Summary
Dit protocol beschrijft de oprichting van een tumor-lager muismodel om te controleren van de progressie van de tumor en angiogenese in real-time door dubbele bioluminescentie beeldvorming.
Abstract
Angiogenese, als een cruciale proces van tumorprogressie, is uitgegroeid tot een onderzoek hotspot en doelwit van anti-tumor therapie. Er is echter geen betrouwbaar model voor het traceren van tumorprogressie en angiogenese tegelijkertijd op een visuele en gevoelige manier. Bioluminescentie Imaging toont zijn unieke superioriteit in levende beeldvorming vanwege de voordelen van hoge gevoeligheid, sterke specificiteit en nauwkeurige meting. Gepresenteerd hier is een protocol om een tumor-dragende muismodel te vestigen door het injecteren van een renilla plaats-gelabelde Murine borstkanker cellijn 4t1 in de transgene muis met angiogenese-geïnduceerde Firefly plaats expressie. Dit muismodel biedt een waardevol hulpmiddel om gelijktijdig tumorprogressie en angiogenese in real-time te monitoren door dubbele bioluminescentie beeldvorming in één muis. Dit model kan op grote schaal worden toegepast in anti-tumor drug screening en oncologie onderzoek.
Introduction
Angiogenese is een essentieel proces in de progressie van kanker van kleine, gelokaliseerde Neoplasmata tot grotere, mogelijk gemetastaseerde tumoren1,2. De correlatie tussen tumorgroei en angiogenese wordt een van de punten van de nadruk op het gebied van oncologie onderzoek. Traditionele methoden voor het meten van morfologische veranderingen zijn echter niet in staat om de tumorprogressie en angiogenese gelijktijdig in levende dieren te monitoren met behulp van een gevisualiseerde benadering.
Bioluminescentie Imaging (bli) van tumorcellen is een bijzonder geschikte experimentele methode om de tumorgroei te monitoren vanwege de niet-invasiviteit, gevoeligheid en specificiteit3,4,5,6 . Bli-technologie is gebaseerd op het principe dat de plaats oxidatie van een specifiek substraat kan katalyseren tijdens het uitzenden van bioluminescentie. De plaats uitgedrukt in geïmplanteerde tumorcellen reageert met het geïnjecteerde substraat, dat kan worden gedetecteerd door een levend beeld systeem, en signalen weerspiegelen indirect de veranderingen in het celnummer of cellokalisatie in vivo6,7.
Met uitzondering van tumorgroei, kan tumor angiogenese (de kritieke stap in de progressie van kanker) ook worden gevisualiseerd via bli-technologie met behulp van Vegfr2-Fluc-Ki transgene muizen8,9,10. De vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) receptor 2 (Vegfr2), één type VEGF-receptor, wordt meestal uitgedrukt in de vasculaire endotheliale cellen van volwassen muizen11. In Vegfr2-Fluc-Ki transgene muizen wordt de DNA-sequentie van Firefly plaats (Fluc) in de eerste Exon van de endogene Vegfr2 sequentie geslagen. Als gevolg hiervan wordt de Fluc uitgedrukt (die verschijnt als BLI-signalen) op een manier die identiek is aan het niveau van angiogenese bij muizen. Om te groeien dan een paar millimeter in grootte, de tumor rekruten nieuwe vasculaturen van bestaande bloedvaten, die sterk uitdrukken de Vegfr2 veroorzaakt door groeifactoren uit tumorcellen1. Dit opent de mogelijkheid van het gebruik van Vegfr2-Fluc-KI transgene muizen tot niet-invasief monitoren van tumor angiogenese door BLI.
In dit protocol, een tumor-dragende muismodel is opgericht om te controleren van de tumorprogressie en angiogenese in een enkele muis door middel van Firefly plaats (Fluc) en renilla plaats (rluc) Imaging, respectievelijk (Figuur 1). Er wordt een 4T1-cellijn (4T1-RR) gemaakt dat Rluc en Red fluorescent proteïne (RFP) stabiel uitdrukt om celgroei te traceren door Rluc Imaging. Om verder onderzoek te doen naar de dynamische veranderingen van angiogenese in de progressie en regressie van de tumor, wordt een andere 4T1 cellijn (4T1-RRT) gemaakt die het zelfmoord genherpes simplexvirus (afgekort thymidine kinase, HSV-ttk), Rluc en RFP uitdrukt. Door toediening van ganciclovir (GCV), wordt de HSV-ttk die cellen uitdrukt, selectief geablleerd. Op basis van deze cellijnen is een tumor lager model in Vegfr2-Fluc-KI muizen gebouwd dat dient als een experimenteel model dat de tumorprogressie en tumor angiogenese in vivo overbrugt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten moeten voldoen aan de nationale en institutionele voorschriften betreffende het gebruik van dieren voor onderzoeksdoeleinden. Er moeten machtigingen voor het uitvoeren van experimenten worden verkregen. De behandeling van dieren en experimentele procedures van de studie houden aan de Nankai University dierenverzorging en gebruik Comité richtlijnen die voldoen aan de richtlijnen voor de verzorging van dieren goedgekeurd door de National Institutes of Health (NIH).
