mad suppleret med den valgte EDC i forskellige doser eller med opløsningsmidlet alene. Fluer fodret på disse medier er undersøgt under en stereo mikroskopi og fødeindtagelse er anslået ved deres abdominal farve (figur 1). En typisk ønsket situation er vist i figur 1 med to voksne hunner: en fodret på medium, der indeholder det valgte EDC og en på medium, der ikke indeholder EDC, begge præsenterer samme farvning i deres Abdomens.

Det er blevet almindeligt accepteret, at Edc'er, ligesom naturlige hormoner, har virkninger ved ekstremt lave doser, og at der ikke er en enkel, lineær sammenhæng mellem dosis og virkning29, med højere doser ikke nødvendigvis har en større effekt36, 37af Så i stedet for en dosis-respons tilgang, for at vurdere fuldt ud deres virkninger, er det tilrådeligt at bruge flere doser, begyndende fra relevante koncentrationer for miljøet eller for andre organismer. Under alle omstændigheder er det vigtigt at foretage en analyse af EDC-smagen ved hver anvendt koncentration for at sikre, at fluer fordøje sammenlignelige mængder af EDC i hver behandlingsgruppe (figur 2).

Endokrine forstyrrelser påvirker mange vigtige træk af dyrs fysiologi såsom frugtbarhed, levetid, og udvikling, der derfor er nyttige endepunkter til at teste Edc'er. For de ovennævnte protokoller, som vi optimeret til at måle EDC effekter på disse Drosophila liv træk, primære overvejelser er, at det er bydende nødvendigt at bruge unge og sunde fluer, der bør være korrekt manipuleret før testning. Med dette i tankerne skal der lægges stor vægt på produktion, håndtering og opbevaring af de brugte fødevarer. Desuden bør der udvises forsigtighed ved anvendelse af det bedste opløsningsmiddel til det valgte EDC ved passende endelige koncentrationer (dvs. mindre end 1% for dimethylsulfoxid [DMSO] og mindre end 2% for ethanol)30.

Fecunditet og frugtbarhed er blevet brugt til at vurdere den reproduktive succes i D. melanogaster. Figur 3 viser et skema over den anvendte protokol. Fecunditet måles eksperimentelt som det samlede antal æglagte æg, mens fertiliteten måles som total voksen afkom. Baseret på den betragtning, at ægproduktion i de første 10 dage af voksenlivet er en god reference for hele voksenlivet æg/afkom produktion af en organisme38,39, frugtbarhed og frugtbarhed analyser kan udføres i 10 dage ved ved hjælp af 4 daggamle fluer udklækket fra de udsatte larver. Det er vigtigt at forsøge at opnå lignende værdier i de parallelle hætteglas i hver gruppe; ellers ville det være vanskeligt at forestille sig, hvilke rør til at fjerne fra analysen. Så, det er tilrådeligt at undersøge dagligt hver replikat hætteglasset for at undgå et stressende miljø, såsom tørret eller flydende fødevarer; startende fra 20 enkelt Kors, anbefales det at opnå mindst 10 hætteglas i gode forhold, hvor begge forældre var i live i 10 dage. Antallet af æg og voksent afkom, der indsamles dagligt, skal rapporteres på et bord som vist i figur 3 og anvendes til at beregne gennemsnittet af æg og udafkom af voksne afkom i 10 dage. Derefter, den frugtbarhed/fertilitet ændre procentdelen af EDC-behandlede fluer i forhold til kontrol fluer kan opnås ved hjælp af følgende formel: frugtbarhed/fertilitet ændring% = [(kontrol-behandling)/Control] x 100. Der skal indhentes mindst tre uafhængige replikater for hver gruppe.

