Summary
Presentato qui è un protocollo per la misurazione delle cellule CD4 - T proliferanti in risposta a proteine antigeniche o peptidi utilizzando la diluizione del tinri. Questo analisi è particolarmente sensibile alle rare cellule T specifiche dell'antigene e può essere modificato per facilitare la clonazione delle cellule specifiche dell'antigene.
Abstract
Descritto è un metodo semplice, in vitro, basato sulla diluizione dei coloranti per misurare la proliferazione delle cellule T specifiche dell'antigene nelle cellule mononucleari del sangue periferico umano (PMC). Lo sviluppo di coloranti stabili, non tossici e fluorescenti come carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) consente di distinguere le cellule T rare e specifiche dell'antigene dai bystander per diminuzione della colorazione fluorescente, come rilevato dalla citometria di flusso. Questo metodo presenta i seguenti vantaggi rispetto agli approcci alternativi: (i) è molto sensibile alle cellule T a bassa frequenza, (ii) non è richiesta alcuna conoscenza dell'antigene o dell'epitopo, (iii) il fenotipo delle cellule rispondenti può essere analizzato e (iv) vitale, rispondente, rispondendo le cellule possono essere ordinate e utilizzate per ulteriori analisi, come la clonazione delle cellule T.
Introduction
La capacità di rilevare e studiare le cellule T specifiche dell'antigene è importante negli studi sull'immunità mediata dalle cellule. Tuttavia, in questo modo è particolarmente difficile per il CD4 specifico di autoantigen- risposte delle cellule T, che sono molto deboli e difficili da rilevare. Un metodo comune utilizzato per la rilevazione della proliferazione dei linfociti specifici dell'antigene è [3H]-thymidine, che è un nucleotide radioetichettato incorporato nel DNA delle cellule che proliferano. Anche se l'analisi [3H]-timinano può rilevare la sintesi del DNA, questo metodo è una misura indiretta della divisione cellulare, perché la sintesi del DNA può avviare indipendentemente dalla mitosi (cioè durante la duplicazione genica e l'apoptosi1). Questo problema è aggravato dal fatto che la proliferazione delle cellule specifichedell'antigene può provocare una notevole apoptosi 2, portando a una potenziale sopravalutazione della proliferazione specifica dell'antigene. Inoltre, il metodo [3H]-thymidine non fornisce informazioni fenotipiche per la proliferazione dei linfociti, come cd4o CD8- proliferazione del lignaggio nei PBMCC stimolati con peptidi antigenici.
Nel 2003, abbiamo pubblicato il primo saggio di diluizione del colorone utilizzando CFSE, chiamato il saggio di proliferazione basato su CFSE3,4. CFSE è un tinrito fluorescente che si lega stabilmente alle proteine intracellulari formando un legame covalente ai residui di lisina intracellulare. Poiché le proteine con etichetta CFSE sono divise equamente tra le cellule figlie3, le cellule che si sono divise possono essere distinte dalle cellule indivise per citometria di flusso, il che consente anche la fenotipizzazione quantitativa delle popolazioni di linfociti. Infatti, il numero di divisioni che una cellula ha subito dal momento della colorazione CFSE può essere misurato in una certa misura5. Più recentemente, sono stati sviluppati molti coloranti simili come cellTrace Violet proliferation colorante (VPD) e CytoTrack colorante, che funzionano in modo simile6. Questo protocollo si concentra su CFSE, ma i principi si applicano ugualmente ad altri coloranti correlati.
La colorazione del tetramer Peptide-MHC è un metodo ampiamente utilizzato per rilevare e clonare cellule CD8- T specifiche dell'antigene. Questo è un metodo ben consolidato7,8,9,10; tuttavia, la clonazione basata su tetramer richiede una conoscenza esistente della restrizione epitope/MHC e ogni epitopo richiede un proprio tetramero11, che limita l'ambito di scoperta e clonazione di nuove cellule T specifiche dell'epitopo. La proliferazione basata su CFSE può essere utilizzata con peptidi, proteine o lismi cellulari. Il protocollo qui descritto è semplice e robusto, e il rispondente CD4- t cellule possono essere ordinati per l'uso in saggi di caratterizzazione funzionale e biochimica a valle12,13.
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Protocol
Tutti i soggetti hanno dato il consenso informato prima della raccolta del sangue periferico. L'approvazione etica per gli esperimenti con PBMC è stata data da St. Vincent's Hosptial (HREC-A 135/08 e HREC-A 161/15).