1. LV-Rluc-RFP (RR) en LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT) linvirale verpakking en productie
Let op: de PLV-RR draagt de genen sequenties van renilla plaats (rluc) en Red Fluorescent Protein (RFP) onder de Promoter EF1α, terwijl de PLV-RRT de gen sequenties codering rluc, RFP en herpes simplexvirus bevat, afgeknotte thymidine kinase (HSV-ttk) ( Figuur 2).
- Zaad 1 x 106 van 293t cellen per put in een 6 goed bord en cultuur 's nachts in een bevoficeerde incubator met 5% Co2 bij 37 ° c met dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) bevattende 10% foetaal runderserum (FBS).
- Bereid de liposoom suspensie voor: Meng 7,5 μL liposoom en 0,25 ml van het minimale essentiële medium (MEM) in een buis van 1,5 ml na incubatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) om de liposomen gelijkmatig te verspreiden.
- Bereid de DNAS-oplossing (DNAS-RR): Voeg de PLV-RR vector en helper plasmiden toe aan 0,25 ml mem in een buis van 1,5 ml zoals beschreven in tabel 1.
- Verkrijg de liposoom/DNAS-RR-compound: Voeg de DNAS-RR-oplossing voorzichtig toe aan de bereide liposoom suspensie druppel door druppel en inincuberen gedurende 20 minuten bij RT zodat het DNA bindt aan het lipide membraan.
- Vervang het medium van de 293T cellen door 1 mL DMEM met 10% FBS en voeg zachtjes de Liposome/DNAs-RR compound toe aan het medium van de 293T cellen.
- Na incuberen in een bevoficeerde incubator met 5% CO2 bij 37 °c gedurende 12 – 16 uur, vervang de Liposome/DNAS-RR-verbinding met medium van de 293t-cellen door 1 ml DMEM met 10% FBS en 100 U/ml penicillaire − streptomycine.
- Doorgaan met het kweken van de 293T cellen in de bevoficeerde incubator voor 48 h na transfectie. Verzamel vervolgens de supernatant van de 293T-cellen en Centrifugeer het medium op 300 x g gedurende 5 minuten om de 293t-cellen te pellet. Breng de lentivirus-RR (LV-RR) met supernatant over in 1,5 mL steriele polypropyleen opslag buizen en bewaar bij-80 °C.
Opmerking: een faciliteit voor bioveiligheid niveau 2 (BSL-2) is vereist om met recombinant lentivirus te kunnen werken. - Herhaal stappen 1.1 – 1.7 en gebruik pLV-RRT vector in plaats van pLV-RR vector in stap 1,3 om de lentivirus-RRT (LV-RRT) te verkrijgen. Bewaar de LV-RRT bij-80 °C.
Opmerking: de niet-gezuiverde lentivirale voorraad kan celgroei in sommige gevallen remmen. Lentivirale voorraad moet mogelijk worden gezuiverd. De linvirale bestanden met LV-RR of LV-RRT deeltjes moeten worden onderverdeeld in 1,5 mL tubes (1 mL per buis) voor opslag om meerdere vrije dooi cycli te voorkomen.
2. LV-RR en LV-RRT linvirale transductie voor genexpressie in 4T1-cellen
- Zaad 4T1 cellen in een 6-well plaat (5 x 105 cellen/well) en cultuur met Roswell Park Memorial Institute (rpmi) 1640 medium bevattende 10% FBS 's nachts in een bevoficeerde incubator met 5% Co2 bij 37 °c.
- Verwijder het medium uit de kweek plaat en vervang het door 1 mL verse RPMI 1640 medium en 1 mL linviraal bestand (LV-RR of LV-RRT) aan elk goed. Voeg 8 μg/mL polybrene toe en meng het medium met linvirale deeltjes zachtjes door pipetteren op en neer.