Hormoner spiller vigtige roller i udviklingsmæssige overgange i livet af D. melanogaster40, for hvilke det er sandsynligt, at disse faser af vækst er særligt sårbare over for de negative virkninger af edc'er. Ved 25 °c, både larve vækst og puppe fase hver spænder ca 4 dage. Efter eksponering for EDC kan den gennemsnitlige varighed af disse stadier påvirkes41. Baseret på denne overvejelse, var de udviklingsmæssige timing protokoller optimeret til at bestemme procentdelen og tidspunktet for overgangen fra larver til pupper og fra pupper til voksne efter EDC eksponering med hensyn til ubehandlet fluer. To alternative protokoller kunne udføre denne analyse. Begge var gyldige og baseret på EDC kronisk eksponering for larver over en 4 dages periode. Baseret på denne larve behandling, tog den første protokol ikke hensyn til alder af embryonerne, som blev indsamlet over en 16-18 h periode (overnight). Den deraf følgende alders variation blandt larverne bør dog være til stede i alle hætteglassene i hver behandling, hvilket øger variansen inden for behandlingen, men uden at det påvirker estimaterne af udviklingsmæssig timing gennem behandlingerne væsentligt. I stedet brugte den anden protokol et fast antal synkrone tidlige embryoner, hvilket gjorde det muligt også at evaluere de potentielle virkninger af det valgte EDC under embryo Genesis42,43. Desuden reducerede alders forskellene mellem larverne den inden-behandlings variansen og øgede evnen til at estimere de reelle forskelle mellem behandlingerne. Figur 4 rapporterer en ordning for eclosion-analysen. I begge protokoller skulle pladerne/hætteglassene kontrolleres dagligt, og antallet af både pupper og voksne fra dem, der eksponeres og ikke eksponeres for EDC, skulle indberettes separat på et bord som i figur 4. Alle dannede pupper og voksne fluer måtte tælles, enten døde eller levende. Derefter blev disse rå data brugt til at beregne procenter og tidspunkter for overgangen fra larver til pupper og fra pupper til voksne og til at beregne ændringen procentdel af disse værdier af EDC-behandlede fluer i forhold til kontrol fluer. Efter eksponering for EDC kunne der forventes en overordnet udvikling eller forsinkelse med hensyn til kontrol fluerne. Den valgte protokol skulle udføres i tre eksemplarer for hver gruppe af fluer. Det var tilrådeligt, at for eclosion assay protokol 2, hver serie af en replikat for en given EDC koncentration blev seedet med embryoner fra samme æglæggende Trail for at opretholde pålidelighed og nøjagtighed i embryo iscenesættelse hele EDC koncentrationer.

Endelig viser figur 5 de vigtigste trin til måling af levetid. For denne protokol, var det vigtigt, at alle fluer under analyse var synkront efter alder og køn, sammenkoblet, og holdes på en tæthed lav nok til at tillade fri omsætning. Det er vigtigt at udføre levetid eksperimenter i begge køn separat, fordi det er velkendt, at der er betydelige forskelle i levetid mellem mænd og kvinder44.

Mad skulle skiftes hver 3. dag for at opretholde en sund population, og dødeligheden skulle også vurderes hver 3. På et levetid regneark, som i figur 5, blev antallet af døde fluer rapporteret, og dette antal ville automatisk blive trukket fra antallet af overlevende fluer fra den tidligere overførsel. For hver EDC-koncentration og for opløsningsmidlet alene blev den kumulative overlevelse versus de forløbne dage afbildet for at opnå levetid kurver. En typisk overlevelses kurve er indberettet i figur 6; efter en lang indledende periode, hvor overlevelses kurven forblev relativt høj, faldt den eksponentielt efter ca. 60 dage. Efter eksponering for EDC kan overlevelses kurven for de behandlede fluer påvirkes betydeligt. For at afgøre, om denne effekt skyldes det valgte EDC, var det tilrådeligt at udføre mindst to, eller endnu bedre, tre uafhængige, ikke samtidige replikate eksperimenter.

