Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

DNAzyme-afhankelijke analyse van rRNA 2 '-O-methylatie

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59700
Automatic Translation
1, 1
1School of Biosciences, University of Birmingham

Summary

Hier presenteren we een protocol voor DNAzyme-afhankelijke splijting van RNA. Dit maakt een snelle en site-afhankelijke analyse van RNA 2 '-O-Methylation mogelijk. Deze aanpak kan worden gebruikt voor de voorlopige of belangrijke beoordeling van de activiteit van snoRNA.

Abstract

Geleidervak C/D kleine nucleollaire Rna's (Snorna's) katalyseren 2 '-O-methylering van ribosomaal en klein nucleair RNA. Echter, een groot aantal snoRNA in hogere eukaryoten kan promiscue herkennen andere RNA soorten en 2 '-O-methylate meerdere doelen. Hier bieden we stap-voor-stap handleiding voor de snelle en niet-dure analyse van de site-specifieke 2 '-O-methylatie met behulp van een gevestigde methode met korte DNA-oligonucleotiden genaamd DNAzymes. Deze DNA fragmenten bevatten katalytische sequenties die RNA op specifieke consensus posities klieven, evenals variabele homologie armen die dnazyme naar zijn RNA-doelen leiden. De activiteit van DNAzyme wordt geremd door 2-' O-methylatie van de nucleotide grenzend aan de decolleté plaats in het RNA. Dus, DNAzymes, alleen beperkt door de consensus van de gespleten sequentie, zijn perfecte instrumenten voor de snelle analyse van snoRNA-gemedieerde RNA 2 '-O-Methylation. We analyseerden snoRNA snR13-en snR47 geleide 2 '-O-methylatie van 25S ribosomaal RNA in Saccharomyces cerevisiae om de eenvoud van de techniek aan te tonen en om een gedetailleerd protocol te bieden voor de DNAzyme-afhankelijke assay.

Introduction

RNA modificaties spelen een belangrijke rol in de regulering van genexpressie. RNA 2 '-O-methylatie en pseudouridylation, die worden begeleid door vak C/D en vak H/ACA kleine nucleollaire rna's (snornas) respectievelijk, beschermen RNA tegen afbraak en stabiliseren hun hogere-orde structuren1,2,3 . SnoRNA-doelwitten zijn vooral in ribosomale Rna's (rRNA) en kleine nucleaire Rna's (Snrna's) geïdentificeerd. In hogere eukaryoten zijn er echter mogelijk honderden SnoRNA met geen toegewezen functies en sommige van hen kunnen meerdere rna's1,4,5,6,7herkennen. Daarom zijn methoden die het mogelijk maken om snoRNA geleide wijzigingen te identificeren en te analyseren belangrijke instrumenten voor het opsporen van mechanismen voor cellulaire processen.

Een box C/D SnoRNA-geleide vermoedelijke 2 '-O-methylatieplaats kan bioinformeel worden geïdentificeerd en experimenteel worden bevestigd door vele technieken, waaronder RNase H-gestuurde splijting, of locatiespecifieke en genoom-brede methoden, die omgekeerde transcriptie gebruiken in lage nucleotiden (dNTPs) concentratie aanpak8,9,10,11. Deze technieken zijn zeer gevoelig, maar ook omslagend en duur, daarom mogelijk niet geschikt voor de initiële of snelle testen. Een van de eenvoudigste en laaggeprijsde methoden om 2 '-O-methylatiesites te identificeren is DNAzyme-afhankelijke RNA-decolleté12. DNAzymes zijn korte, enkelvoudig gestrande en katalytisch actieve DNA-moleculen die in staat zijn om RNA op specifieke posities te decolleté. Ze bestaan uit een geconfungeerde en katalytisch actieve kern sequentie en 5 ' en 3 ' binding armen, samengesteld uit variabele sequenties ontworpen om te hybridiseren door Watson-Crick base-pairing aan de RNA target (Figuur 1). Zo leveren de 5 ' en 3 ' armen de katalytische sequentie naar de specifieke RNA-site. Dnazyme-afhankelijke decolleté wordt geremd door 2 '-O-methylatie van de nucleotide die direct stroomopwaarts van de decolleté plaats12,13gepositioneerd is. Dit maakt dnazymes zeer praktische hulpmiddelen voor de analyse van vermoedelijke of bekende RNA 2 '-O-methylatiesites.

