脂質混合アッセイ用リポソームへの組換えショウジョウバエアラストシンの洗剤支援再構成

サマリー

生体膜融合は、特殊な融合タンパク質によって触媒されます。タンパク質のフソジェニック特性の測定は、脂質混合アッセイによって達成することができる。ERの同質融合を媒実化するタンパク質である組換えショウジョウバエを精製し、あらかじめ形成されたリポソームに再構成し、融合能力を試験する方法を提示する。

要約

膜融合は真核細胞における重要なプロセスです。融合を触媒するには特殊なタンパク質が必要です。アラストリンは、ERの同質性融合に関与する小プラズム網膜(ER)常駐タンパク質である。ここでは、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)とポリヒスチジンタグドロソフィラアラストシンを2ラウンドの親和性クロマトグラフィーで精製する方法を詳述する。インビトロで融合反応を研究するには、精製された融合タンパク質を脂質二重層に挿入する必要があります。リポソームは、脂質組成物およびサイズが調整されてもよいとして、理想的なモデル膜である。そのために、予め形成されたリポソームにショウジョウバエのアラストリンに対する洗剤除去による再構成法について述べた。いくつかの再構成方法が利用可能であるが、洗剤除去による再構成は、アラストシンおよび他の同様のタンパク質に適しているいくつかの利点を有する。この方法の利点は、高い再構成収率および再構成されたタンパク質の正しい向きを含む。この方法は、他の膜タンパク質およびプロテオリポソームを必要とする他のアプリケーションに拡張することができる。さらに、膜融合の測定として用いられるプロテオリポソームのFRETベース脂質混合アッセイについて述べる。

概要

膜融合は、多くの生物学的反応において重要なプロセスです。生物学的条件下では、膜融合は自発的ではなく、そのような反応を触媒するために特殊な融合タンパク質を必要^とする1.ERホモティピック膜融合は、ダイナミン関連GTPaseアラストシン2によって動物に媒介される。同質融合におけるアラストシンの役割は、末梢ERの三方接合部の基本であり、細胞全体に広がる管状の大規模な相互接続ネットワークを構成する。アラストニンは、大きなGTPase、3つのらせん束中ドメイン、疎水性膜アンカー、および短い細胞質C末端尾3からなる保存されたドメイン形態を有する。組換えショウジョウバエアラトミンを伴うインビトロ研究では、リポソームに再構成すると、そのフソジェニック特性を維持することが示されている。ヒトホモロを含む他のアラストチンは、インビトロでの融合を要約することができませんでした。ここでは、GSTとポリヒスチジンを精製する方法論について、アラストシンの組換えショウジョウバエをタグ付けし、リポソームに再構成し、融合をアッセイする方法論を説明する。

インビトロでの膜融合の研究は、通常、フソジェニックタンパク質が膜アンカーを持っているため、課題を提示します。それらを研究するためには、モデル脂質二重層にそれらを再構成する必要があります。大きなユニラメラ小胞(LUV)は、....

プロトコル

1. GST-DAtl-His8の精製

1. タンパク質発現とリサート製剤
   1. pGEX4-T3²のGST-DAtl-His8コンストラクトでBL21(DE3)大腸菌を変換し、アンピシリンプレート上で選択します。
   2. 14 mL培養チューブでLB+アンピシリン(100mg/mLアンピシリンの5μL)を単一の形質転換体を選択し、6-8時間の200rpmで振盪して25°Cでインキュベートします。
      注:漏れ発現のため、より高い温度でインキュベートすることはお勧めしません。25 °Cでの成長は、この成長期間中のタンパク質の凝集を減少させます。
   3. LB+アンピシリンの200mLを5mL培養の1mLで接種し、25°Cで一晩(〜15〜18時間)インキュベートします。
   4. 翌朝、遠心分離(2,000 x g~10分)で細胞を収穫し、LBの5mLで再中断する。
   5. LB+アンピシリンの4Lを接種し、OD 600(0.05~0.15)を測定します。振りながら25°Cでインキュベートします。
      注:細菌を追加する前に、OD₆₀₀測定のブランクとして機能するいくつかのメディアを予約します。
   6. OD_は....

結果

アラストシン再構成の効率を図2に示す。再構成されたプロテオリポソームは、イオエクソール不連続勾配で浮動させた。未組み込みタンパク質は、底層(B)または中間層(M)に堆積させた。再構成されたタンパク質は、最上層(T)に浮動するであろう。グラデーションのサンプルをSDS-PAGEおよびクーマシー染色によって採取し、分析した。デンシトメトリーによるゲルの定量は、ごくわずかな失いを伴う再構成の非常に高い効率を示しています。全タンパク質の96%は、最上層(T)に浮かぶプロテオリポソームとして見出された。タンパク質の1%未満が再構成されず、中間層(M)で見つかり、3%のみが再構成または凝集し、底層(B)に堆積した。

再構成の程度を記述することに加えて、再構成後のアラストシンの向きを分析し、トロンビン切断アッ^セイ14により定量化した。再構成されたタンパク質は、リポソームの内膜空間に直面して、間違った向きになる可能性があります。間違った方向のタンパク質は、脂質二重層によるタンパク質分化から保.......