Let op: Houd er rekening mee dat het medium linvirale deeltjes bevat, die menselijke cellen kunnen leiden. - Spin transductie oplossing in een centrifuge bij 1.000 × g gedurende 60 min bij RT om de transductie-efficiëntie te helpen verhogen. Na centrifugeren, cultuur 4T1 cellen voor 4 – 12 h en handhaven in een bevoficeerde incubator met 5% CO2 bij 37 °c.
Opmerking: voor sommige cellijnen kan polybrene giftig zijn voor de lange termijn cultuur. Daarom kan de incubatietijd voor het transduceren van verschillende cellen veranderlijk zijn. Controleer de celstatus meerdere malen om de juiste incubatietijd te vinden. - Vernieuw het medium van de getransduceerde 4t1-cellen met 2 mL RPMI 1640-medium met 10% FBS en 100 U/mL penicillaire − streptomycine om linvirale deeltjes en polybrene te verwijderen.
3. geneesmiddelen screening en identificatie van LV-RR en LV-RRT getransduceerde 4t1-cellen
- Selecteer getransduceerde cellen met medium met blasticidin (BSD) volgens het BSD-resistentie-gen dat door LV-RR of LV-RRT wordt gedragen, zoals beschreven in de volgende stappen.
Opmerking: als alternatief kunnen de getransduceerde-cellen die RFP-positief zijn, worden geselecteerd door Flowcytometrie volgens het RFP-gen dat wordt uitgevoerd door LV-RR of LV-RRT. - 48 h na transductie, passage 4T1 cellen bij de verhouding van 1:3 tot 1:4 met selectie medium (RPMI 1640 medium bevattende 10% FBS, 100 U/mL penicillaire − streptomycine, en 5 μg/mL BSD). Verander het medium elke 2 of 3 dagen.
Opmerking: de optimale BSD-concentratie kan variëren van cellijn tot cellijn. Daarom moet een pilot-experiment van Kill-curve worden uitgevoerd om de optimale concentratie van BSD te bepalen vóór het eerste experiment. - 7 dagen na de drug screening, observeren de LV-RR getransduceerde 4t1 cellen (4T1-RR) en LV-RRT getransduceerde 4t1 cellen (4T1-RRT) onder de fluorescentie omgekeerde fase-contrast Microscoop. Tel het aantal RFP+ 4t1-cellen en alle 4t1-cellen in drie gezichtsvelden om respectievelijk de RFP-positieve ratio (Figuur 2) te schatten.
Opmerking: als alternatief kan de RFP-positieve ratio van getransduceerde 4t1-cellen worden geïdentificeerd door Flowcytometrie. - Meet de renilla-signalen van 4T1-RR-cellen en 4T1-RRT-cellen door een levend beeldvormings systeem te gebruiken om de lineaire relatie tussen celnummers en renilla-signalen te detecteren (Figuur 3).
- Breid BSD-afgeschermde 4T1-RR en 4T1-RRT cellen uit met selectie medium bij gesplitste verhoudingen tussen 1:3 en 1:4 en bewaar de cellijn voorraden in vloeibare stikstof.
4. Vegfr2-Fluc-KI muizen en tumor-lager muismodel
Opmerking: de transgene Vegfr2-Fluc-KI-muizen, 6-8 weken oud en vrouwelijk, worden in dit experiment gebruikt om angiogenese in vivo door BLI niet-invasief te monitoren.
- Cultuur 4T1-RR cellen en 4T1-RRT cellen in 60 mm Petri schalen in een bevoficeerde incubator met 5% CO2 bij 37 °c, respectievelijk. Wanneer de cellen zijn op 80% samenvloeiing, verwijder het medium en spoel met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Verwijder de PBS en voeg een extra 2 mL van respectievelijk 0,25% trypsine-0,53 mM EDTA-oplossing toe. Houd de schaal op RT (of bij 37 °C) totdat de cellen los.
- Voeg 5 – 10 mL vers medium met 10% FBS toe en zuig en verdeel cellen om respectievelijk 4T1-RR en 4T1-RRT cellen te hervatten in 15 mL centrifugebuizen. Tel twee soorten 4T1-cellen met behulp van een telkamer en bereid de celsuspensies voor met een concentratie van 1 x 106 per 100 ΜL in rpmi 1640 medium.
- Anesthetiseer de Vegfr2-Fluc-Ki muizen met 1% – 3% Isofluraan in 100% zuurstof bij anesthesie inductie kamer met een debiet van 1 L/min. monitor de teen pinch reactie van de muis om de status van de anesthesie te bevestigen. Breng vervolgens oftalmische zalf aan op de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen.