1. Preparazione del reagente
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Supporti di cellule T umane
- Preparare i supporti RP-5 per la coltura PBMC, che consiste di RPMI 1640, 1x aminoacidi non essenziali, L-alanyl-L-glutamine dipeptide (2 mM), penicillina (100 U/mL)/streptomycin (0,1 mg/mL) e 5% di siero umano in pool (PHS).
-
Soluzioni azionarie CFSE
- Preparare uno stock master sciogliendo 25 mg di CFSE in 9 mL di DMSO per ottenere una soluzione di stock finale con una concentrazione di 5 mM.
- Preparare un'azione di lavoro diluindo lo stock principale in PBS per raggiungere una concentrazione di lavoro di 10 M.
2. Preparazione di PFC umani da tutto il sangue
- Ci sono generalmente tra 0,5–1,5 x 106 PBMC/mL di sangue periferico umano. Pertanto, la quantità di sangue necessaria dipende dal numero desiderato di PMC. Diluire il sangue periferico umano con PBS almeno 1:2. Separare i PBMC aggiungendo 15 mL di gradiente medio di densità a un tubo da 50 mL, quindi sovrapporre 35 mL di sangue intero diluito.
- Centrifuga a 850 x g per 15 min senza decelerazione a temperatura ambiente (RT). Questo si tradurrà in tre strati chiari: lo strato inferiore contenente il pellet di globuli rossi, strato intermedio di grado di densità medio con globuli bianchi che riveste la sua interfaccia superiore, e superiore strato plasmatico14.
- Rimuovere circa 20 mL dello strato superiore di plasma. Raccogliere lo strato di globuli bianchi, facendo attenzione a evitare il pellet di globuli rossi. Lavare 3x con PBS e contare cellule vitali utilizzando l'esclusione blu trypan su un emocitometro. Diluire a 1 x 106 PBMC/mL in PBS.
-
Cellule non macchiate CFSE
- Queste cellule sono utilizzate come controlli di compensazione per la citometria di flusso, che comprende celle non colorate e CD4. Aggiungere 300 l di ogni sospensione PBMC del campione di controllo a un tubo da 10 mL, riempirti con PBS e centrifugare a 550 x g per 5 min a RT.
- Risospendere 1 x 106 celle/mL nel supporto RP-5. Incubare queste cellule senza etichetta per 7 giorni in un incubatore di CO2 a 37 gradi con le cellule con etichetta CFSE (passaggio 2.6.1).
-
Cellule colorate CFSE
- Trasferire le celle dal passaggio 2.3 in un tubo da 50 mL. Aggiungete a lato del tubo 1,0 l di stock di lavoro CFSE (10 m) per 1 ll di sospensione cellulare. Mescolare rapidamente invertendo il tubo più volte. La concentrazione finale di CFSE è di 10 nM.
- Incubare per 5 min in un incubatore di CO2 37 gradi centigradi. Per fermare la colorazione, aggiungere 5 mL di supporto RP-5, pellet le cellule da centrifugaper per 5 min a 550 x g. Risospendere i PBMC a 1 x 106/mL nei supporti RP-5.
- Aggiungere 1,0 mL di sospensione cellulare a un tubo da 10 mL. Utilizzare un tubo per ogni antigene da testare.
-
Stimolazione antigenica dei PBMC umani e della coltura cellulare
- Coltura umana CFSE-etichettato PBMC con antigeni nei media RP-5 per 7 giorni in un 37 C/5% CO2 incubatore. Coltura 1 x 105 cellule/pozzo (100 l) in una piastra di 96 pozze con 100 l/pozzetto di supporti RP-5 contenenti antigene diluito.
NOTA: gli antigeni utilizzati, comprese le concentrazioni di lavoro, sono riepilogati nella Tabella 1.
- Coltura umana CFSE-etichettato PBMC con antigeni nei media RP-5 per 7 giorni in un 37 C/5% CO2 incubatore. Coltura 1 x 105 cellule/pozzo (100 l) in una piastra di 96 pozze con 100 l/pozzetto di supporti RP-5 contenenti antigene diluito.
3. Colorazione anti-CD4 per l'analisi FACS
- Pipette 200 - L delle cellule coltivate in tubi FACS, celle di lavaggio 1x in 1,0 mL di PBS contenenti 0,1% FCS e centrifuga per 5 min a 550 x g.