Er worden twee soorten DNAzymes gebruikt voor RNA-modificaties en analyses12. De actieve sequentie van 10-23 DNAzyme (Figuur 1a) bestaat uit 15 nucleotiden (5 ' RGGCTAGCTACAACGA3 ') die een lus vormen rond het doel RNA purine-pyrimidine (Ry) dinucleotide en het splijting tussen deze twee nucleotiden katalyseren. De RNA purine (R) is niet gekoppeld aan de DNAzyme en de 2 '-O-Methylation presenteert op de DNAzyme remt het decolleté. De bindende armen van 10-23 DNAzymes zijn meestal 10-15 nucleotiden lang. De tweede klasse DNAzyme, 8-17 DNAzymes (Figuur 1b), bevat 14-nucleotide katalytische sequentie (5 ' TCCGAGCCGGACGA3 '). Nucleotiden C2, c3 en g4 pair met C9 G10 en g11 vormen een korte stuurlus structuur. 8-17 dnazymes klieven RNA stroomopwaarts van elke guanine die perfect is gekoppeld aan de eerste thymine uit de dnazyme actieve sequentie. De RNA-nucleotide stroomopwaarts van de guanine is niet gekoppeld aan DNAzyme en de 2 '-O-methylatie belemmert het decolleté. 8-17 DNAzymes vereisen langere homologie armen van ongeveer 20 nucleotiden om DNAzyme naar zijn specifieke sequentie te richten.

Hier bieden we een stap-voor-stap protocol voor de analyse van 2 '-O-methylatie van rRNA in Saccharomyces cerevisiae met behulp van 10-23 en 8-17 dnazyme-afhankelijke benaderingen12,13 (figuur 1c). Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor andere organismen en RNA-soorten en wordt gebruikt voor de snelle, voorlopige of belangrijke analyses van locatiespecifieke RNA 2 '-O-methylatie.

Protocol

1. stammen, media en buffer recepten

  1. Bereid gist (S. cerevisiae) media zoals hier beschreven: YP (1% w/v gistextract, 2% w/v bacteriologische peptone), en glucose en galactose aandelen bij 20% w/v.
  2. Bereid Natriumacetaat (NaAc)-EDTA (AE) buffer zoals hier beschreven: 50 mM NaAc pH 5,3 en 10 mM EDTA.
  3. Bereid de 10-23 DNAzyme 4x incubatie buffer voor zoals hier beschreven: 24 mM tris pH 8,0, 60 mM NaCl en 10-23 DNAzyme 4x reactiebuffer: 200 mM tris pH 8,0 en 600 mM NaCl.
  4. Bereid 8-17 DNAzyme 2x reactie buffer zoals hier beschreven: 200 mM KCl, 800 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7,0, 15 mM MgCl2en 15 mm MnCl2.
  5. Bereid 10x MOPS buffer zoals hier gedetailleerd: 200 mM MOPS, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA; pH 7,0 en 1.5 x monster Denatureringbuffer: 50% v/v formamide, 20% v/v formaldehyde, 1.5 x MOPS buffer.
  6. Verkrijgen van S. cerevisiae stammen, BY4741 (MATa His3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0); GAL1:: SNR13 (als BY4741 maar GAL1:: SNR13: KANmX); GAL1:: SNR47 (als BY4741 maar GAL1:: SNR47: HIS3mX). Voor deze analyse kan elke andere gist stam worden gebruikt.

2. DNAzyme ontwerp

  1. Vind RNA-volgorde van belangstelling of putatieve methylatiesite met behulp van een geschikte database. Voor S. cerevisiae SnoRNA targets, gebruik gist SnoRNA database: http://People.biochem.umass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php14
  2. Om de methylatieplaats van belang te vinden, bijvoorbeeld snR13 afhankelijke site, selecteert u "snR13" en noteer de positie van de gemodificeerde nucleotide (bijv. snR13 geleide A2281 in 25S rRNA).
  3. Zoek sequenties stroomopwaarts en stroomafwaarts van de gemodificeerde nucleotide met behulp van de juiste database. Voor S. cerevisiae, gebruik maken van de Saccharomyces Genoome database: https://www.yeastgenome.org/
  4. Zoek naar de doelgennaam bijvoorbeeld RDN25 (codering 25S rRNA).
  5. Selecteer op het tabblad "sequentie" 10-15 nucleotiden stroomopwaarts (5 ' arm) en stroomafwaarts (3 ' arm) van de methylatieplaats bij gebruik van een 10-23 DNAzyme assay en 20 nucleotiden stroomopwaarts (5 ' arm) en stroomafwaarts (3 ' arm) van de methylatieplaats voor een 8-17 DNAzyme.
  6. Maak complementaire sequenties van 5 ' en 3 ' armen.
  7. Flank 10-23 of 8-17 DNAzyme katalytische sequentie met complementaire sequenties van 5 ' en 3 ' armen.
  8. Bestel DNAzyme als een normaal DNA-oligonucleotide van de leverancier.