ディスカッション

ここでの方法は、アラストシン組換えの核融合活性を精製、再構成、測定するための効率的な方法を示す。機能的なアラストインの高い収率を確保するためにいくつかの重要なステップを考慮する必要があります。.アラストシンの発現は、凝集を避けるために低温(16°C)で行う必要があり、1つは0.4〜1.5 mg/mLの間の最終的な濃度を目指す必要があります。非常に希薄なタンパク質は、脂質比に対して1:400タンパク質で最適に再構成されません。再構成効率は、ここで説明する浮動アッセイによって必要に応じて分析することができる(図2)。リポソーム浮遊アッセイの利点の1つは、脂質二重^層13に関連する可溶性タンパク質を分析するために拡張できることである。さらに、再構成されたタンパク質の配向は、プロテアーゼ^消化14によっても分析されてもよいが、これは間違った方向で再構成された誤ったタンパク質または凝集タンパク質または再構成を区別しないかもしれない(図3).......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 mL ポリプレップクロマトグラフィーカラム	Biored	731-1550
10 mm x 75 mm フリントガラス管	VWR	608225-402
直径 47 mm、0.45 μm 細孔 whatman 滅菌膜フィルター	Whatman	7141 104
96 ウェル ホワイト プレート	NUNC 437796
Anapoe X-100	Anatrace	9002-931-1
細胞かく乱物質	アベスチン	アベスチン エマルシフレックス C3
DOPS (1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン (ナトリウム塩))	アバンティ	840035P-10mg	DOPS
EDTA	リサーチ・オーガニックス株式会社	6381-92-6	エチレンジアミン四酢酸
EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル	ロシュ	11873580001	完全プロテアーゼ阻害剤
押出機	シグマアルドリッチ	Z373400	Liposofastベーシックエクストルーダー
GE Akta Prime液体クロマトグラフィーシステム	GE Pharmacia	8149-30-0006
グルタチオンアガロースビーズ	Sigma aldrich	G4510-50ml
グリセロール	EMD	GX0185-5
GTP	Sigma Aldrich	36051-31-7	グアノシン5 '三リン酸ナトリウム塩水和物
HEPES、アシッド	フリーOmnipur	5330
イミダゾール	フルーカ	5670
化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)樹脂カラム	GEヘルスケア	17040801	1mLハイトラップキレートHP固定化金属アフィニティークロマトグラフィーカラム
Iohexol	正確な化学および科学株式会社	AN 7050 BLK	Accudenz / Nycodenz
IPTG	研究製品国際株式会社	I56000-100.0	IPTG、ジオキサンフリー
L-グルタチオン還元	Sigma-Aldrich	G4251-5g
塩化マグネシウム	フィッシャー	7791-18-6
メタノール	オムニソルブ	MX0488-1
NBD-DPPE (1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル) (アンモニウム塩))	Avanti	236495	NBD-DPPE
n-ドデシル &β;-D-マルトシド	Chem-Impex International	21950
非極性ポリスチレン吸着剤 ビーズ	BioRad	152-3920	SM2 Biobeads
核細孔トラックエッチング ポリカーボネート 19 mm 0.1 μm 細孔膜	Whatman	800309
Optima LE80K 超遠心分離機	ベックマン・コールター
ホスファチジルコリン, L-&α;-ジパルミトイル [コリンメチル-3H]	ARC	ART0284	滴定脂質
プレートリーダー		TECAN TECAN infinite M200 プレートリーダー
POPC (1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン)	アバンティ	850457C-25mg	POPC
塩化カリウム	MP	151944
Rh-DPPE(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(リサミンローダミンBスルホニル)(アンモニウム塩))	Avanti	236495	Rh-DPPE
シンチレーションカクテル	国立診断	LS-272	Ecoscint XR水性または非水性サンプル用シンチレーション溶液
シンチレーションバイアル	ベックマン		592928 高速ターンキャップ ミニ Poly-Q バイアル
トロンビン	シグマ	T1063-1kU	ヒト血漿からのトロンビン
トリトン X-100	フィッシャー	BP151-500
超透明遠心分離管 5 mm x 41 mm	ベックマン	344090
ボルテックス 9 〜 13 mm チューブホルダー	VWR	58816-138	フリントガラス管
をボルテックスするためのインサートボルテックス インサート リテーナー	VWR	58816-132	ボルテックス チューブ ホルダーに必要なリテーナー
ボルテックス	VWR	2.235074	ボルテックス ジーニー 2 モデル G560
β-メルカプトエタノール分子生物学グレード	カルバイオケム	444203

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