I hver af ovenstående protokoller var det muligt at have unormale hætteglas (f. eks. uden æg eller unormale dødsfald); disse hætteglas kunne have været opstået af forskellige årsager, såsom dårlig fødevarekvalitet eller infektion, og kunne i væsentlig grad ændre værdierne af foranstaltningerne. Den bedste måde at håndtere disse unormale situationer på var at undgå dem gennem god eksperimentel praksis. Så det skal understreges, at for alle de ovennævnte protokoller, stor og omhyggelig arbejde var påkrævet i replikere hætteglassene, holde fluer sunde, og i håndteringen fluer, der, når de er udsat for et EDC, kan blive delikat, og dermed øge risikoen for døden, når Manipuleret.

Figure 1
Figur 1: fodring assay. Voksne fluer i hætteglas indeholdende CM/Dye suppleret med en valgt EDC (top) eller opløsningsmiddel alene (nederst) er overladt til foder til 24 h. To fluer fodret på medium suppleret med en EDC (top) eller opløsningsmiddel alene (nederst) viser lignende farve på deres Abdomens. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: dosering af EDC. Skematisk af EDC administration til Drosophila af kosten. Voksne fluer fra en isogene bestand udsættes for forskellige koncentrationer af et EDC (top) eller opløsningsmiddel alene (nederst). N = referencekoncentrationen af EDC. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: fertilitets analyse. Skematisk af protokollen, skildrer trinene fra flue vækst i passende medier til jomfru samling og op til enkelt Kors. Trin 1: voksne (10 hætteglas med otte hunner og fire mænd hver) fra en isogene stamme overføres til hætteglas med CM/EDC (top) eller CM/solvens alene (nederst). (Bemærk, at ordningen, for enkelhed, refererer til blot en af de tre hætteglas.) Trin 2: efter 4 dage, er voksne kasseres, og lagt æg er overladt til at udvikle sig i 9 dage, indtil den voksne fase. Trin 3: nyligt eclosed voksne sorteres efter køn og opsamles i hætteglas (maks. 20 hanner/hætteglas og 10 jomfru-hunner/hætteglas). Trin 4: voksne er overladt til alder i 4 dage på det tilsvarende medium af larve vækst. Trin 5: Opsætning af 40 enkelt Kors for EDC-behandlede fluer i CM-tomat medium uden et EDC, 20x en EDC-behandlet mand med en kontrol kvinde og 20x en kontrol mand med en EDC-behandlede kvindelige (top); Opsætning af 20 enkelt Kors for kontrol fluer, 20x en kontrol mand med en kontrol kvinde (bund). Gult medium er en CM suppleret med et EDC (top) eller solvens som kontrol (bund), og rødt medium er en tomat/CM uden et EDC eller opløsningsmiddel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: udviklingsmæssig timing (eclosion assay protokol 2). Til venstre, denne figur viser en ordning af samlingen bur, hvor voksne (omkring 150 kvinder og 50 mænd) er placeret til at akklimatere og parre sig i mørket før aflejrings trinnet (Se protokol). Efter 2 dage, den gamle glidende bakke er erstattet med en med frisk mad, og æggene afsat i den næste 1 h kasseres, fordi de er asynkron. Herefter samles æggene hver 2 h på en ny glide bakke, tælles og anbringes på tallerkener, der indeholder tomat/CM suppleret med et EDC eller med opløsningsmiddel alene. Data (samlede lagt æg, ikke-frigivne æg, pupper, og eclosed voksne) er rapporteret om en række udviklingsmæssige timing regneark (højre). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: levetid analyse. En dag synkroniserede fluer overføres til en 250 mL flaske med voksen mad (AM) suppleret med en EDC (top) eller opløsningsmiddel (bund) som kontrol, for at tillade fodring (venstre i ordningen). Efter 2-3 dage, er fluerne sorteret efter køn og overført til fem hætteglas (indeholdende det tilsvarende medium af start flasken) for hvert køn, i grupper af 20 individer/hætteglas. Hver 3 dage, de voksne er overført til friske hætteglas indtil ikke længere nødvendigt (centrale del af ordningen). Til højre findes et skema i tabellen, hvor dataene registreres for hver dag. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: levetid kurver. Til venstre rapporteres en repræsentativ tabel, hvor antallet af døde fluer er blevet registreret hver 3., både for behandlingsgruppen (medium + EDC [0,05 mM EE2]) og for kontrolgruppen (medium + opløsningsmiddel) i hele forsøgsperioden. Den gennemsnitlige levetid for hver gruppe er blevet beregnet ved hjælp af matrix sum. Af produktet; den behandlede gruppe forkortede den gennemsnitlige levetid i forhold til kontrolgruppen. Til højre vises en typisk overlevelses kurve for hanfluer, der er fodret med medium indeholdende EE2 (0,05 mM) eller kun ethanol til kontrol. Overlevelses kurven faldt hurtigere for behandlede fluer end for kontrolgruppen, med et tidligere vende fald punkt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Frugtflue D. melanogaster er blevet flittigt ansat som et in vivo modelsystem til at undersøge de potentielle virkninger af miljømæssige edc'er såsom DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-op29, MP30, EP31, 32, DEHP33og EE234. Flere grunde har ført til, at det er blevet brugt som model på dette forskningsområde. Bortset fra sine ubestridte fordele som modelsystem, deler Drosophila en høj grad af genbevaring med mennesker, for hvilke Drosophila EDC analyser kan hjælpe med at forudsige eller foreslå potentielle virkninger for menneskers sundhed. Desuden tilhører Drosophila de hvirvelløse dyr, som er bredt repræsenteret i alle økosystemer og kræver større beskyttelsesforanstaltninger mod de skadelige virkninger af Edc'er. Invertebrater er placeret i bunden af fødekæden og udføre meget vigtige funktioner for de miljøer, hvor de bor. Det er blevet rapporteret, at flere Edc'er, der frigives til miljøet, kan have en skadelig indflydelse på udviklingen og gengivelsen af flere dyrearter. Drosophila giver den ekstra fordel, at det anvendes i laboratoriet, hvor de faktorer, der kan påvirke udvikling, reproduktion og levetid, holdes under kontrol for at tilskrive enhver variation af det stof, der skal testes.