- Verwijder de muis van kamer en positie in nosecone. Verwijder het haar van de schouder van de muis volledig met behulp van elektrische scheerapparaat en Ontharingscrème, die een goed beeld van het chirurgische veld kan bieden en Vermijd het blokkeren van de BLI-signalen bij vervolg experimenten.
- Injecteer subcutaan 4T1-RR cellen (1 x 106 cellen bij een totaal volume van 100 μL) en 4T1-RRT cellen (1 x 106 cellen bij een 100 μL totaal volume) in de linker-en rechter schouder van elke muis, respectievelijk (record als dag 0). Plaats muizen in het herstel gebied met thermische ondersteuning totdat ze volledig zijn hersteld.
- Na implantatie van 4T1-RR en 4T1-RRT cellen, raak de tumor massa's om te controleren of de muizen elke dag tumor-lager zijn (figuur S1). Op dag 7 na implantatie injecteert intraperitoneaal 50 mg/kg ganciclovir (GCV) aan de tumor-dragende muizen tweemaal per dag tot het einde van het experiment.
Opmerking: vóór dit experiment moet de cytotoxische van GCV op 4T1-RRT cellen worden gedetecteerd. Het doden rendement van GCV kan worden geëvalueerd door een celteltest met een verschillende concentratie van GCV (figuur S2). - Op de dag 0, 3, 7, 14 en 21 na de implantatie van 4T1, de tumorgroei en angiogenese van tumor-dragende muizen bewaken en beoordelen door zowel Rluc als Fluc Imaging (Figuur 4).
5. dubbele bioluminescentie beeldvorming van tumor (Rluc) en angiogenese (Fluc)
- Open het levende beeldvormings systeem, Initialiseer de levende beeldvormings software en Initialiseer het systeem.
Opmerking: de initialisatie van het systeem duurt enkele minuten om af te koelen van de camera met charge-gekoppelde apparaat (CCD) tot-90 °C voordat u Imaging starten. De temperatuur wordt groen wanneer de CCD camera wordt gekoeld. - Gebruik de volgende camera-instellingen:
Controleer de luminescentie en foto.
Overlay controleren.
Luminescentie-instellingen:
Belichtingstijd wordt in normale omstandigheden automatisch ingesteld.
Binning ingesteld op 8.
F/stop-sets naar 1.
Emissie filter wordt geopend.
Foto-instellingen:
Binning ingesteld op medium.
F/stop-sets naar 8.
IVIS-systeeminstellingen:
Gezichtsveld: C = 1 muis weergave, D = 5 muizen weergave.
Onderwerphoogte sets 1,5 cm. - Weeg en noteer de muizen en bereken het volume van coelenterazine (CTZ; 2,5 mg/kg) en D-luciferine (150 mg/kg) nodig.
- Anesthetize tumor-dragende muis met 1% – 3% Isofluraan in 100% zuurstof bij anesthesie inductie kamer met een debiet van 1 L/min. monitor de teen pinch reactie van de muis om de status van anesthesie te bevestigen. Verdeel vervolgens een druppel smerende oogzalf op beide ogen om beschadiging van het hoornvlies te voorkomen.
- Injecteer 2,5 mg CTZ (3,33 mg/mL) per kilogram lichaamsgewicht in de retrobulbar van de muis (bijv. voor een 20 g muis, Injecteer 15 μL om 50 μg CTZ te leveren) met behulp van een insulinespuit naald.
- Beweeg de tumor-dragende muis in de camera kamer met zijn neus in de verdoving kegel zachtjes en verkrijg verschillende foto's van de muis rugvin onmiddellijk om de rluc signalen van 4t1 cellen totdat de bli signalen vervagen weg.
Opmerking: de halfwaardetijd van CTZ is zeer kort en de signalen van Rluc vallen neerslachtig ~ 30 s. Om ervoor te zorgen dat een resterend Rluc-signaal is afgevoerd en het interval tussen Rluc en Fluc Imaging meer dan 10 min moet zijn. - Intraperitoneaal injecteren 150 mg/kg D-Luciferin (30 mg/mL) met behulp van een insulinespuit naald (bijv. voor een 20 g muis, Injecteer 100 μL om 3 mg D-Luciferin te leveren). Houd de muis op RT gedurende 10 minuten voor Fluc Imaging.
- Beweeg deze muis opnieuw in de camera kamer met zijn neus in de anesthesie kegel en verkrijg verschillende foto's van de muis rugvin om de Fluc-signalen van angiogenese te krijgen.
Opmerking: voor elke muis moet de Fluc Kinetic-monitor worden uitgevoerd totdat de signalen het maximum bereiken en vervolgens vervagen. - Herhaal de procedurestappen 5.4 – 5.8 voor elke muis.
- Houd de muizen na de beeldvorming in een warme omgeving totdat de dieren wakker worden.
- Op het gewenste tijdpunt (dag 3, 7, 14 en 21), herhaal bovenstaande procedures (stap 5.3 – 5.10) om de tumorprogressie en tumor angiogenese na verloop van tijd te detecteren.
- Analyseer de Rluc en Fluc signalen gegevens om te onderzoeken van de relatie tussen de tumorgroei en angiogenese in tumorprogressie.
Opmerking: de regio's van belang (ROI) die betrekking hebben op de BLI-signaal site worden gebruikt om de gegevens te analyseren. Meet de totale glans (fotonen) van ROI in de eenheid van fotonen/seconden/cm2/steradian (p/s/cm2/SR) voor elk tijdpunt. - Analyseer de Rluc-en Fluc-signalen van ROI met behulp van grafische software (Figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit experiment, een borstkanker muismodel werd opgericht met behulp van 4T1 cellen te onderzoeken van de relatie tussen tumorgroei en tumor angiogenese (Figuur 1). Ten eerste werden twee linvirussen verpakt, die gensequenties droegen die Rluc/RFP (LV-RR) en Rluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT) uitmaakten, zoals eerder gemeld7. Vervolgens werden twee verschillende 4T1 cellijnen, genaamd 4T1-RR en 4T1-RRT, gemaakt door respectievelijk transducing LV-RR en LV-RRT. Na de geneesmiddelen screening gedurende 3 dagen werden de 4T1-RR en 4T1-RRT waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop om de transductie-efficiëntie te detecteren. Zoals blijkt uit de fluorescentie-beeldvorming, waren meer dan 99% van de 4T1-RR-of 4T1-RRT-cellen RFP-positief, wat suggereerde dat de 4T1-RR en 4T1-RRT cellijnen werden vastgesteld door LV-RR en LV-RRT transductie (Figuur 2a, B). Ondertussen waren er geen verschillen gevonden in celmorfologie en groei tussen wild-type 4T1 en 4T1-RR of 4T1-RRT tijdens de kweektijd. Kortom, we hebben met succes 4T1-RR en 4T1-RRT cellijnen gebouwd zonder de cellulaire toestanden te beïnvloeden. Vervolgens werd bioluminescentie Imaging (BLI) van 4T1-RR en 4T1-RRT-cellen vastgelegd om de Rluc-signalen te detecteren. De BLI beelden toonden aan dat zowel 4T1-RR en 4T1-RRT cellen sterke bioluminescente signalen van dezelfde sterkte uitbrachten (Figuur 3a). Bovendien werden de lineaire relaties tussen Rluc-signalen en celaantallen waargenomen in zowel 4T1-RR (R2 = 0,9974) als 4T1-RRT-cellen (r2 = 0,9989), wat suggereerde dat de rluc-signalen konden worden gebruikt om de tumorgroei in vivo te spiegelen (Figuur 3b ).
Op basis hiervan werd met behulp van de transgene Vegfr2-Fluc-KI muizen een tumor-lager muismodel opgericht om de angiogenese te onderzoeken naarmate de borstkanker groeit. Als gevolg van het kloppen van Fluc-sequentie in de eerste Exon van de Vegfr2 sequentie in Murine, werd de Fluc uitgedrukt (die verschijnt als bioluminescente signalen) op een manier die identiek is aan de angiogenese bij muizen tijdens de progressie van de tumor. Na subcutane injectie van 4T1-RR en 4T1-RRT cellen, werd de celgroei gecontroleerd door Rluc-signalen in aanwezigheid van CTZ op dag 0, 3, 7, 14 en 21 (figuur 4a). Op hetzelfde moment, angiogenese geïnduceerd door tumorgroei werd geëvalueerd door Fluc signalen in de aanwezigheid van D-Luciferin in dezelfde muis. Op dag 7 na implantatie van 4T1-RR en 4T1-RRT, GCV werd toegediend aan de tumor-dragende muizen, die leidde de 4T1-RRT cellen te sterven. De BLI-beelden toonden aan dat Rluc-signalen van 4T1-RR en 4T1-RRT-cellen met hetzelfde tempo stegen vóór GCV-behandeling; echter, Rluc signalen van 4T1-RRT cellen sterk daalde na GCV behandeling. terwijl de Rluc-signalen van 4T1-RR nog steeds zachtjes toenemen. Uiteraard bestond er een significante relativiteitstheorie tussen Rluc-signalen en de tumorgrootte (figuur S1).
Ondertussen stegen volgens de Fluc-beelden de Fluc-signalen in overeenstemming met de Rluc-opkomst en daalden ze na de daling van het Rluc (figuur 4b). Deze resultaten suggereren dat er een directe correlatie tussen tumor angiogenese en tumorgroei. De dood van tumorcellen geïnduceerd door drug GCV kan leiden tot remming van de tumor angiogenese (figuur 4c). Om aan te tonen dat het Fluc-signaal inderdaad de angiogenese binnen de tumoren Detecteer, werden de dieren geofferd na het afwerken van beeldvorming op dag 21 om histologisch bewijs van vasculatuur te verkrijgen. Volgens de beelden van anti-VEGFR2-immunokleuring, de microvasculaire structuren in 4T1-RR tumorweefsel waren significant duidelijker dan in 4T1-RRT tumorweefsel, die consistent met de Fluc signalen waren (Figuur 5). Samengevat, deze dubbele bioluminescentie Imaging strategie kan worden gebruikt om te monitoren van de progressie van de tumor en angiogenese ook beoordelen anti-tumor effecten van verschillende drugs op tumorgroei en angiogenese in de tumor micro omgeving.
Figuur 1: schematische kaart van dubbele bioluminescentie beeldvorming van tumorgroei en angiogenese. De 4T1 cellen die door LV-RR en LV-RRT zijn geënt werden geïmplanteerd in Vegfr2-Fluc-KI transgene muizen. Tijdens tumorgroei, BLI van Rluc en Fluc werden gelijktijdig uitgevoerd in een enkele muis om de tumorgroei en angiogenese status weerspiegelen, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: transductie-efficiëntie van 4T1-RR en 4t1-RRT cellen geïdentificeerd door fluorescentie Imaging. (A) uit de diagrammatische tekening van pLV-RR is gebleken dat de Rluc-en RFP-sequenties zijn uitgedrukt onder de organisator EF1α. De heldere en fluorescerende beelden van één gezichtsveld toonden aan dat 4T1-RR-cellen RFP-positief waren. B) uit de diagram tekening van PLV-RRT is gebleken dat de single Promoter EF1α RLUC, RFP en HSV-ttk genen heeft geactiveerd. De heldere en fluorescerende beelden van één gezichtsveld toonden aan dat 4T1-RRT-cellen RFP-positief waren. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: bioluminescentie beeldvorming van getransduceerde 4t1-RR en 4T1-RRT cellen. A) bioluminescentie-beeldvorming van 4T1-RR-en 4T1-RRT-cellen in aanwezigheid van CTZ. B) de gemeten rluc-signalen van 4T1-RR en 4T1-RRT-cellen hielden een lineaire relatie met celnummers. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: visualisatie van de dynamische processen van tumorgroei en angiogenese in een levend dier. A) stroomdiagram van het experiment en dubbele bli-detectie van Rluc en Fluc. B) representatieve rluc-beelden van tumorprogressie en Fluc-beelden van angiogenese tijdens tumor ontwikkeling in een transgene muis. (C) meting van rluc-signalen toonde aan dat de geïmplanteerde tumorcellen snel toenam, terwijl 4T1-RRT-cellen significant achteruit gingen na gcv-toediening. (D) kwantificering van Fluc-signalen toonde aan dat angiogenese optrad na de implantatie van de tumorcellen, na een parallelle trend met tumorgroei en overlijden geïnduceerd door gcv. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: VEGFR2 immunokleuring van 4t1-RR en 4t1-RRT weefsels op dag 21. Representatieve beelden van tumorweefsels secties gekleurd voor VEGFR2 (groen) op dag 21. De kernen werden met DAPI (blauw) tegen gekleurd. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding S1: curve van tumorgrootte tijdens tumorprogressie in vivo. De tumorgrootte van 4T1-RR en 4T1-RRT cellen steeg na implantatie, maar de tumorgrootte van 4T1-RRT cellen begon te verminderen post-GCV behandeling. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S2: cytotoxisch effect van GCV op 4T1-RRT cellen. De 4T1-RRT cellen stierven met de verhoogde concentratie van GCV. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Afbeelding S3: BLI afbeelding van 4T1-RR cellen in de longen. Na de staart ader injectie van 4T1-RR cellen werd het Rluc signaal van cellen gedetecteerd door BLI. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| LV-RR en LV-RRT verpakkings condities | |||
| Onderdelen | MEM medium | 3-plasmide systeem | 4-plasmide systeem |
| pLV-RR/pLV-RRT VectorA | 0,25 mL | 1,5 μg | 1,5 μg |
| Gag-Pol + Rev Expression VectorB | 1,0 μg | ||
| Gag-Pol expressie VectorC | 0,75 μg | ||
| Rev expressie VectorD | 0,3 μg | ||
| VSV-G expressie VectorE | 0,5 μg | 0,45 μg | |
| Liposoom | 0,25 mL | 7,5 μL | 7,5 μL |
Tabel 1: transfectie condities van linviraal verpakkingssysteem voor de productie van LV-RR en LV-RRT virale bestanden in 293t cellen. A) de pLV-cDNA-vector was respectievelijk PLV-RR en plv-RRT. B) de gag-Pol + Rev Expression vector kan ofwel pcmv-Deltar 8.91 (TRC) of PsPAX2 (addgene) zijn. (C) gag-Pol-expressie vector kan een van pMDLg/Prre (addgene), PLP1 (Invitrogen) en PPACKH1-gag (SBI) selecteren. D) Rev-uitdrukkings vector moet PRSV-Rev (addgene), PLP2 (Invitrogen) of PPACKH1-Rev (SBI) zijn. (E) VSV-g-expressie vector kan PMD. g (TRC), PMD2. g (addgene), PCMV-VSV-g (addgene), Pvsv-g (SBI) of PLP/Vsvg (Invitrogen) selecteren. In dit protocol werd het drie-plasmide systeem gebruikt, waaronder psPAX2, pMD2. G, en pLV-RR of pLV-RRT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol wordt een niet-invasieve dubbele BLI-benadering beschreven voor het monitoren van tumor ontwikkeling en angiogenese. Het BLI reporter systeem wordt voor het eerst ontwikkeld, met het HSV-ttk/GCV Suicide gen voor het volgen van tumorprogressie en regressie in vivo door Rluc Imaging. Ondertussen wordt tumor angiogenese beoordeeld met behulp van Vegfr2-Fluc-KI muizen via Fluc Imaging. Dit tumor-lager muismodel is in staat om een praktisch platform te bieden voor continue en niet-invasieve tracking tumor ontwikkeling en tumor angiogenese door dubbele BLI in een enkele muis met hoge relevantie, reproduceerbaarheid, en translatability.
Angiogenese betreft lange termijn tumorprogressie en is daardoor van groot belang1. Het is noodzakelijk om te bestuderen van de relatie tussen tumorprogressie en angiogenese. Een toenemend aantal anti-angiogenese strategieën zijn onderzocht voor kankerbehandeling, die afhankelijk zijn van gevisualiseerde monitor benaderingen voor het nauwkeurig beoordelen van de behandelingsresultaten. Verder, de neovascularisatie van tumorweefsel na traditionele radiotherapie en chemotherapie is een ander populair gebied van oncologie onderzoek12,13,14. Deze studies vereisen een diermodel dat monitoring van tumorgroei en angiogenese in real-time mogelijk maakt. De pathologische veranderingen van tumorweefsels in traditionele diermodellen zijn meestal afhankelijk van histopathologisch onderzoek, wat dierlijk offer vereist. Deze dubbele BLI Muismodellen helpen bij het aanpakken van de problemen van grotere fouten bereiken en hogere kosten van het offeren van dieren.
In dit dubbele BLI muismodel, de meest kritieke stap is het gebruik van twee soorten luciferases, met inbegrip van Fluc en Rluc, respectievelijk Trace cellen en angiogenese op hetzelfde moment. De substraat specificiteit van deze twee luciferases maakt het mogelijk om twee soorten BLI in één host uit te voeren. Behalve, de halfwaardetijd van coelenterazine (het substraat van Rluc) is zeer kort, wat resulteert in de Rluc signalen vervaagt snel zonder invloed op de volgende Fluc signaaldetectie15. Vandaar, in het besturings proces, de Rluc Imaging moet worden uitgevoerd voordat Fluc Imaging op grond van de langere halfwaardetijd van D-Luciferin (het substraat van Fluc). Daarnaast is het uitzoeken van de incubatietijd van de substraten de sleutel tot het verwerven van perfecte BLI-beelden. Het metabolisme van substraten kan de concentratie van substraten in vivo veranderen, wat leidt tot variatie in de signaalintensiteit van het BLI.
Het bezitten van vooruitgang in technologie, andere beeldvormings modaliteiten voor in vivo tracking van bepaalde cellulaire en subcellulaire gebeurtenissen zijn toegepast in preklinische en klinisch onderzoek, zoals fluorescerende beeldvorming, magnetische resonantie beeldvorming (MRI), en positron emissie tomografie (PET)16,17. Vergeleken met deze beeldvormings strategieën heeft bioluminescentie Imaging een hoge gevoeligheid, sterke specificiteit en nauwkeurige meting, met een unieke superioriteit op het gebied van levende beeldvormings studies15. De rluc Imaging gebruikt zorgt voor tumorgroei en anti-tumor effecten van het HSV-ttk/gcv voorstadium systeem om dynamisch te worden gevisualiseerd in een levend dier. Met uitzondering van het monitoren van subcutane weefsels, is Rluc gebruikt om cellen in de longen te traceren door BLI-technologie in ander onderzoek. Na de staart ader injectie van 4T1-RR in een muis hebben we deze muis verplaatst naar het Living Imaging systeem om de Rluc signalen na toediening van CTZ te detecteren. Het beeld van het Rluc-signaal toonde aan dat geïnjecteerde cellen zich voornamelijk in de longen bevonden (figuur S3). Zoals hierboven vermeld, kan het gen van het Rluc-rapport verschillende kankercellen op verschillende locaties traceren, wat het volledige gebruik van dit muismodel in het onderzoek naar Kankerbiologie stimuleert.
Naast deze voordelen kan de BLI-technologie worden gebruikt om de expressieniveaus van specifieke moleculen te voelen. Eerder, fluorophores reporter genen, die worden uitgedrukt onder relevante promotors, zijn gebruikt voor het meten van de ontwikkeling van het schip in subcutane tumoren. Tijdens de progressie van de tumor kunnen de vasculaire structuur en moleculen worden waargenomen via de chirurgisch geïmplanteerde raam kamers in muizen. Echter, deze methode heeft nog steeds beperkingen, met inbegrip van onvermijdelijke invasie, de afschrikken, en sterke achtergrondlawaai. Het tumor-dragende muismodel in de Vegfr2-Fluc-KI Mouse creëert een niet-invasieve observatie van het uitdrukkings niveau van Vegfr2, wat het belangrijkste molecuul is in de tumor angiogenese. Ondertussen vertonen de BLI-beelden een grote specificiteit zonder ruis. Het dubbele BLI-muismodel kan bredere toepassingen hebben bij het bestuderen van de potentiële moleculaire mechanismen in tumorprogressie en regressie.
BLI-technologie, gebaseerd op de expressie van Rluc (emissie 480 nm) en Fluc (emissie 562 nm), is goedgekeurd in een aantal in vivo ziekte modellen. Het wijdverbreide gebruik van BLI-technologie in vivo is beperkt vanwege de lage gevoeligheid van bioluminescentie bij golflengten onder 600 Nm bij het opsporen van diep weefsel. Dit wordt veroorzaakt door de absorptie en verstrooiing van licht, waardoor het detecteerbare signaal tot tien-voudige per centimeter van weefsel afneemt. Om deze vraag aan te pakken, sommige onderzoekers hebben gericht studies over de rode emitter varianten van Fluc die licht uitstralen boven 600 nm18. Omdat de absorptie en verstrooiing van licht kan opmerkelijk worden verminderd met behulp van deze varianten van Fluc18,19, de toepassingen van plaats varianten zal dit protocol uit te breiden tot een groter gebied van oncologie onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door National key R & D-programma van China (2017YFA0103200), National Natural Science Foundation of China (81671734), en belangrijke projecten van het Tianjin Science and Technology Support Program (18YFZCSY00010), fundamentele onderzoeksfondsen voor de centrale universiteiten (63191155). We erkennen de herzieningen van Gloria Nance, die waardevol waren om de kwaliteit van ons manuscript te verbeteren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
References
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).
- Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC. Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).
- Wang, R., et al. Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence. Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).
- Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. Tumor angiogenesis, from foe to friend. Science. 349, 694-695 (2015).
- Zhang, K., et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment. ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. , 70-81 (2017).
- Lee, S., et al. Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis. Cell. 130, 691-703 (2007).
- Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response. Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).
- Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).
- Wong, P. P., et al. Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread. Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).
- Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).
- Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy. Biochimie. 116, 43-51 (2015).
- Liu, J., et al. Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).
- Branchini, B. R., et al. Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments. Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).
- McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing "red-shifted" luciferase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).