3. S. cerevisiae groeicondities

Opmerking: S. cerevisiae BY4741 strain derivaten werden gebruikt, waarbij de uitdrukking van ofwel SNR13 of SNR47 SnoRNA wordt gedreven door de induceerbare cytochromen GAL1 promotor. Om te induceren of remmen hun synthese, groeien cellen op medium met galactose (GAL1-afhankelijke transcriptie op) of glucose (GAL1-afhankelijke transcriptie uit). Als een controle, gebruik maken van de wild type stam (BY4741) geteeld hetzij op galactose of glucose.

  1. Kweek de giststammen in een geschikt medium en voorwaarden. Voor het analyseren van GAL1:: SNR13 en GAL1:: SNR47 stammen evenals de isogene wild type stam, groeien cellen in 50 ml YP media met 2% glucose (ypd) of galactose (ypgal) bij 30 ° c naar de middelste exponentiële fase.
  2. Centrifugeer cellen bij 1.000 x g, gedurende 3 minuten bij 4 °c.
  3. Gooi de supernatant weg en houd de pellets.
  4. Vries celpellets in vloeibare stikstof en bewaar ze bij-80 °C.
    Let op: Vloeibare stikstof kan ernstige cryogene brandwonden veroorzaken. Draag altijd beschermende kleding en oefen veiligheidsmaatregelen.
    Opmerking: Celpellets kunnen worden bewaard bij-80 °C tot 1 maand. Het protocol kan hier worden onderbroken indien nodig.

4. RNA-isolatie15

Opmerking: Gebruik de meest geschikte methode om RNA te isoleren. Voor gist S. cerevisiaekan een hot-PHENOL RNA-extractie worden gebruikt.

  1. Voeg 1 mL ijskoud water toe, hervat de pellets en breng resuspendeerde cellen over naar 1,5 mL microbuisjes.
  2. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 10 sec. bij 4 °c en verwijder het supernatant.
  3. Voeg 400 μL AE-buffer toe en hervat de cellen.
    Opmerking: De stappen 4.4-4.15 worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld.
  4. Voeg 40 μL 10% SDS en 400 μL zuur fenol toe (pH 4,5).
    Let op: Fenol is giftig en dient te worden behandeld onder een rook afzuigkap. Draag altijd een Labcoat, beschermende handschoenen en een bril bij het werken met fenol. Gooi de afvalstoffen weg volgens de institutionele voorschriften.
  5. Meng goed door grondig voor 20 sec.
  6. Incuberen bij 65 °C gedurende 10 min. Elke 2 min, open en sluit de buis om de druk los te maken en draai de buis 2-3 keer om de fasen te mengen.
  7. Breng de buizen over naar-80 °C en incuberen gedurende 10 min.
  8. Ontdooi de buisjes op de Bank en centrifugeer bij 20.000 x g, gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Breng de bovenste fase over naar een nieuwe buis met 400 μL zuur fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1). De Interphase niet verstoren.
    Let op: Chloroform is giftig en dient te worden behandeld onder een rook afzuigkap. Draag altijd een Labcoat, beschermende handschoenen en een bril bij het werken met chloroform. Gooi het afval weg volgens de institutionele voorschriften.
  10. Meng goed door grondig gedurende 30 sec. en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  11. Breng de bovenste fase (~ 400 μL) over in een nieuwe buis met 400 μL chloroform.
  12. Meng goed door grondig gedurende 30 sec. en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  13. Breng de bovenste fase (~ 300-350 μL) over in een nieuwe buis met 1 mL EtOH en 40 μL van 7,5 M ammoniumacetaat (NH4AC). Meng door de buis een paar keer te spiegelen.
  14. Inincuberen bij-80 °C gedurende 2 uur of 's nachts bij-20 °C.
    Opmerking: De procedure kan hier worden onderbroken.
  15. Centrifugeer bij 20.000 x g, gedurende 10 min bij 4 °c. Een kleine, witte RNA-pellet zal zichtbaar worden op de bodem van de buis.
  16. Verwijder EtOH door Pipetteer om te voorkomen dat de pellet wordt gestoord.
  17. Voeg 1 mL 70% EtOH toe en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  18. Verwijder 70% EtOH door Pipetting.
  19. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 15 sec. en verwijder de overgebleven EtOH met een pipet van 2-20 μL.
  20. Laat de buis gedurende 5 minuten open op de Bank om de RNA-pellet te drogen.
    Opmerking: RNA pellet verandert de kleur van wit naar transparant wanneer het droog is.
  21. Hervat de RNA-pellet in 30 μL RNase/DNase-vrije H2O, breng de buis onmiddellijk over op het ijs en meet de RNA-concentratie op de microspectrophotometer.
  22. Vries de monsters bij-20 °C.
    Opmerking: RNA kan worden bewaard bij-20 °C tot 1 maand en bij-80 °C tot 1 jaar. De procedure kan hier worden onderbroken of direct naar de volgende stap worden door gegaan.