Her giver vi detaljerede protokoller for at studere virkningerne af EDC eksponering i denne modelsystem på hormonelt regulerede livs træk såsom frugtbarhed/fertilitet, udviklingsmæssige hastighed, og levetid. Vi har optimeret disse protokoller, der gjorde det muligt at undersøge virkningerne af EE234, BPA, og bpaf (ikke-offentliggjorte data) eksponering, men de kan let tilpasses til at studere virkningerne af andre edc'er. Især kan disse analyser bruges til at undersøge både rene Edc'er og kombinationer af forskellige Edc'er, der mere nøjagtigt gengiver, hvad der sker i naturen. Selv om det tilsyneladende, de kan synes som simple vækst assays, er det vigtigt at arbejde i henhold til de relevante retningslinjer, sikre nøjagtighed og reproducerbarhed45. Det er velkendt, at frugtbarhed, udviklingsmæssige timing, og levetiden i D. melanogaster kan blive påvirket af eksterne og interne faktorer. Disse kritiske faktorer, herunder fotoperiode, temperatur, fugtighed, ernæring, befolkningstæthed, genetiske struktur, og alder, skal nøje kontrolleres for resultatet af de rapporterede protokoller. For at minimere bestanddelen af genetisk variation bør der anvendes en isogene stamme. Denne stamme skal omhyggeligt opdrættes i en befuret, temperaturkontrolleret inkubator, med en naturlig 12 h lys: 12 h mørk fotoperiode ved 25 °C.