- Macchie con CD4 anti-umano Alexa Fluor 647 (0,25 mg/mL) in 100 - L di PBS/0.1% FCS. Tenere da parte un campione di cellule con etichettatura CFSE, incontaminate con qualsiasi altro fluoroforo, da utilizzare per impostare la compensazione FACS CFSE. Incubare le cellule a 4 gradi centigradi protetti dalla luce per 20 min.
- Lavare le cellule aggiungendo 1 mL di PBS/0,1% FCS, centrifugare a 550 x g per 5 min a RT e risospendere nuovamente in 100 : L di PBS/0.1% FCS. Immediatamente prima dell'analisi FACS, aggiungere 1 l'l ofoppo di iodio di propidio (PI, 0,1 mg/mL) a tutti i tubi per consentire alle cellule morte di essere escluse dalla citometria di flusso.
4. Configurazione citometrica del flusso e strategia Di Gating
NOT: Nella figura 1 è illustrata la configurazione FACS, inclusi i controlli di compensazione e la strategia di gating.
- Cancellare la popolazione a dispersione in avanti (FSC) e a dispersione laterale (SSC) (Figura1A)per includere tutti i linfociti.
- Cancellare la popolazione FSC vs PI (Figura 1B) su cellule negative PI per escludere le cellule apoptotiche.
- Utilizzare celle non colorate per impostare una linea di base di tensione per le celle non fluorescenti. Impostare le tensioni per CD4-A647 e CFSE in modo che il segnale di fluorescenza sia inferiore a 1.000 per ciascuno (Figura 1C). Utilizzare i controlli a colore singolo CFSE (Figura 1D) e CD4-A647 (Figura 1E) per confermare i segnali fluorescenti positivi (10.000 USD) per ogni colore, utilizzando le tensioni impostate con celle non colorate.
- CFSE e PI hanno una certa sovrapposizione spettrale; regolare la compensazione per sottrarre la fluorenza PI dalla fluorenza CFSE fino a quando il campione solo CFSE non produce un segnale nel canale PI.
NOT: Questi cancelli sono stati applicati a tutti i campioni analizzati nel presente documento.
5. Calcolo dell'indice di divisione cellulare per enumerare il CD4 specifico dell'antigene- proliferazione delle cellule T
NOT: L'indice di divisione cellulare (CDI) si riferisce al numero di celle divise (CD4-/CFSEdim) per 5.000 celle indivise (CD4-CFSEbright). Quando il numero di celle CD4 indivise non è esattamente 5.000, il numero di celle divise viene corretto per esprimere il numero di celle divise per 5.000 celle indivise. Ad esempio, utilizzando la proliferazione tetanus specifica del toxoid (Figura 2D), sono state presenti 4.930 celle indivise (CFSEbright) e 3.268 celle divise (CFSEdim); pertanto, il numero corretto di celle divise è (5.000/4.930) x 3.268 x 3.304,3.
- Calcolare il CDI (Tabella 1) dividendo il numero di cellule divise / 5.000 cellule indivise dal gruppo stimolato dall'antigene per il numero medio di cellule divise (per 5.000 cellule indivise) dalle cellule coltivate senza antigene (Tabella 2).
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Representative Results
Stimolazione in vitro dei PMC umani con proteina toxoidte del tetano: i PMC sono stati macchiati con CFSE e stimolati per 7 giorni in presenza di toxoid tetano. Quasi tutti i donatori hanno mostrato una forte risposta delle cellule T al tetano toxoid perché erano stati vaccinati, il che rende il tetano toxoid un utile antigene di controllo positivo. La figura 2 dimostra in triplice copia, che la proliferazione CFSE di CD4- Le cellule T provenienti da PBC non stimolati erano minime (12 celledim CFSE; Figura 2A ,B,C), mentre si è verificato un marcato proliferare di cellule CD4- T in risposta al tetano toxoid (>3,000 cellule attenuate CFSE; Figura 2D ,E,F).
Stimolazione in vitro dei PbMC sumani con peptidi antigenici: i PMC sono stati macchiati con CFSE e stimolati per 7 giorni in presenza di proinsulina umana C-peptide. La figura 3 illustra l'individuazione di CD4 specifici del proinsulino Peptide- cellule T nel sangue periferico di un individuo con diabete di tipo 1. La proliferazione non è stata osservata nel PBMC del donatore sano (dati non riportati). Nella Figura4, i PbMC stimolati con il virus dell'influenza A (H1N1 PR8) la proteina matrice ha dimostrato la proliferazione; tuttavia, la risposta specifica del tetano per questo donatore era relativamente debole e le risposte sono generalmente variabili tra i donatori.
Nel loro insieme, questi risultati dimostrano che il test può essere eseguito utilizzando proteine a lunghezza intera e peptidi sintetici corti.
Figura 1: Controlli di compensazione e strategia di gating per la proliferazione basata su CFSE delle cellule CD4- T. PBMC non stimolati dopo 7 giorni di coltura cellulare in vitro. I linfociti (A) erano macchiati di iodio propidio, e le cellule di propidio iodide-negativo erano gated per escludere le cellule morte (B). I controlli di compensazione FACS includevano celle non colorate (C), celle macchiate con CFSE da solo (D) e celle macchiate con CD4 da solo (E). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: proliferazione delle cellule CD4 specifiche del tetano macchiate di CFSE - T. I PBMC sono stati macchiati CFSE e coltivati per 7 giorni in presenza di 145 ng/mL (166 LfU/mL) tetanus toxoid. Le cellule sono state macchiate di CD4. La diluizione CFSE è mostrata senza antigene (A-C) e in risposta alla proteina toxoidte del tetano (D-F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Proliferazione di cellule CD4 umane macchiate di CFSE in risposta al peptide C-peptide di proinsulina. I PbMC con macchia CFSE sono stati coltivati per 7 giorni in presenza di 10 m proinsulina C-peptidi. Le cellule sono state macchiate di CD4. La diluizione CFSE viene mostrata utilizzando PBMC da un donatore con diabete di tipo 1. Diluizione CFSE in PBC non stimolati (A), proteina toxoidte tetano stimolata (B) e PBMC stimolati dal proinsulino umano C -C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Proliferazione di cellule T umane di CD4, macchiate di CFSE in risposta alla proteina matrice del virus dell'influenza A (H1N1 PR8). I PBMC sono stati macchiati e coltivati per 7 giorni in presenza di 0,08 g/mL proteina matrice del virus dell'influenza A 1. Le cellule sono state macchiate di CD4. La diluizione CFSE è indicata per le cellule non stimolate (A), le cellule stimolate dal tetano tossicoide (B) e le cellule stimolate dalla matrice del virus dell'influenza A (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| antigene m | Concentrazione di lavoro |
| Proteina Tetanus Toxoid | 145 ng/mL |
| Proteina a matrice dell'influenza A H1N1 (PR8) 1 | 0,08–10g/mL |
| Proinsulina C-peptide PI33-63 | 10 nM |
Tabella 1: Enumerazione del CD4 specifico del tetano- proliferazione. Calcoli CDI utilizzando 5.000 eventi di citometria di flusso registrati da PBMC umano non stimolato e stimolato dal tetano.
| campione | Celle indivise CD4-CFSEluminose | Celle divise CD4-CFSEdim | Numero di celle divise CFSEdim/5,000 CFSEbright | Media divise CFSEdim/5,000 CFSEluminoso | |
| Nil 1 | 5.004 | 11 Del sistema di | 11 Del sistema di | 12.3 13 | |
| Nil 2 | 4.995 | 14 Del sistema | 14 Del sistema | ||
| Nil 3 | 5.006 | 12 mila | 12 mila | ||
| campione | Celle indivise CD4-CFSEluminose | Celle divise CD4-CFSEdim | Numero di celle divise CFSEdim/ 5000 CFSEluminoso | CDI Numero di celle divise (Tetano) Cellule divise medi (Nil) | CDI medio |
| Tetano 1 | 4.930 | 3.258 | 3,304.3 | 268 | 263,7 |
| Tetano 2 | 4.928 | 3.205 | 3.251,8 | 263,7 | |
| Tetano 3 | 4.910 | 3.142 | 3.199,6 | 259,5 anni , |
Tabella 2: Antigeni utilizzati per simulare la proliferazione di CD4.
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Discussion
La proliferazione basata su CFSE è un metodo semplice e robusto per rilevare ed enumerare le cellule CD4 umane specifiche dell'antigene e le cellule T. È stato dimostrato in precedenza che l'utilizzo della concentrazione ottimale di CFSE è essenziale per ottenere risultati ottimali4. Troppo CFSE abroga la proliferazione, mentre troppo poco non consente di distinguere le cellule divise e indivise. Al contrario, concentrazioni relativamente elevate (5,0 M) di CFSE vengono utilizzate per etichettare le cellule T del murino purificate3. A causa della variabilità tra i lotti, si raccomanda di sottrarsi a ciascun lotto per determinare la concentrazione ottimale. Usiamo il nostro lotto attuale ad una concentrazione molto inferiore (10 nM) rispetto alla pubblicazione originale (200 nM)4.
Un altro aspetto importante di questo metodo è l'ottimizzazione della dose di antigene. È stato ben stabilito che le cellule T coltivate con meno antigene possono essere più sensibili e presentano una funzione migliorata. Questo è stato originariamente dimostrato nel contesto dei peptidi HIV15. La quantità di tetano toxoid utilizzato in questo protocollo è stato anche ottimizzato in precedenza4 per suscitare cellule CD4 altamente sensibili e proliferanti. È interessante notare che, è stato dimostrato in precedenza che l'eccesso di antigene riduce la proliferazione specifica dell'antigene15. Pertanto, per rilevare ed enumerare rare popolazioni di cellule T nel sangue periferico, ottimizzare sia la concentrazione di antigene che di CFSE è della massima importanza.
Da quando abbiamo pubblicato il primo saggio a base di diluizione del colorone umano4, molti coloranti simili sono stati sviluppati. Abbiamo scoperto che la proliferazione delle cellule T CD4- T è stata rilevata in modo meno efficace quando il PKH-26, un colorante lipofilo, è stato utilizzato rispetto al CFSE (inedito). Non abbiamo sistematicamente testato altri coloranti sul mercato, quindi non c'è nessun commento sui loro punti di forza relativi. Tuttavia, il protocollo per quantificare la proliferazione delle cellule T è ugualmente applicabile a tutti i saggi di proliferazione della proliferazione dei tini.
Esprimere la proliferazione come indice di divisione cellulare (CDI) incorpora la proliferazione di fondo nel calcolo della grandezza delle risposte. Nelle nostre mani, lo sfondo è solitamente basso (ad esempio, <15 eventi/5.000 CD4- CFSEbright). La proliferazione di fondo varia tra individui ed esperimenti. Utilizzando un rapporto (in questo caso, il CDI) per esprimere la forza della proliferazione è in qualche modo efficace nel ridurre il suo impatto sui risultati. Le risposte di base alle proteine nei media possono essere problematiche. Si raccomanda di utilizzare supporti di coltura tissutale che contengono siero umano, non siero bovino, poiché le proteine bovine possono stimolare una risposta di fondo debole che diminuisce la sensibilità del saggio. Un'elevata proliferazione di fondo è stata trovata in persone che hanno un'infezione lieve, presumibilmente a causa della proliferazione che è innescata in vivo in risposta all'infezione. In questi casi, il saggio deve essere ripetuto una volta che il donatore ha eliminato l'infezione.
Il saggio di proliferazione basato su CFSE può essere modificato per clonare in modo efficiente le cellule CD4 specifiche dell'antigene umano direttamente dai PBMC12. Ad esempio, questo approccio è stato utilizzato per clonare le cellule T CD4e specifiche per l'insulina12. Più di recente, la clonazione e le analisi funzionali del CD4- C-peptide-specifici di proinsulina hanno fornito notevoli informazioni sulla patogenesi del T1D, in particolare nei pazienti con recente insorgenza di T1D13.
In conclusione, il saggio di proliferazione basato su CFSE è sia sensibile che robusto. È veloce e tecnicamente semplice e può essere eseguito utilizzando PBMC fresco o crioconservato. La capacità di incorporare CFSE nell'analisi FACS multicolore fornisce una misura quantitativa dell'immunofenotipo delle cellule T proliferazione del PBMC contenente molti tipi di cellule, e questo grado di dettaglio non è possibile con i saggi che utilizzano l'incorporazione del DNA come [3H]-timine.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da: The Juvenile Diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). Il National Health and Medical Research Council (NHMRC GNT123586) (S. M.), Il Diabetes Australia Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), il Programma operativo di supporto alle infrastrutture del governo vittoriano (S. M., A. D., E. T., M.S.) e NHMRC) e NHMRC Borsa di studio post-laurea APP1094337 e JDRF PhD Top-up Scholarship (M. S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
