Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo um método simplificado para a geração eficiente de plasmídeos expressando tanto a enzima CRISPR quanto o RNA guia único associado (sgRNAs). A co-transfecção de células mamíferas com este vetor sgRNA/CRISPR e um vetor de repórter de luciferase dupla que examina o reparo de quebra de dois fios permite avaliação da eficiência do nocaute.
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Artigo de método
Construção de Plasmids CRISPR e Detecção de Eficiência de Nocaute em Células Mamíferas através de um Sistema de Repórteres Dual Luciferase
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embora altamente eficiente, a modificação de um site genômico pela enzima CRISPR requer a geração de um sgRNA exclusivo do site de destino de antemão. Este trabalho descreve os principais passos que levam à construção de vetores sgRNA eficientes usando uma estratégia que permite a detecção eficiente das colônias positivas por PCR antes do sequenciamento de DNA. Uma vez que a edição eficiente do genoma usando o sistema CRISPR requer um sgRNA altamente eficiente, uma pré-seleção de alvos sgRNA candidatos é necessária para economizar tempo e esforço. Um sistema de repórter de dupla luciferase foi desenvolvido para avaliar a eficiência do nocaute examinando o reparo de quebra de dois fios através de um único ressarcimento de fios. Aqui, usamos este sistema de repórteres para pegar o alvo xCas9/sgRNA preferido dos vetores sgRNA candidatos para edição específica de genes. O protocolo delineado fornecerá um vetor de enzima sgRNA/CRISPR preferido em 10 dias (começando com oligonucleotídeos devidamente projetados).
Introdução
Os sgRNAs CRISPR compreendem uma sequência de 20 nucleotídeos (o protoespaço), que é complementar à sequência genômica de alvo1,2. Embora altamente eficiente, a capacidade do sistema CRISPR/Cas de modificar um determinado site genômico requer a geração de um vetor que carrega um sgRNA eficiente exclusivo do site de destino2. Este artigo descreve os principais passos na geração desse vetor sgRNA.
Para a edição de genoma bem-sucedida usando o sistema CRISPR/Cas, o uso de sgRNAs altamente eficientes é um pré-requisito crucial3,....
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Protocolo
1. sgRNA design de oligonucleotídeo
- Design sgRNAs usando ferramentas on-line, como a ferramenta online Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). A sequência PAM é importante com base no Cas9 que está sendo usado. Para xCas9, as sequências pam relevantes são NG e a antiga ferramenta on-line Cas-Designer referida pode gerar sgRNAs relevantes xCas9.
- Use ferramentas de design sgRNA que englobam algoritmos para previsão on-and-target (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. É preferível uma pontuação de 0,2 ou superior.
- Selecione até 3 alvos de edição de genes para....
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Resultados
Os métodos descritos neste protocolo são para a construção de vetores de expressão sgRNA e xCas9 e, em seguida, para a triagem de otimização de oligos sgRNA com eficiências relativamente mais altas de segmentação genética. Aqui exibimos um exemplo representativo de 3 alvos sgRNA para ovelhas DKK2 exon 1. Os vetores de expressão SgRNA e xCas9 podem ser construídos predigesting a espinha dorsal vetorial (Figura 2), seguido por ligante-lo em uma série de fragmentos curtos de DNA de doi.......
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Discussão
Os procedimentos de clonagem de vetores sgRNA que descrevemos aqui facilitam a produção eficiente de sgRNAs, com a maioria dos custos derivados do pedido de oligonucleotídeos e sequenciamento vetorial. Embora o método delineado seja projetado para permitir que os usuários gerem sgRNAs para uso com CRISPR/Cas9, o protocolo pode ser facilmente adaptado para uso com ortomologias Cas9 ou outros endonucleases guiados por RNA, como o Cpf1, introduzindo pequenas modificações na espinha dorsal vetorial e nas sequências de saliên.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este projeto foi financiado pelo Programa de Disciplina de Ciência de Pastagens de Primeira Classe da Província de Shandong (China), Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31301936, 31572383), fundo especial de pesquisa agrocientífica de interesse público (201403071), Avaliação nacional de risco grande projeto especial de qualidade e segurança do produto leite (GJFP201800804) e Projetos de Ciência e Tecnologia de Sustento do Povo de Qingdao (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Uma nova geração de instrumento de PCR de gradiente de tela sensível ao toque | LongGene | A200 | Amplificação do gene alvo |
| Enzimas de restrição AscI | New England Biolabs | R0558V | Vetores alvo de corte |
| Enzima de restrição BbsI | New England Biolabs | R0539S | Vetores alvo de corte |
| Bancada de trabalho limpa | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | Um dispositivo de purificação parcial na forma de um fluxo laminar vertical, que cria um ambiente local de ar limpo |
| DH5 & alfa; Sistema | transformação do vetor do plasmídeo | TaKaRa | K613 |
| Ensaio do repórter do Duplo-luciferas | |||
| Banho-maria termostático elétrico | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Reagente de aquecimento por temperatura constante em banho-maria |
| Eletroforese | Pequim Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Tensão de controle, corrente, etc. |
| Eppendorf Referência 2 | Eppendorf China Ltd. | Referência 2 | Desenhe e transfira com precisão traços do analisador de imagem de |
| gel | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | Para a análise de imagens de gel de eletroforese |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detectar atividade dupla de luciferase |
| Centrífuga refrigerada de alta velocidade | BMH | sigma 3K15 | Extração e purificação de ácido nucleico |
| Incubadora bioquímica inteligente | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Forneça um ambiente de temperatura adequado para o experimento de digestão enzimática |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | Para o cultivo de E.coli |
| Lipofectamine 3000 Kit de reagentes de transfecção | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfecção |
| SalI enzimas de restrição | New England Biolabs | R3138V | Vetores alvo de corte |
| SanPrep Column DNA Gel Kit de extração | Sangon Biotech | B518131-0050 | Reciclagem de fragmentos de DNA |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extração de DNA de plasmídeo |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link Fragmento de DNA |
| TaKaRa MiniBEST Kit de purificação de fragmentos de DNA Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | Purificação |
| de DNA Vertical esterilizador a vapor de pressão | JIBIMED | LS-50LD | Alta temperatura e autoclave para matar bactérias, fungos e outros microorganismos em equipamentos de laboratório |
| Termostato de banho-maria | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Deixe as bactérias continuarem tremendo, o que é bom para o contato com o ar. |
Referências
- Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042(2018).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.....
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Reimpressões e permissões