5. DNAzyme spijsvertering

  1. 10-23 DNAzyme spijsvertering
    1. In 1,5 mL buisjes bereiden een incubatie mengsel door 5 μg RNA, 200 pmol van 10-23 DNAzyme (2 μL 100 mM stamoplossing) en 2,5 μL 4x 10-23 incubatie buffer in een totaal volume van 10 μL te combineren. Houd de buizen op ijs.
    2. Breng de buisjes over naar een droog warmte blok op 95 °C en incuberen gedurende 3 min.
    3. Breng de buisjes direct over op het ijs en inbroed gedurende 5 minuten.
    4. Draai kort en zet de buisjes weer op het ijs.
    5. Voeg 20 U RNase-remmer toe (bijv. 0,5 μL RiboLock RNase-remmer).
    6. Plaats de buisjes in een droge warmte blok set voor 25 °C en inbroed gedurende 10 minuten.
    7. Bereid ondertussen een reactiemengsel in een buis van 1,5 μL door 5 μL 4x 10-23 reactie buffer te combineren met 4 μL van 300 mM MgCl2 en 1 μl H2O. plaats de buis in een droog blok ingesteld op 37 °c.
    8. Breng de incubatie-mix over naar een droge warmteblokkeer set voor 37 °C en voeg 10 μL pre-warmed-reactiemix toe.
    9. Incuberen de reactie bij 37 °C gedurende 1 uur.
    10. Breng de buisjes op het ijs over en ga verder naar stap 5.3.1.
  2. 8-17 DNAzyme spijsvertering
    1. Bereid een micro buisje van 1,5 mL met 5 μg RNA in een totaal volume van 6 μL. Houd de tube op ijs.
    2. Bereid een micro buisje van 1,5 mL met 400 pmol van 8-17 DNAzyme (4 μL uit 100 mM voorraad). Houd de tube op ijs.
    3. Breng de buisjes over naar een droge warmte blokset voor 95 °C en inbroed gedurende 2 minuten.
    4. Verplaats het RNA-monster op ijs.
    5. Draai de buis met DNAzyme gedurende 5 sec. en inbroed bij 25 °C gedurende 10 minuten.
    6. Bereid tegelijkertijd een buis van 1,5 mL met 10 μL van 2x 8-17 reactie buffer en inbroed bij 25 °C.
    7. Bereid een reactiemengsel door 10 μL voorverwarmde 2x-reactie buffer toe te voegen aan de buis met DNAzyme.
    8. Breng 14 μL van de reactiemix over in de buis met RNA en Voeg 20 U RNase-remmer toe.
    9. Inincuberen de reactie bij 25 °C gedurende 2 uur.
    10. Breng de buis over op ijs en ga verder naar RNA-zuivering (stap 5.3.1).
  3. RNA-zuivering
    1. Voeg 350 μl water en 400 μL chloroform toe aan de reactie buis, meng goed door grondig gedurende 30 sec. en centrifuge bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Breng de bovenste fase (~ 300-350 μL) over in een nieuwe buis met 1 mL EtOH, 40 μL 7,5 M NH4AC en 1 μL glycogeen (10 μg/μL). Meng door de buis een paar keer te spiegelen.
    3. Inincuberen bij-80 °C gedurende 2 uur of 's nachts bij-20 °C.
      Opmerking: De procedure kan hier worden onderbroken.
    4. Herhaal de stappen van 4,15 tot 4,21.
    5. Rebreng de RNA-pellet in 10 μL RNase/DNase-vrij H2O en zet de buisjes direct op het ijs.
    6. Vries de monsters bij-20 °C.
      Opmerking: RNA kan worden bewaard bij-20 °C tot een maand en bij-80 °C tot 1 jaar. De procedure kan hier worden onderbroken of doorgaan naar RNA elektroforese.

