Мы описываем протоколы для подготовки яйцеклеток и очищения спорозоитов для изучения инфекции органов кишечника и дыхательных путей с помощью Cryptosporidium parvum. Мы демонстрируем процедуры микроинъекции паразитов в кишечный органоидный просвет и иммуностоидинг органоидов. Наконец, мы описываем изоляцию генерируемых яйцеклеток от органоидов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изучение Cryptosporidium инфекции в 3D Ткани полученных человеческих органоидных систем культуры микроинъекции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Cryptosporidium parvum является одной из основных причин заболеваний человека диареи. Чтобы понять патологию паразита и разработать эффективные препараты, необходима система культуры in vitro, которая переоценивает условия в хозяине. Органоиды, которые очень похожи на ткани своего происхождения, идеально подходят для изучения взаимодействий хозяина-паразита. Органоиды являются трехмерными (3D) тканевыми структурами, которые получены из взрослых стволовых клеток и растут в культуре в течение длительных периодов времени, не подвергаясь никакой генетической аберрации или трансформации. Они имеют четко определенную полярность как с апиальными, так и с базолатеральными поверхностями. Органоиды имеют различные применения в тестировании на наркотики, био-банкинг, и болезни моделирования и принимающей микробов исследований взаимодействия. Здесь мы представляем пошаговый протокол о том, как подготовить яйцеклетки и спорозоиты криптоспоридия для заражения органов кишечника и дыхательных путей человека. Затем мы демонстрируем, как микроинъекция может быть использована для введения микробов в органоидный просвет. Существует три основных метода, с помощью которых органоиды могут быть использованы для исследований взаимодействия хозяина-микроба – микроинъекций, механического стрижки и покрытия, а также путем создания монослойных. Микроинъекция позволяет успомянить 3D-структуру и обеспечивает точный контроль объемов паразитов и прямого апкиальный боковой контакт для микробов. Мы предоставляем подробную информацию для оптимального роста органоидов для визуализации или производства яйцеклеток. Наконец, мы также демонстрируем, как вновь сгенерированные яйцеклетки могут быть изолированы от органоида для дальнейшей обработки и анализа вниз по течению.
Введение
Разработка лекарств или вакцин для лечения и профилактики инфекции Cryptosporidium была затруднена из-за отсутствия систем in vitro, которые точно имитируют in vivo ситуацию в организме человека1,2. Многие из имеющихся в настоящее время систем либо позволяют краткосрочную инфекцию (Злт;5 дней), либо не поддерживают полный жизненный цикл паразита3,4. Другие системы, которые позволяют полное развитие паразита основаны на увековеченных клеточных линий или раковых клеток линий, которые не точно резюмировать физиологическую ситуацию в организме чел....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Вся обработка тканей и резекция проводилась в соответствии с утвержденными протоколами Институционального совета по обзору (IRB) с согласия пациента.
1. Подготовка C. parvum Oocysts для инъекций
ПРИМЕЧАНИЕ: Cryptosporidium ооцисты были приобретены из коммерческого источника (см. Таблица материалов). Эти яйцеклетки производятся в телятах и хранятся в фосфатно-буферном сольном (PBS) с антибиотиками. Они могут храниться в течение 3 месяцев при 4 градусах Цельсия и никогда не должны быть заморожены. Обычно мы используем яйцеклетки в течение одного месяца. Органоиды мо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Представленные здесь протоколы приводят к эффективной очистке ооцизтов и спорозоитов(рисунок 1А),готовых к микроинъекциям. Протокол эксцистанции приводит к освобождению спорозоитов примерно от 70-80% яйцеклеток, поэтому важно отфильтровать оставшиеся ооцисты и оболочки через фильтр 3 мкм. Фильтрация приводит к почти 100% очистке спорозоита(рисунок 1B). Кроме того, добавление зеленого красителя помогает обеспечить инъекцию всех органоидов и позволяет визуализиров.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Культура паразитов Cryptosporidium в кишечных и дыхательных органах обеспечивает точную модель для изучения взаимодействия хозяина-паразита10, но также имеет много других применений. Например, современные методы отбора и распространения генетически модифицированных паразитов Cryptosporidium требуют прохождения у мышей19, что не позволяет изоляции паразитов, которые имеют изменения, необходимые для инфекции in vivo. Органоидная культура Криптоспоридиума.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы признательны Деборе А. Шефер из Школы животных и сравнительных биомедицинских наук, Колледжа сельского хозяйства и наук о жизни, Университета Аризоны, Тусона, ак, США за помощь в производстве и анализе яйцеклеток. Мы также благодарим Франчески Микроскопия и Imaging центр и Д. Л. Mullendore в Университете штата Вашингтон для TEM подготовки и визуализации изолированных органоидных ооц.
Д.Д. является получателем гранта VENI от Нидерландской организации научных исследований (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. является получателем гранта VENI от Нидерландской организации научных исследований (NWO-ALW, 863.14.002) и поддерживается стипендией Мар....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Экстракт базальной мембраны (внеклеточный матрикс) | amsbio | 3533-010-02 | Антитело |
| Crypt-a-Glo (специфическое антитело к ооцисте) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Конечная концентрация = Используйте 2-3 капли/слайд |
| Магнитные шарики с покрытием Crypto-Grab IgM | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Стойка Dynamag 15 | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 стойки | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Мембранные фильтры из поликарбоната Isopore - 3&микро; m | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Быстрый зеленый краситель | SIGMA | F7252-5G | |
| Микроинъектор Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000013 | |
| Стеклянные капилляры диаметром 1 мм | WPI | TW100F-4 | |
| Матригель (внеклеточный матрикс) | Corning | 356237 | |
| Микрофуге пробирка 1,5 мл | Eppendorf | T9661-1000EA& | nbsp; |
| Наконечники для микрозагрузчиков | Eppendorf | 612-7933 | |
| Съемник микропипеток P-97 | Затвор инструмента | P-97 | |
| Нормальная сыворотка для осликов | Bio-Rad | C06SB& | nbsp; |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Гипохлорит натрия (использование 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Супер стик горки | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 мм Держатель фильтра из поликарбоната | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Таурохолевая кислота натрия соль гидрат | SIGMA | T4009-5G | |
| Твин-20 | Merck | 8221840500 | |
| Монтажный агент Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 мл |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5 мл запаса по 500 мл DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5 мл запаса по 500 мл DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5 мл запаса по 500 мл DMEM |
| <сильная> КИШЕЧНАЯ ОРГАНОИДНАЯ СРЕДА-ОМЕ (среда расширения) | <сильная> | <сильный>Конечная концентрация | |
| A83-01 | Токрис | 2939-50мг | 0,5 и микро; M |
| Adv+++ | составляет до 100 мл | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 нг/мл |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 нМ |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1,25 мМ |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10 мМ |
| Noggin CM | В доме* | 10% | |
| Ингибитор P38 (SB202190) | Sigma | S7076-25 мг | 10 & микро; M |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 нМ |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1 мл/500 мл |
| медиа RSpoI CM | В доме* | 20% | |
| Wnt3a CM | В доме* | 50% | |
| На дому* - сотовые линии будут предоставлены по запросу | ; | ||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Дифференцировочная среда) | Для дифференцировки органоидов расширяющегося тонкого кишечника выращивали в среде, богатой Wnt, в течение шести-семи дней после расщепления, а затем выращивали в среде для дифференцировки (изъятие Wnt, никотинамида, SB202190, в среде для дифференцировки (изъятие Wnt, никотинамида, SB202190, простагландина E2 из среды, богатой Wnt, или OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA-LOM (дифференцировочная среда)< | strong> | Конечная концентрация | |
| Adv+++ | составляет до 100 мл | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 нМ |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0,076388889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 нг/мл |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 нг/мл |
| N-ацетилцистеин | Sigma | A9125-25G | 1,25 мМ |
| Никотинамид | Sigma | N0636-100G | 5 мМ |
| Noggin UPE | U-Protein Express Contact | компания напрямую | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 мг | 1 & микро; |
| M Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 мг | 2,5 &; m |
| Rspo UPE | U-Protein Express Contact | компания напрямую | 10% |
| Восстановительный буфер (для ресуспензии ооцист и спорозоитов для инъекций) | ><сильный>Конечная концентрация | ||
| L-глутатион восстановлен | Sigma | G4251-10MG | 0,5 g/μ L бетаина OME/OMD/LOM |
| Sigma | 61962 | 0.5 μ g/μ L OME/OMD/LOM | |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μ g/μ Л линолевой кислоты OME/OMD/LOM |
| Sigma | L1376-10MG | 6.8 μ г/мл OME/OMD /LOM | |
| Таурин | Sigma | T0625-10MG | 0,5 μ g/μ L OME/OMD/LOM |
| strong>Blocking Buffer (для иммунофлуоресцентного окрашивания) | Final Concentration | ||
| Donkey/Goat сыворотка | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Составлять до 100 мл |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0,1% |
| Список используемых антител | |||
| Alexa 568 козий анти-кроличий | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Меченое флуоресцеином антитело Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution - 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads - Магнитные шарики, покрытые моноклональными антителами реактивными | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155 |
| кролика к gp15, полученное R. M. O' Коннор (соавтор). | По запросу | По запросу | Разбавление-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Разбавление- 1:200 |
Ссылки
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