Ud over vedligeholdelsen af et kontrolleret miljø skal larve og flyve overbelægning undgås. Det er blevet rapporteret, at larve overbelægning kan påvirke den udviklingsmæssige timing og inducere udtryk for flere gener, herunder varmechok eller immunitet-relaterede gener, der påvirker den samlede egnethed af voksne fluer46. Også, voksne fluer skal opretholdes på en lav nok tæthed til at tillade fri bevægelighed for at minimere voksen stress. Desuden er det vigtigt at sikre, at fluer forbruge sammenlignelige mængder af EDC i hver behandlingsgruppe, idet der tages hensyn til smagen af stoffet i forskellige koncentrationer, fordi fluer har tendens til at undgå ubehagelige fødevarer. Et andet vigtigt aspekt af disse protokoller er fødevarekvalitet; maden skal også se godt ud, blottet for bobler, bakterier revner, og så på47,48. Desuden er det nødvendigt at huske på synkronisering, parring status, og køn samliv for fluer, der skal testes. I alle de rapporterede protokoller er det vigtigt, at de parallelle hætteglas, der analyseres, skal være meget ens; ellers ville det være vanskeligt at forstå, hvilke der skal kasseres, så der er behov for maksimal opmærksomhed og god eksperimentel praksis. Endelig, ved at bruge disse protokoller til at vurdere de endokrine virkninger af udvalgte Edc'er, er det vigtigt at tage hensyn til mulige interaktioner med andre Edc'er til stede i mediet, såsom methyl4-hydroxybenzoat eller BPA af plastik hætteglassene. I denne forstand, det kunne være nyttigt at ændre det svampedræbende middel, bruge glas hætteglas, eller udføre pilot analyser både med og uden mulige kontaminanter.

De rapporterede Drosophila analyser kan være meget effektiv til vurdering af eventuelle kemikalier eller blanding af kemikalier, såsom edc'er, ved at evaluere de potentielle virkninger på hormonelt regulerede livs træk, såsom reproduktion, udvikling, og levetid. Disse analyser kan dog ikke tjene til klart at identificere den endokrine mekanisme, der er ansvarlig for EDC-bivirkningerne. For at overvinde denne begrænsning er det muligt at udføre de samme protokoller ved hjælp af reference-Edc'er, der fremkalder responser, der er repræsentative for en bestemt virkningsmåde på det insekt endokrine system (f. eks. tredje generations insekticider, der arbejder som JH eller ecdysteroide agonist/antagonist)22. Alternativt er det også muligt at anvende molekylære endepunkter, udføre Molekylær analyse af specifikke gener, der er hormonelt regulerede, og som betragtes som forudsigende og specifikke biomarkører for endokrine forstyrrelser34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Orsolina Petillo for teknisk support. Forfatterne takker Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) for bibliografisk støtte. Forfatterne takker Dr. Gustavo Damiano Mita for at introducere dem til EDC verden. Forfatterne takker Leica Microsystems og Pasquale Romano for deres assistance. Denne forskning blev støttet af Project PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate Alla Rigenerazione e ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica i Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Projekt PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17α-Ethinylestradiol Sigma E4876-1G
Agar for Drosophila medium BIOSIGMA 789148
Bisphenol A Sigma 239658-50G
Bisphenol AF Sigma 90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl ether Sigma
Drosophila Vials BIOSIGMA 789008 25 mm x 95 mm
Drosophila Vials BIOSIGMA 789009 29 mm x 95 mm
Drosophila Vials Kaltek 187 22 mm x 63 mm
Embryo collection cage Crafts Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol FLUKA 2860
Etherizer Crafts cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle 250 mL Bottles
Glass Vials Microtech ST 10024 Flat bottom tube 100 x 24
Hand blender Pimmy Ariete food processor
Instant Success yeast ESKA Powdered yeast
Laying tray Crafts plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate SIGMA H5501
Petri Dish Falcon 351016 60x5
Red dye no. 40 SIGMA 16035
Stereomicroscope with LED lights Leica S4E
Sucrose HIMEDIA MB025
Tomato sauce Cirio

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. Kareiva, P. M., Marvier, M. , Roberts and Company Publishers. Greenwood Village, CO. 460-509 (2011).
  2. Zoeller, R. T., et al. Endocrine-disrupting chemicals and public health protection: a statement of principles from The Endocrine Society. Endocrinology. 153 (9), 4097-4110 (2012).
  3. Guillette, J., Gunderson, M. P. Alterations in development of reproductive and endocrine systems of wildlife populations exposed to endocrine-disrupting contaminants. Reproduction. 122, 857-864 (2001).
  4. Guillette, L. J. Endocrine disrupting contaminants-beyond the dogma. Environmental Health Perspectives. 114, 9-12 (2006).
  5. Liao, C. S., Yen, J. H., Wang, Y. S. Growth inhibition in Chinese cabbage (Brassica rapa var. chinensis) growth exposed to di-n-butyl phthalate. Journal of Hazardous Materials. 163, 625-631 (2009).
  6. Qiu, Z., Wang, L., Zhou, Q. Effects of Bisphenol A on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence in above-ground organs of soybean seedlings. Chemosphere. 90, 1274-1280 (2013).
  7. Wang, S., et al. Effects of Bisphenol A, an environmental endocrine disruptor, on the endogenous hormones of plants. Environmental Science and Pollution Research. 22, 17653-17662 (2015).
  8. Quesada-Calderón, S., et al. The multigenerational effects of water contamination and endocrine disrupting chemicals on the fitness of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 7, 6519-6526 (2017).
  9. Bergman, A., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. The State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012. , United Nations Environment Programme and the World Health Organization. (2013).
  10. Bachega, T. A. S. S., Verreschi, I. T., Frade, E. M. C., D’Abronzo, F. H., Lazaretti-Castro, M. The environmental endocrine disruptors must receive the attention of Brazilian endocrinologists. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 55, 175-176 (2011).
  11. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127, 204-215 (2011).
  12. Lee, S. B., Choi, J. Effects of Bisphenol A and Ethynyl estradiol exposure on enzyme activities, growth and development in the fourth instar larvae of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 68, 84-90 (2007).
  13. Vos, J. G., et al. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Critical Reviews in Toxicology. 20, 71-133 (2000).
  14. Costa, E. M. F., Spritzer, P. M., Hohl, A., Bachega, T. A. S. S. Effects of endocrine disruptors in the development of the female reproductive tract. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 58 (2), 153-161 (2014).
  15. Thummel, C. S. From embryogenesis to metamorphosis: the regulation and function of Drosophila nuclear receptor superfamily members. Cell. 83, 871-877 (1995).
  16. Schwedes, C. C., Carney, G. E. Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 58, 293-302 (2012).
  17. Flatt, T., Kawecki, T. J. Pleiotropic effects of methoprene-tolerant (Met), a gene involved in juvenile hormone metabolism, on life history traits in Drosophila melanogaster. Genetica. 122, 141-160 (2004).
  18. Nassel, D. R., Winther, A. M. E. Drosophila neuropeptides in regulation of physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 92, 42-104 (2010).
  19. Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annual Review of Entomology. 47, 467-500 (2002).
  20. Gáliková, M., Klepsatel, P., Senti, G., Flatt, T. Steroid hormone regulation of C. elegans and Drosophila aging and life history. Experimental Gerontology. 46, 141-147 (2011).
  21. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in Drosophila. Trends in Endocrinology & Metabolism. 11, 276-280 (2000).
  22. Weltje, L. Techniques for Measuring Endocrine Disruption in Insects. Endocrine Disrupters: Hazard Testing and Assessment Methods. Matthiessen, P. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 100-115 (2013).
  23. Zou, Z., et al. Juvenile hormone and its receptor, methoprene-tolerant, control the dynamics of mosquito gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), E2173-E2181 (2013).
  24. Zhao, W. L., et al. Methoprene-tolerant 1 regulates gene transcription to maintain insect larval status. Journal of Molecular Endocrinology. 53 (1), 93-104 (2014).