6. RNA elektroforese

  1. Spray de elektroforese apparatuur (tank, tray, kam) met 1% SDS, laat 15 minuten staan en spoel met veel ddH2O.
  2. Los 1,5 g agarose op in 127,5 mL ddH2O door het in de magnetron te verwarmen.
  3. Voeg 15 mL 10x MOPS en 7,5 mL 37% formaldehyde toe aan de agarose-oplossing (totaal volume is 150 mL).
    Let op: Formaldehyde is giftig en dient te worden behandeld onder een rook afzuigkap. Draag altijd een Labcoat, beschermende handschoenen en een bril bij het werken met formaldehyde. Gooi het afval weg volgens de institutionele voorschriften.
  4. Voeg een gepaste hoeveelheid gelvlek naar keuze toe aan de agarose oplossing (bijv. 15 μL SYBR Safe DNA gel Stain). Meng goed en giet de agarose in de tray.
  5. Plaats een kam onmiddellijk in de gel.
  6. Laat het voor 45 min onder de dampkap. Bedek het bakje met aluminiumfolie bij gebruik van een lichtgevoelige gelvlek.
  7. Bereid 600 mL van 1x MOPS-buffer.
  8. RNA monstervoorbereiding
    1. Combineer in een buis van 1,5 mL 10 μL van het verteerde en gezuiverde RNA-monster, 5 μL monster Denatureringbuffer en 0,5 μL 6x-laad kleurstof.
      Let op: Formamide is giftig en dient te worden behandeld onder een rook afzuigkap. Draag altijd een Labcoat, beschermende handschoenen en een bril bij het werken met formamide. Gooi het afval weg volgens de institutionele voorschriften.
    2. Incuberen RNA monsters bij 70 °C gedurende 5 min. Breng de monsters over op ijs. Inincuberen gedurende 5 min.
    3. Draai kort voor het laden op de gel.
  9. Zet de gel in de elektroforese tank en vul met 1x MOPS buffer. Laad het volledige volume van elk monster (15 μL) op de gel. Lopen op 80 V tot broomfenolblauw 2/3 van de gellengte bereikt.
  10. Afbeelding van de gel met behulp van een Imager geschikt voor het detecteren van de gekozen gelvlek (bijv., UV-transilluminator).

Representative Results

Het nut van het DNAzyme-afhankelijke decolleté in de analyse van rRNA-modificaties is onlangs aangetoond in de context van snoRNAs maturatie13. De DNAzyme-afhankelijke assay werd gebruikt om aan te tonen dat het ontbreken van 5 '-end pre-snoRNA verwerking van invloed is op 2 '-O-methylatieniveaus van 25 s en 18S rRNA in S. cerevisiae13.

Hier gebruikten we een induceerbaar snoRNA transcriptie systeem om de effectiviteit en eenvoud van de techniek aan te tonen. Box C/D snR13 begeleidt methylering op twee posities in 25S rRNA, inclusief adenine 2281 (Figuur 2a). Deze nucleotide wordt gevolgd door Uracil, die de consensus dinucleotide (Ry) splijtbaar door een 10-23 dnazyme vormt. Box C/D snR47 begeleidt ook de methylering van twee nucleotiden in 25S rRNA (Figuur 2b). De adenine in positie 2220 wordt gevolgd door een guanine-residu en deze dinucleotide kan worden gecleaved door een 8-17 DNAzyme. Om de synthese van snR13 of snR47 snoRNA te induceren of te remmen, hebben we de induceerbaar GAL1 promotor stroomopwaarts geplaatst van snR13 of snR47 genen en gekweekte cellen in medium bevattende galactose (GAL1-afhankelijke ) of glucose (GAL1-afhankelijke transcriptie uit). Vervolgens werd RNA geïsoleerd van GAL1:: SNR13 cellen geïnincubeerd met 10-23 dnazyme ontworpen om 25S rRNA op SNR13 afhankelijke plaats te klieven, tussen nucleotiden 2281 en 2282 (figuur 2c). RNA van GAL1:: SNR47 stam werd behandeld met 8-17 DNAzyme gericht SNR47 afhankelijke plaats tussen nucleotiden 2220 en 2221 (figuur 2D). Als controle werd RNA van de wild-type BY4741 stam die op galactose of glucose groeit, geïnineerd met beide DNAzymes. Elektroforese van het door DNAzyme behandelde RNA onthulde dat 25S rRNA geëxtraheerd uit GAL1:: SNR13 en GAL1:: SNR47 stammen die op GALACTOSE (GAL) groeien, bleven intact (Figuur 3a,B; Lanes 3). In tegenstelling, RNA geïsoleerd van GAL1:: SNR13 en GAL1:: SNR47 cellen die groeien op glucose (GLC) werd verteerd door respectieve Dnazymes (Figuur 3a, B; Lanes 4). In beide gevallen daalde de 25S rRNA band en werden 5 ' en 3 ' cut-off decolleté producten (A en B) waargenomen. Dit geeft aan dat in GAL1:: SNR13 en GAL1:: SNR47 stammen, 25S rRNA was 2 '-O-gemethyleerd op SNR13-of SNR47-geleide sites wanneer galactose werd gebruikt als een koolstofbron en deze SnoRNA werden uitgedrukt. Het ontbreken van 25S rRNA methylatieanalyse wanneer snR13 of snR47 expressie werd afgesloten op glucose toegestaan voor dnazyme-afhankelijke decolleté. Er werd geen RNA-vertering waargenomen voor monsters van wild type (Figuur 3a,B; Lanes 1 en 2), omdat de uitdrukking van snR13 en snR47 galactose/glucose-onafhankelijk is in deze stam. Daarom was rRNA normaal gemethyleerd en zo resistent tegen DNAzymes activiteit.

In het algemeen blijkt uit ons experiment dat de decolleté activiteit van 10-23 (Figuur 3a) en 8-17 (Figuur 3b) dnazymes correleerde met de afwezigheid van vak C/D snR13 of snR47, wat duidelijk aangeeft dat deze SnoRNA verantwoordelijk zijn voor 25S rRNA 2 '-O-methylering op bepaalde plaatsen.

Figure 1
Figuur 1: DNAzymes en hun RNA-substraten. A) 10-23dnazymes klieven een purine-pyrimidine (Ry) RNA dinucleotide. R in het RNA is niet gekoppeld aan DNAzyme, terwijl Y complementair is aan de R-basis in de DNAzyme. Methylering van de purine (R) in RNA onderdrukt DNAzyme-afhankelijke splijting. B) 8-17 dnazymes klieven RNA stroomopwaarts van guanine dat onvolkomen is gekoppeld aan de eerste thymine in de katalytische sequentie van dnazyme. De nucleotide voorafgaand aan guanine is niet gekoppeld en de methylering beschermt tegen DNAzyme-afhankelijke decolleté. RNA wordt in het grijs weergegeven (afgezien van de methylatieplaats), wordt DNAzyme in paars weergegeven. N = elke nucleotide, R = purine: Adenine of guanine, Y = pyrimidine: Cytosine of uracil; CH3-duidt op RNA-methylatie. De basis koppeling binnen de actieve sequenties van DNAzyme wordt gemarkeerd met stippellijnen. Een blauwe bliksemschicht markeert de splijting site. C) een stroomschema dat de stappen van een DNAzyme-afhankelijke analyse weergeeft. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: DNAzymes gericht op snR13-en snR47-afhankelijke methylatielocaties in 25S rRNA. (a, B) Browser screenshots met snR13-afhankelijke (a) en snR47 afhankelijke (B) Methylatiesites in 25S rRNA (C) 25S rRNA sequentie rondom snR13-afhankelijke methylatieplaats (A2281) en 10-23 dnazyme (weergegeven in paars) ontworpen om RNA te klieven tussen een2281 en U2282. Een2281 is niet gekoppeld aan de dnazyme terwijl U2282 een paar vormt met de eerste nucleotide uit de dnazyme actieve sequentie (gemarkeerd door een blauwe lijn). Een blauwe bliksemschicht markeert het splijting. D) 25S rRNA sequentie rondom snR47-afhankelijke methylatieplaats (A2220) en 8-17 dnazyme (afgebeeld in paars) ontworpen om RNA te klieven tussen een2220 en G2221. Een2220 is niet gehybridiseerd met de DNAzyme terwijl G2221 niet perfect is gekoppeld aan Thymine (aangeduid met een onderbroken lijn). Een blauwe bliksemschicht markeert de splijting site. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: analyse van de locatiespecifieke 2 '-O-methylatie van 25S rRNA met gebruikmaking van 10-23 en 8-17 DNAzyme-afhankelijke assay. A) analyse van snR13-afhankelijke 25S rRNA methylering met gebruikmaking van 10-23 DNAzyme. B) analyse van snR47-afhankelijke 25S rRNA methylering met gebruikmaking van 8-17 DNAzyme. RNA werd gevisualiseerd kleuring in een denaturerende agarose gel. Decolleté producten A en B worden gekenmerkt door rode pijlen. WT = wild type stam; GAL = galactose, GLC = glucose. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Dnazyme-afhankelijke spijsvertering kan worden gebruikt als een eenvoudige en snelle methode om site-specifieke RNA 2 '-O-Methylation12,13te analyseren. Dnazymes klieven RNA als de nucleotide stroomopwaarts van de splijting site niet gemethyleerd. In tegenstelling tot andere benaderingen, waaronder RNase H-gestuurde spijsvertering, alkalische afbraak of omgekeerde transcriptie in lage nucleotiden concentratie, gevolgd door kwantitatieve PCR of sequentiëren8,10,11 ,16, vereist dnazyme een eenvoudig DNA-oligonucleotide en basis reagentia die aanwezig zijn in een laboratorium voor moleculaire biologie. Bovendien kunnen DNAzymes op een vergelijkbare manier worden gebruikt om RNA-pseudo-gemedieerde door Box H/ACA snoRNA12te analyseren, waardoor ze veelzijdige hulpmiddelen zijn bij het bestuderen van SnoRNA-doelen.

DNAzyme-afhankelijke benaderingen zijn alleen beperkt door het decolleté site consensus sequenties17. 10-23 DNAzymes kan worden gebruikt voor het analyseren van 2 '-O-methylatie alleen op positie R van de RY dinucleotide, terwijl 8-17 DNAzymes de modificatie van de nucleotide stroomopwaarts van guanine erkennen. Als gevolg hiervan kunnen wijzigingen zoals 2 '-O-methylatie van de eerste nucleotide in de dinucleotiden guanine-adenine (GA), adenine-adenine (AA), pyrimidine-adenine (YA) en pyrimidine-pyrimidine (YY) niet worden geanalyseerd. Bovendien moet de lage efficiëntie van DNAzyme-afhankelijke splijting12 worden overwogen. Hoewel sommige dnazymes RNA bijna volledig klieven (Figuur 3b), verteren veel dnazymes hun doelen slechts gedeeltelijk (Figuur 3b). De efficiëntie kan afhangen van de volgorde rond de splijting site. RNA-gebieden met gedeelten van dezelfde nucleotide kunnen bijvoorbeeld invloed hebben op de juiste positionering van de actieve sequentie van DNAzyme. Bovendien kunnen RNA-regio's die een sterke secundaire structuur vormen, de DNAzyme-binding aan de doel volgorde opnieuw hybridiseren en onderdrukken. Om deze problemen te overwinnen, kunnen cycli van verwarming en koeling van de 10-23 DNAzyme en zijn RNA substraat worden toegepast18.

We gebruikten de DNAzyme-aanpak om 2 '-O-methylatie van rRNA te onderzoeken. Men kan deze techniek ook gebruiken om andere RNA-modificaties te analyseren, zoals N6-methyladenosine19. Ribosomaal RNA, vanwege zijn overvloed, kan worden geanalyseerd door elektroforese en de splijting producten kunnen worden gevisualiseerd onder het UV-licht. Dit is echter niet van toepassing op minder overvloedige Rna's zoals RNA polymerase II-gegenereerde codering Rna's (mRNA) en niet-coderende Rna's (ncRNA). Deze Rna's kunnen gewoonlijk niet rechtstreeks worden opgespoord door RNA-kleuring in agarose of polyacrylamidegels. In dergelijke gevallen kan DNAzyme-afhankelijke decolleté worden gevisualiseerd door noordelijke blotting, indirect gedetecteerd door PCR/kwantitatieve PCR of geanalyseerd door kwantitatieve PCR met polymerasen (bijv. KlenTaq-DNA-polymerase) die in staat is om 2 ′-O-gemethyleerd RNA te discrimineren uit niet-gemethyleerd RNA20,21.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We danken Maya Wilson en Aneika Leney voor de kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd gesteund door een Sir Henry Dale Fellowship die gezamenlijk werd gefinancierd door de Wellcome Trust en de Royal Society (200473/Z/16/Z).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acid phenol SIGMA P4682
Agarose VWR A2114
Ammonium acetate SIGMA A1542
Chlorophorm Fisher scientific 10293850
DNase/RNase free water Fischer Scientific 10526945
DNAzyme Integrated DNA Technology Custom oligo DNA
EDTA SIGMA E9884
Ethanol Absolute Fisher scientific 10437341
Formaldehyde Sigma F8775
Formamide sigma F9037
Galactose SIGMA G0750
Gel Loading Dye Thermo Fisher Scientific R0611
Glucose SIGMA G7021
Glycogen Thermo Fisher Scientific R0561
HEPES SIGMA H3375
Isoamyl SIGMA W205702
KCl SIGMA P9333
MgCl2 SIGMA M8266
MnCl2 SIGMA 244589
MOPS SIGMA M1254
NaCl SIGMA S7653
Oxoid Peptone Bacteriological Thermo Fisher Scientific LP0037
Oxoid Yeast Extract Powder Thermo Fisher Scientific LP0021
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) Thermo Fisher Scientific EO0382
SDS SIGMA 74255
Sodium acetate trihydrate SIGMA S8625
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
Tris base SIGMA TRIS-RO
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
1.5 mL microtubes Sarstedt
152VR5C01M -80°C freezer Thermo Fisher Scientific
250 mL Erlenmeyer flasks Cole-Parmer
50 mL conical tubes Sarstedt
Combicup VX200 vortex Appleton Woods
DS-11 microspectrophotometer Denovix
Electrophoresis chamber (20 cm tray) SIGMA
FiveEasy F20 pH meter Appleton Woods
Gel documentation system Syngene
Heraeus Fresco 21 micro centrifuge Fisher Scientific
Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes Fisher Scientific
Mini Fuge Plus mini centrifuge Starlab
Mixer HC thermal block Starlab
OLS26 Shaking Water Bath Grant
PowerPac power supplier BioRad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dieci, G., Preti, M., Montanini, B. Eukaryotic snoRNAs: a paradigm for gene expression flexibility. Genomics. 94 (2), 83-88 (2009).
  2. Watkins, N. J., Bohnsack, M. T. The box C/D and H/ACA snoRNPs: key players in the modification, processing and the dynamic folding of ribosomal RNA. Wiley Interdisciplinary Review RNA. 3 (3), 397-414 (2012).
  3. Kufel, J., Grzechnik, P. Small Nucleolar RNAs Tell a Different Tale. Trends in Genetics. , (2018).
  4. Li, T., Zhou, X., Wang, X., Zhu, D., Zhang, Y. Identification and characterization of human snoRNA core promoters. Genomics. 96 (1), 50-56 (2010).
  5. Jorjani, H., et al. An updated human snoRNAome. Nucleic Acids Research. 44 (11), 5068-5082 (2016).
  6. Hubbard, T. J., et al. Ensembl 2009. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D690-D697 (2009).
  7. Makarova, J. A., Kramerov, D. A. SNOntology: Myriads of novel snoRNAs or just a mirage? BMC Genomics. 12, 543 (2011).
  8. Yu, Y. T., Shu, M. D., Steitz, J. A. A new method for detecting sites of 2'-O-methylation in RNA molecules. RNA. 3 (3), 324-331 (1997).
  9. Decatur, W. A., Liang, X. H., Piekna-Przybylska, D., Fournier, M. J. Identifying effects of snoRNA-guided modifications on the synthesis and function of the yeast ribosome. Methods in Enzymology. 425, 283-316 (2007).
  10. Dong, Z. W., et al. RTL-P: a sensitive approach for detecting sites of 2'-O-methylation in RNA molecules. Nucleic Acids Research. 40 (20), e157 (2012).
  11. Birkedal, U., et al. Profiling of ribose methylations in RNA by high-throughput sequencing. Angewandte Chemie International Edition, England. 54 (2), 451-455 (2015).
  12. Buchhaupt, M., Peifer, C., Entian, K. D. Analysis of 2'-O-methylated nucleosides and pseudouridines in ribosomal RNAs using DNAzymes. Analytical Biochemistry. 361 (1), 102-108 (2007).
  13. Grzechnik, P., et al. Nuclear fate of yeast snoRNA is determined by co-transcriptional Rnt1 cleavage. Nature Communication. 9 (1), 1783 (2018).
  14. Piekna-Przybylska, D., Decatur, W. A., Fournier, M. J. New bioinformatic tools for analysis of nucleotide modifications in eukaryotic rRNA. RNA. 13 (3), 305-312 (2007).
  15. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18 (10), 3091-3092 (1990).
  16. Maden, B. E. Mapping 2'-O-methyl groups in ribosomal RNA. Methods. 25 (3), 374-382 (2001).
  17. Santoro, S. W., Joyce, G. F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. Proceedings of the National Academy of Science, U. S. A. 94 (9), 4262-4266 (1997).
  18. Hengesbach, M., Meusburger, M., Lyko, F., Helm, M. Use of DNAzymes for site-specific analysis of ribonucleotide modifications. RNA. 14 (1), 180-187 (2008).
  19. Sednev, M. V., et al. N(6) -Methyladenosine-Sensitive RNA-Cleaving Deoxyribozymes. Angewandte Chemie International Edition, England. 57 (6), 15117-15121 (2018).
  20. Aschenbrenner, J., Marx, A. Direct and site-specific quantification of RNA 2'-O-methylation by PCR with an engineered DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 44 (8), 3495-3502 (2016).
  21. Lee, K. W., Bogenhagen, D. F. Assignment of 2'-O-methyltransferases to modification sites on the mammalian mitochondrial large subunit 16 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (36), 24936-24942 (2014).

Tags

Ontwikkelingsbiologie uitgave 151 RNA-modificatie 2 '-O-methylatie rRNA DNAzyme snoRNA RNA-analyse
DNAzyme-afhankelijke analyse van rRNA 2 '-O-methylatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winczura, K., Grzechnik, P.… More

Winczura, K., Grzechnik, P. DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2’-O-Methylation. J. Vis. Exp. (151), e59700, doi:10.3791/59700 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter