Hier presenteren we een aantal eenvoudige methoden voor de evaluatie van de levensvatbaarheid en de dood in 3D kanker cel sferoïden, die de fysisch-chemische gradiënten van in vivo tumoren veel beter dan de 2D-cultuur na te bootsen. Het sferoïde model maakt het dus mogelijk om de effectiviteit van kanker medicijnen te evalueren met een verbeterde vertaling naar in vivo omstandigheden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen en de dood in 3D sferoïde culturen van kankercellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Driedimensionale sferoïden van kankercellen zijn belangrijke hulpmiddelen voor beide kanker geneesmiddelen schermen en voor het verkrijgen van mechanistische inzicht in kanker celbiologie. De kracht van deze voorbereiding ligt in zijn vermogen om te imiteren vele aspecten van de in vivo voorwaarden van tumoren terwijl ze snel, goedkoop, en veelzijdig genoeg om relatief high-throughput screening mogelijk te maken. De sferoïde cultuuromstandigheden kunnen recapituleren de fysisch-chemische gradiënten in een tumor, met inbegrip van de toenemende extracellulaire zuurgraad, verhoogde lactaat, en het verminderen van glucose en zuurstof beschikbaarheid, van de sferoïde periferie aan zijn kern. Ook de mechanische eigenschappen en cel-cel interacties van in vivo tumoren zijn deels nagebootst door dit model. De specifieke eigenschappen en bijgevolg de optimale groeiomstandigheden, van 3D sferoïden, verschillen sterk tussen verschillende soorten kankercellen. Voorts vereist de beoordeling van de levensvatbaarheid van de cellen en de dood in 3D sferoïden methodes die gedeeltelijk van die voor 2D culturen verschillen. Hier beschrijven we verschillende protocollen voor de voorbereiding van 3D sferoïden van kankercellen, en voor het gebruik van dergelijke culturen om de levensvatbaarheid van cellen en de dood te beoordelen in het kader van de evaluatie van de effectiviteit van antikanker
Inleiding
Het gebruik van multicellulaire sferoïde modellen in de Kankerbiologie is een aantal decennia oud1,2, maar heeft aanzienlijke dynamiek opgedaan in de afgelopen jaren. Voor een groot deel weerspiegelt dit meer besef hoe sterk het fenotype van kankercellen afhankelijk is van hun micromilieu en specifieke groeiomstandigheden. De micromilieu in vaste tumoren is fundamenteel verschillend van dat in overeenkomstige normale weefsels. Dit omvat fysisch-chemische voorwaarden zoals pH, zuurstof spanning, evenals interstitiële druk, concentratie gradiënten van oplosbare factoren zoals voedingsmiddelen, afvalproducten, en....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. generatie van Sferoïden
- Het voorbereiden van cel opschortingen voor sferoïde vorming
Nota: de verschillende cel lijnen hebben zeer verschillende adhesie eigenschappen en het geschiktste sferoïde vorming protocol moet in elk geval worden gevestigd. Wij hebben geconstateerd dat MCF-7 en BxPC-3 cellen voor spontane sferoïde vorming geschikt zijn, terwijl MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 en MiaPaCa de toevoeging van opnieuw samengesteld kelder membraan vereisen om met succes sferoïden te vormen. Alleen MDA-MB-231 en BxPC-3 cellen zijn aangewend voor de opknoping drop protocol, maar andere cel lijnen zijn zeker van toepassing.- Grow cellen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Sferoïde groei analyses gebaseerd op het sferoïde formatie protocol schematisch geïllustreerd in Figuur 1A en Figuur 1B, werden gebruikt als uitgangspunt voor de analyse van de effecten van anti-kankerbehandelingen in een 3D tumor nabootsen instelling. Het gemak waarmee sferoïden worden gevormd is specifieke cel lijn, en sommige cel lijnen vereisen aanvulling met rBM om coherente sferoïden22te vormen. De .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het gebruik van 3D kanker cel sferoïden heeft bewezen een waardevol en veelzijdig instrument niet alleen voor antikanker drug screening, maar ook voor het verkrijgen van mechanistische inzicht in de regulering van kankercellen dood en levensvatbaarheid onder omstandigheden nabootsen die in de tumor micro-omgeving. Dit is vooral van cruciaal belang als de toegankelijkheid, cellulaire opname, en intracellulaire effecten van chemotherapeutische drugs zijn diep beïnvloed door de fysisch-chemische omstandigheden in de tumor, .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
We zijn dankbaar voor Katrine Franklin Mark en Annette Bartels voor uitstekende technische hulp en om Asbjørn Nøhr-Nielsen voor het uitvoeren van de experimenten in figuur 1D. Dit werk werd gefinancierd door de Stichting Willumsen, de Novo Nordisk Foundation, en de Fondation juchum (all to SFP).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-(4-amidinofenyl)-1H-indol-6-carboxamid (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | Voor het kleuren van kernen |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutische behandeling |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Remmer van NHE1 |
| Antilichaam tegen PARP en cPARP | Cell signaling | #9542 | Gebruikt in western blotting |
| Antilichaam tegen Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Gebruikt voor IHC |
| Antilichaam tegen p53 | Cell Signaling | #2524 | Gebruikt voor IHC |
| Antilichaam tegen β-actine | Sigma | A5441 | Gebruikt in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Gebruikt voor agarose gel voorbereiding |
| Benchmark eiwitladder | Invitrogen | #10747-012 | Gebruikt voor SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Eiwit Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Gebruikt voor eiwit bepaling uit lysaten |
| Bürker kamer | Marienfeld | 610311 | Voor celtelling |
| BX63 epifluorescentiemicroscoop | Olympus | Gebruikt voor fluorescerende beeldvorming | |
| CellTiter-Glo 3D Cel Levensvatbaarheid Assay | Promega | #G9681 | Gebruikt voor de cel levensvatbaarheidstest |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutische behandeling |
| Corning Spheroid Microplate, 96 putjes, Zwart met heldere ronde bodem, Ultra-lage hechting, Met deksel, Sterile | Corning | #4520 | Gebruikt voor het laten groeien van sferoïden met luminescentiemetingen als eindpunt |
| Corning 96 putjes, heldere ronde bodem, Ultra-lage hechting microplate, Met deksel, Sterile | Corning | #7007 | Voldoende voor sferoïdgroei zonder luminescentiemetingen als eindpunt |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Gebruikt voor SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutische behandeling |
| FLUOStar Optima Microplate lezer | BMG Labtech | Gebruikt voor het opnemen van luminescentie | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Gebruikt voor celfixatie |
| Geltrex LDEV-vrij Gereduceerde Groei Factor Basement Membraan Matrix | Gibco | #A1413202 | Bij 4 °C bewaren om verharding te voorkomen. Aangeduid als rBM in het protocol. |
| Verhit-geïnactiveerde FBS | Sigma | #F9665 | Serum voor groeimedia |
| ImageJ | NIH | Wetenschappelijke beeldanalyse | |
| Medim Uni-safe cassette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Gebruikt voor opslag van ingebedde sferoïden |
| Mini protease inhibitor cocktail tabletten | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Gebruikt voor lysis buffer voorbereiding |
| MZ16 microscoop | Leica | Gebruikt voor lichtmicroscopische beelden | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Gebruikt voor western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substraat | Thermo scientific | #32106 | Gebruikt voor western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Gebruikt voor proteïnebandkleuring |
| Prism 6.0 | Graphpad | Wetenschappelijke grafiek en statistische software | |
| Propidiumjodide (1mg/ml oplossing in water) | Invitrogen | P3566 | Licht gevoelig |
| Steriele reservoirs, multikanaals | SPL lifesciences | 21002 | Gebruikt voor het zaaien van cellen voor sferoïdvorming |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesie schuif | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscoopglasplaatje gebruikt voor inbedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Gebruikt als chemotherapeutische behandeling |
| Trans-blot Turbo 0,2 µm nitrocellulose membranen | Bio-Rad | #170-4159 | Gebruikt voor western blotting |
| Tris/Glycine/SDS draaiende buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Gebruikt voor SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA oplossing | Sigma | #T4174 | Celdissociatie enzym |
Referenties
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