  25. Mangelsdorf, D. J., et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83, 835-839 (1995).
  26. Bate, M., Martinez Arias, A. Hormones and Drosophila development. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 899-939 (1993).
  27. Watts, M. M., Pascoe, D., Carroll, K. Chronic exposure to 17a-ethinylestradiol and bisphenol A-effects on development and reproduction in the freshwater invertebrate Chironomus riparius (Diptera: chironomidae). Aquatic Toxicology. 55, 113-124 (2001).
  28. Atli, E. The effects of dibutyl phthalate (DBP) on the development and fecundity of Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 93, 164-171 (2010).
  29. Atli, E. The effects of three selected endocrine disrupting chemicals on the fecundity of fruit fly, Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 9, 433-437 (2013).
  30. Gu, W., Xie, D. J., Hou, X. W. Toxicity and estrogen effects of methylparaben on Drosophila melanogaster. Food Science. 30, 252-254 (2009).
  31. Liu, T., Li, Y., Zhao, X., Zhang, M., Gu, W. Ethylparaben affects lifespan, fecundity, and the expression levels of ERR, EcR and YPR in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 71, 1-7 (2014).
  32. Chen, Q., Pan, C., Li, Y., Zhang, M., Gu, W. The Combined Effect of Methyl- and Ethyl-Paraben on Lifespan and Preadult Development Period of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 1-8 (2016).
  33. Cao, H., Wiemerslage, L., Marttila, P. S., Williams, M. J., Schioth, H. B. Bis-(2-ethylhexyl) Phthalate Increases Insulin Expression and Lipid Levels in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 119, 309-316 (2016).
  34. Bovier, T. F., Rossi, S., Mita, D. G., Digilio, F. A. Effects of the synthetic estrogen 17-α-ethinylestradiol on Drosophila T melanogaster: Dose and gender dependence. Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 625-632 (2018).
  35. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147, 433-437 (1982).
  36. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and non- monotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33, 378-455 (2012).
  37. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Mini Review: Drosophila melanogaster as a Promising Model Organism in Toxicological Studies. Archives of Basic and Applied. 1, 33-38 (2013).
  38. Yesilada, E. Genotoxic Activity of Vinasse and Its Effect on Fecundity and Longevity of Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 63, 560-566 (1999).
  39. Atli, E., Ünlü, H. The effects of microwave frequency electromagnetic fields on the fecundity of Drosophila melanogaster. Turkish Journal of Biology. 31, 1-5 (2007).
  40. Flatt, T., Tu, M., Tatar, M. Hormonal pleiotropy and the juvenile hormone regulation of Drosophila development and life history. BioEssays. 27, 999-1010 (2005).
  41. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental Toxicity Assays Using the Drosophila Model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1-27 (2015).
  42. Fletcher, J. C., Burtis, K. C., Hogness, D. S., Thummel, C. S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone. Development. 121, 1455-1465 (1995).
  43. Giordano, E., Peluso, I., Senger, S., Furia, M. minifly, A Drosophila Gene Required for Ribosome Biogenesis. The Journal of Cell Biology. 144 (6), 1123-1133 (1999).
  44. Tower, J., Arbeitman, M. The genetics of gender and life span. The Journal of Biology. 8, 38 (2009).
  45. Digilio, F. A., et al. Quality-based model for Life Sciences research guidelines. Accreditation and Quality Assurance. 21, 221-230 (2016).
  46. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. Journal of Insect Physiology. 47, 1301-1307 (2001).
  47. Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (71), e50068 (2013).
  48. Weltje He, Y., Jasper, H. Studying aging in Drosophila. Methods. 68, 129-133 (2014).

Tags

Udviklingsbiologi Drosophila melanogaster endokrine forstyrrende stof kemikalier frugtbarhed fertilitet udvikling levetid
Metoder til test endokrine forstyrrelser i <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovier, T. F., Cavaliere, D.,… More

Bovier, T. F., Cavaliere, D., Colombo, M., Peluso, G., Giordano, E., Digilio, F. A. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59535, doi:10.3791/59535 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter