Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Kern/shell druk steigers voor weefsel engineering van buisvormige constructies

doi: 10.3791/59951 Published: September 27, 2019

Summary

Gepresenteerd hier is een eenvoudig te gebruiken, Core/shell, driedimensionale bioprinten set-up voor één stap fabricage van holle steigers, geschikt voor weefsel engineering van vasculaire en andere buisvormige structuren.

Abstract

Driedimensionaal (3D) printen van kern-/shellfilamenten maakt directe fabricage van kanaal structuren mogelijk met een stabiele schaal die op de interface met een vloeibare kern wordt kruislings gekoppeld. De laatste wordt na het printen verwijderd, waardoor een holle buis achterblijft. De integratie van een additieve fabricagetechniek (zoals de hier beschreven met op maat gemaakte [bio] inkten, die structureel en biochemisch de inheemse extracellulaire matrix [ECM] nabootsen) is een belangrijke stap in de richting van geavanceerde weefsel techniek. Nauwkeurige fabricage van goed gedefinieerde structuren vereist echter op maat gemaakte fabricage strategieën die zijn geoptimaliseerd voor het materiaal dat wordt gebruikt. Daarom is het verstandig om te beginnen met een set-up die aanpasbaar, eenvoudig te gebruiken en compatibel is met een breed spectrum van materialen en toepassingen. Dit werk presenteert een eenvoudig te fabriceren kern/shell nozzle met Luer-compatibiliteit om core/shell Printing van hout structuren te verkennen, getest met een goed gedefinieerde, alginaat gebaseerde Steiger materiaal formulering.

Introduction

Het uiteindelijke doel van weefsel Engineering (te) is het produceren van functionele weefsels of organen in vitro, die kunnen worden gebruikt voor het regenereren of vervangen van gewonde of zieke delen van het menselijk lichaam1,2,3. Huidig onderzoek in weefsel Engineering (TE) is gericht op individuele aspecten van het veld (steigers materialen, fabricage procedures, celbronnen, enz.) 4,5, naast het ontwikkelen van eenvoudige in vitro modellen van weefsels en organen die fundamentele aspecten van hun in vivo tegenhangers nabootsen. Dergelijke modellen zijn al nuttig voor veel toepassingen, zoals geneesmiddelen screening en toxiciteitsstudies, vooral in gevallen waarin conventionele 2D-celculturen de dynamische reacties van de inheemse weefsels6,7niet nabootsen, 8,9. Driedimensionale in vitro modellen worden meestal geconstrueerd door het combineren van cellen10, fysisch-chemische cues11, en biologisch actieve moleculen12,13 op steigers, die worden verkregen uit decellularized weefsels of geconstrueerd de Novo van biologische of biocompatibele materialen14,15,16,17,18.

Het is cruciaal dat steigers de complexe 3D-microarchitectuur en hiërarchische structuur van de inheemse weefsels recapituleren om de functionaliteit van de gemanipuleerde weefsels mogelijk te maken, representatief voor in vivo-weefsels19. Ondanks de aanzienlijke technologische vooruitgang in TE, blijft de ontwikkeling van fysiologisch relevante kunstweefsel constructies een uitdaging. Dikke weefsels (> 200 μm in dikte) zijn vooral problematisch, als gevolg van beperkingen zoals zuurstof en nutriënt diffusie20. Er is vooruitgang geboekt in de richting van grotere weefsel constructies; de vereiste hoge nabijheid van cellen voor de bloedvaten om zuurstof en nutriënten te transporteren en de verwijdering van afvalstoffen te bevorderen, moet echter worden gehersorleerd. Vascularisatie van weefsels (of alternatief, vervaardiging van onderling verbonden 3D-vasculaire netwerken binnen weefsel constructies) speelt een cruciale rol bij het behoud van de levensvatbaarheid van de cel en het bevorderen van functies van in vitro engineered weefsels, wat moeilijker is voor modellen in langdurige experimenten21,22. Bovendien moet de vereiste resolutie, structurele integriteit en gelijktijdige biocompatibiliteit nog niet worden bereikt23.

Verschillende TE benaderingen zijn voorgesteld in een poging om bloedvat-achtige structuren te construeren en te vergemakkelijken vascularisatie in vitro. Enkele voorbeelden zijn het zaaien van endotheel cellen (ook samen met andere soorten cellen zoals fibroblasten) die zichzelf assembleren om microvasculaire netwerken te genereren24, gebruik van vasculaire voorlopercellen en pericytes die endotheliale cel bevorderen groei21,25, de levering van angiogene groeifactoren die de vascularisatie20,26induceren met behulp van de celplaat technologie die controle over vasculaire gelaagdheid20mogelijk maakt, en fabricage van zeer poreuze steiger structuren die angiogenese bevorderen27. De genoemde benaderingen richten zich op de inductie van angiogenese, die over het algemeen aanzienlijke hoeveelheden extra groeifactoren (bv. VEGF) en tijd tot vorm vereist. De grootste nadelen zijn echter hun beperkte reproduceerbaarheid en beperkte ruimtelijke controle over vasculaire patronen, wat meestal resulteert in een willekeurige vasculatuur verdeling binnen de weefsel constructie die niet noodzakelijkerwijs perfusie vergemakkelijkt.

Additieve productie (AM, zoals 3D bioprinting) wordt steeds meer betrokken bij de fabricage van 3D constructies met behulp van biologische of biocompatibele materialen om steigers te creëren die geschikt zijn voor TE. Verschillende AM-benaderingen worden parallel gebruikt en ontwikkeld (bijv. op inkt straal-en microextrusiegebaseerde methoden, verschillende soorten lithografische technieken) om steigers te produceren die inheemse weefsels nabootsen in hun architectuur, biochemie en functionaliteit . De individuele technieken vertonen bepaalde voor-en nadelen28, daarom worden verschillende wijzigingen onderzocht (bijv. micro-patronen, geïnduceerde angiogenese, enz.) om de mate waarin grote, complexe en stabiele vasculaire netwerken kunnen worden gefabriceerd22,29,30.

Onder deze, extrusiebioprinting is de meest gebruikte methode, vooral als gevolg van de brede waaier van compatibele materialen (een over het algemeen cel-vriendelijk proces28,31,32) en uitzonderlijke veelzijdigheid in toepassingsvoorwaarden (bijv. ingesloten en opofferings drukkerijen23,33, fabricage van holle constructies34,35, enz.). De belangrijkste uitdagingen voor het voorbezetten van huidige studies zijn de overdracht van 2D naar 3D structuren, de vorming van een dicht netwerk van holle buizen met een hoge ruimtelijke resolutie, en algehele mechanische integriteit en vorm getrouwheid tijdens vloeistofstroming in celkweek voorwaarden30.

De meest eenvoudige benadering van perfbruikbaar weefsel is de fabricage van een onderling verbonden netwerk van kanalen binnen de constructie. De creatie van dergelijke perfbruikbare kanalen binnen een weefsel steiger wordt verwacht dat veel van de bovengenoemde problemen op te lossen, omdat het onmiddellijk toelaat voor nutriënten en zuurstof diffusie terwijl het verwijderen van afvalproducten. Daarom wordt de mogelijke vorming van necrotische gebieden binnen de constructie vermeden36. Dergelijke kanalen kunnen bovendien worden geseeid met endotheel cellen (ECs) en dienen als kunstmatige bloedvaten in 3D-weefsel modellen37. In de meest elementaire zin kan een vat bestaan uit een hol kanaal, een zachte laag van ECs en een stijve schaal. Onlangs heeft 3D-extrusie van twee verschillende materialen in een core/shell-mode met behulp van co-axiale naalden voor extrusie veel belangstelling38,39,40,41opgedaan, omdat het de fabricage van holle buizen.

Net als bij conventionele microextrusie 3D-printen wordt core/shell Printing uitgevoerd met een coaxiale nozzle (bijv. twee naalden met verschillende diameters op dezelfde as op een manier uitgelijnd, zodat de bredere naald de smallere een omsluit). Zo kunnen twee materialen tegelijkertijd worden geëxtrudeerd, met een als het centrale filament of "binnenste" kern en een tweede als de "buitenste" shell41. Tot op heden, co-axiale bioprinten is gebruikt voor het fabriceren van structuren met solide42, Core/shell43, en holle strengen40,44; de gebruikte materialen zijn echter niet geoptimaliseerd voor zowel de optimale levensvatbaarheid van de cellen als de mechanische robuustheid van de gedrukte constructies. Zoals gezegd biedt de techniek de mogelijkheid om biomaterialen te combineren met verschillende mechanische eigenschappen, waarbij de stijvere één de zachtere ondersteunt. Wat nog belangrijker is, als het Steiger materiaal (bijv. alginaat, Carboxymethyl cellulose) wordt geëxtrudeerd als de schil, terwijl de kern die bestaat uit de kruisverbindende stof (bijv. calciumchloride) uit de binnenste capillaire wordt uitgespoeld en na het drukken wordt mogelijk om een doorlopende holle buis te fabriceren in een enkele stap45.

Met dit in gedachten, werd een eenvoudige en reproduceerbare methode met één stap ontwikkeld om goed gedefinieerde en perfbruikbare steigers te bouwen voor de engineering van vasculaire structuren en andere buisvormige weefsels. Om een kosteneffectieve technologie te ontwikkelen, moet de fabricage idealiter een proces in één stap zijn. Daarom werd een kern/shell-opstelling aangepast en geïntegreerd in de 3D bioprinter. Het basisontwerp bestaat uit een centrale nozzle gemaakt van metaal om vervorming tijdens de injectie te voorkomen, waarrond een tweede nozzle van een grotere diameter wordt geplaatst. Een dergelijke coaxiale nozzle-opstelling zorgt voor co-extrusie van de twee stromen en onmiddellijke dwarsbinding van het geëxtrudeerde hydrogel kanaal. Dit maakt directe fabricage van meerlaagse holle filamenten mogelijk, terwijl daaropvolgende cross-linking met hogere concentraties calciumchloride (CaCl2) zorgt voor meer permanente stabilisatie van buitenaf.

Als zodanig maakt deze methode gelijktijdige afdrukken van steigers en microkanalen mogelijk, waarbij de holle hydrogel-filamenten dienen als een steiger om de mechanische integriteit van 3D-constructies te ondersteunen en tegelijkertijd te fungeren als ingebouwde microkanalen voor het leveren van voedingsstoffen voor celgroei. Dit protocol biedt een gedetailleerde procedure van de core/shell 3D bioprinten strategie op basis van het gebruik van een op maat gemaakte co-axiale nozzle waarin hydrogel 3D structuren met ingebouwde kanalen worden vervaardigd door het beheersen van cross-linking om holle filamenten te produceren, die tijdens de celkweek geperfectiongebruikt blijven.

De 3D Printing set-up gebruikt in dit werk is geconfigureerd zoals eerder beschreven door Banović en Vihar46 en kan worden onderverdeeld in drie hoofdcomponenten: a) een drie-assige CNC mechanische set-up met 50 μm positionering nauwkeurigheid in de X, Y, en Z richtingen; B) twee Extruders, aangepast voor wegwerpspuiten van 5 mL Luer-Lock, met een resolutie van 1,2 μL Voxel; en C) het aansturen van elektronica en software.

Om core/shell Printing te vergemakkelijken, werd een geschikte nozzle ontwikkeld die kan worden gemonteerd op een van de extruders (primaire extruder, het printen van de kern) en is compatibel met G27 Blunt-end naalden. Het heeft ook Luer-Lock compatibiliteit om te verbinden met de tweede extruder (het afdrukken van de shell). De eerste prototypes werden vervaardigd door het inbrengen van een Blunt-end G27 naald (inwendige diameter = 210 μm, buitendiameter = 410 μm) in ofwel een G21 naald (inwendige diameter = 510 μm, buitendiameter = 820 μm) of G20 conische punt (inwendige diameter = 600 μm), dan het inbrengen van een secundair n Eedle lateraal om het omhulselmateriaal te leveren. Echter, als gevolg van lichte buiging van de naaldschacht, is het niet mogelijk om een mondstukuiteinde met concentrische uitlijning van de binnenste en buitenste naalden te produceren.

Om dit probleem op te lossen, werd een nieuw mondstuk ontwerp bedacht dat aan de volgende criteria voldeed: 1) het kan worden vervaardigd met behulp van een 3-assige CNC-molen, 2) het kan worden gemaakt van verschillende materialen (high performance plastics, zoals PEEK of metalen), 3) het heeft Luer-Lock compatibiliteit voor het aanbrengen van shell materiaal, en 4) is compatibel voor een G27 Blunt-end naald en houdt het op zijn plaats op twee posities om de punt uit te lijnen met de centrale as. Een schematische weergave van het mondstuk prototype is afgebeeld in Figuur 1.

Protocol

1. bereiding van hydrogels en crosslinking-oplossingen

  1. In het kort, door krachtig mengen, het oplossen van ALG en CMC poeders in ultra zuiver water voor het verkrijgen van een totaal 3 WT% ALG en 3 gew .% CMC-oplossing.
    Opmerking: in dit werk worden 5 mL spuiten gebruikt voor het printen; Zo wordt de uiteindelijke hoeveelheid materiaal aangepast aan dat volume. Voor andere extrusiecartridges en gedrukte steekproefgrootten moet de hoeveelheid bereid materiaal echter dienovereenkomstig worden geschaald.
  2. Voeg 1,5 WT% cellulose nanovezels toe aan het ALG-CMC mengsel voor extra mechanische versterking om de gewenste viscositeit te bereiken, geschikt voor afdrukken.
  3. Agitate de hydrogel suspensie tot homogeen met een overhead mixer.
    Opmerking: er mogen geen vezels of bubbels aanwezig zijn in de hydrogel.
  4. Bereid 10 mL van 100 mM calciumchloride (CaCl2) oplossing in ultra zuiver water, dat wordt gebruikt als de primaire dwars koppelings oplossing voor het printen.
  5. Bereid 10 mL 5 gew .% CaCl2 oplossing in ultra zuiver water, dat wordt gebruikt als secundaire dwars koppelings oplossing bij de nabewerking van steigers.
    Opmerking: in het algemeen, alle hydrogel formuleringen, die geschikt zijn voor onmiddellijke chemische cross-linking, toestaan voor één stap fabricage van holle buizen en kan worden gebruikt met dit type core/shell set-up. De druk-en dwars koppelings mechanismen moeten dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd. Viscositeit van de hydrogel zal variëren afhankelijk van de gewenste samenstelling; het kan echter worden aangepast met polymeer concentraties en de toevoeging van verdikkingsmiddelen (bijv. nanovezels). De ideale viscositeit voor het 3D printen van stabiele constructies is hoog genoeg voor de geëxtrudeerde gloeidraad om zijn vorm te behouden en voor de steiger om zijn eigen gewicht vast te houden voor cross-linking.

2. core/shell Printing van perfbruikbare steigers

  1. Voordat u afdrukt, steriliseren de bioprinter door het spuiten van 70% ethanol grondig en bloot aan UV-licht voor 1 h.
  2. Schakel de bioprinter in en voer de controlerende software uit, die in een bundel met de 3D-printer wordt geleverd.
  3. Voer de homing procedure uit door op het Start icoon te drukken.
  4. Werken met het werkbalk opdracht bestand | Importeer de g-code, importeer de gegenereerde steiger g-code.
  5. Breng de hydrogel over naar een steriele injectiespuit van 5 mL en plaats deze in een van de extruder-bevestigingen van de 3D-printer. Via de Luer-Lock en een korte buis, sluit deze aan de zijkant Luer ingang van de kern/shell nozzle.
  6. Breng de crosslinking-oplossing (100 mM CaCl2) over naar een andere steriele 5 ml spuit met een bijgevoegde G27 Blunt-end naald en plaats deze in de bovenste naald houder van de kern/ketel nozzle. De binnenste naald moet licht uitstekken (~ 1 mm) van de buitenste kern/shell-nozzle. Pas de uitlijning handmatig aan. Plaats de tweede spuit in de extrusiesteun.
  7. Om de spuiten correct in de bevestigingen te plaatsen (in afbeelding 2weergegeven), u beide extrusiebevestigingen handmatig bedienen door op de pijlen A en B en pijl- omhoog en pijl-omlaag te klikken.
  8. Voordat het afdrukken begint, wordt de hydrogel en de crosslinking-oplossing afzonderlijk geëxpocoat om alle overtollige luchtbellen in de kern/shell-nozzle te wissen en een continue hydrogel-stroom te garanderen.
  9. Met behulp van de Z en pijl-omlaag , handmatig aanpassen van de afstand tussen de nozzle en het afdrukken substraat. Het wordt aanbevolen om een plat, glas-Printing substraat te gebruiken, dat een goede hechting heeft. De extrusienozzle mag niet in contact zijn met de ondergrond om een ononderbroken stroom van de hydrogel mogelijk te maken. De optimale afstand tussen de nozzle en de ondergrond (laag hoogte) is meestal hetzelfde als de breedte van de buitenste nozzle diameter, maar wordt aangepast aan het gebruikte materiaal en de individuele druk parameters. Pas de begin afdrukhoogte aan volgens de individuele behoeften.
  10. Druk op de afspeel knop om het afdrukproces te starten.
    Opmerking: het wordt aanbevolen om het afdrukken van een rok (Figuur 3) rond de steiger te gebruiken om te zorgen voor het leggen van een homogene holle gloeidraad voordat het afdrukken van de eigenlijke steiger begint. Om optimale hydrogel stroom te bereiken met de intentie om optimale steigers af te drukken, varieert de samenstelling van de formulering, de compositie van de cross-linking-oplossing en de druk parameters (d.w.z. de druksnelheid, de extrusiedruk, de druk temperatuur, de afstand tussen de substraat en extrusiesproeier, enz.).
  11. Verwijder na het printen de ondergrond voorzichtig met de geprinte steiger en giet de secundaire dwars koppelings oplossing (5 gew .% CaCl2) over de hele steiger om de dwarsbinding over de gehele steiger te verzekeren. Incuberen gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT).
    Opmerking: Zorg ervoor dat de hele steiger in de cross-linking-oplossing wordt ondergedompeld. Deze stap is cruciaal voor het bereiken van de gewenste sterkte-eigenschappen van de steiger, maar zal variëren afhankelijk van de gebruikte materiaal en cross-linking methode.
  12. Met behulp van een scalpel handmatig knippen de overtollige rok materiaal.
  13. Steriliseer de steigers onder een UV-licht gedurende 30 min. Draai de steiger voorzichtig om en herhaal het sterilisatieproces.
  14. Maak de steiger voorzichtig los van de ondergrond door deze voorzichtig opzij te trekken. Als de steiger sterk hecht aan het substraat, scheid het dan door een scherpe rand tussen hen in te voegen.
  15. Breng de steiger in een kleurloze celkweek media (DMEM aangevuld met 5 gew .% FBS, 100 U/mL penicillaire en 1 mg/mL streptomycine), en inbroed ze bij 37 °C in een atmosfeer die 5 gew .% CO2 gedurende ten minste 24 uur bevat.

3. bereiding van endotheel cellen en levende/dode testoplossing

  1. Voor celculturing bereidt u het geavanceerde DMEM Cell Culture medium met toegevoegde fenolrood en vul het met 5 gew .% FBS en 2 mM L-glutamine. Voeg 100 U/mL penicillaire en 1 mg/mL streptomycine toe.
  2. Initieer de humane navelstreng ader endotheliale cel (huvec) lijn en doorgang ze in overeenstemming met huvec kweek protocollen zoals beschreven47.
    Opmerking: het wordt aanbevolen om de cellen in celkweek media te kweken met toegevoegde fenolrood voor eenvoudige visualisatie tijdens de injectie van de cellen in witte doorschijnende steigers zoals hieronder beschreven.
  3. Pipetteer voor celtellingen 100 μL cellen die zijn opgehangen in celkweek media en vlek ze met 900 μL 0,1 WT .% trypeen blauwe oplossing.
  4. Gebruik een geautomatiseerde cel teller of handmatige hemocytometer om te tellen en het geschatte aantal cellen in suspensie te verkrijgen.
  5. Voor de levende/dode test, bereid een oplossing van 4 mM Calcein-AM en 2 mM propidium jodide in steriele PBS.
    Opmerking: de Live/Dead-oplossing moet direct worden bereid voordat de test wordt verricht.

4. cellen overbrengen naar steigers

  1. Verwijder de steigers van celkweek media en breng ze over in een voldoende grote glazen Petri schaal.
  2. Onmiddellijk voordat de cellen in de steigers worden gebracht, dissociëren de HUVECs van de kolven met behulp van de behandeling met 0,25 gew .% trypsine.
    1. Gooi de celkweek media kort weg en inincubeer de cellen met 0,25 gew .% trypsine (~ 2 mL) gedurende 5 min bij 37 °C.
    2. Voeg na incubatie ~ 3 mL celkweek media toe aan de trypsinoiseerde cellen en breng alle losgekoppelde cellen over naar een centrifugebuis.
    3. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 x g en gooi het supernatant weg.
    4. Respendeer de cellen in verse celkweek media.
  3. Tel de cellen zoals eerder beschreven. Pas de totale celconcentratie aan op basis van individuele behoeften. In dit werk wordt een start concentratie van 340.000 cellen/mL gebruikt.
  4. Rebreng de cellen in een steriele spuit met een bijgevoegde Blunt G27 naald.
  5. Zoek een ingangspunt en begin met het zorgvuldig injecteren van cellen in de steigers. De celsuspensie stroomt door een doorschijnende steiger en moet zichtbaar zijn. Zorg ervoor dat de hele steiger gevuld is met celsuspensie.
  6. Dompel de steigers in celkweek media onder en inbroed ze bij 37 °C in een atmosfeer die 5 gew .% CO2 voor maximaal 10 dagen bevat.
  7. Vul de celkweek media aan volgens de experimentele behoeften.

5. levende/dode assay en celbeeldvorming

  1. Spoel de steigers af met PBS na incubatie.
  2. Injecteer met een stompe-end naald voorzichtig de eerder bereide levende/dode oplossing (4 mM calcein-AM en 2 mM propidium jodide in PBS) in de steigers en inincuberen ze gedurende 30 minuten bij 37 °C in PBS. Zorg ervoor dat de oplossing door de lengte van de hele steiger stroomt.
  3. Spoel de steigers af met PBS.
  4. Breng de steigers voorzichtig over naar een glazen glijbaan.
  5. Observeer de geverfde cellen direct in de steigers onder een fluorescentiemicroscoop.
    Opmerking: levensvatbare cellen produceren groene fluorescentie en dode cellen stralen rood fluorescentielicht uit.

Representative Results

Het doel van dit werk was het ontwikkelen van een eenvoudig te fabriceren kern/shell nozzle met Luer-compatibiliteit voor het printen van hout stapel structuren in de kern/shell. Daarnaast werd een eenvoudig en herhaalbaar One-Step Printing Protocol beschreven, dat eenvoudig te wijzigen is en geschikt is voor een breed scala aan materialen en verschillende chemische cross-linking-mechanismen om goed gedefinieerde en perfbruikbare steigers te bouwen voor Engineering van vasculaire en andere buisvormige weefselstructuren.

Kern/ketel sproeier
Het mondstuk bestaat uit een G27 Blunt-end naald (voor het printen van de binnenste axiale gloeidraad) en de nozzle Body, die de naald op zijn plaats houdt en een buitenste nozzle creëert voor de shell filament met een verbindingspoort voor materiaal invoer. Een schematisch beeld wordt weergegeven in Figuur 1. Twee 5 mL spuiten, die in de individuele extruders worden geplaatst en de kern-en schelp materialen leveren. Slang verbindt de nozzle lichaam met de spuit, het verstrekken van de shell materiaal.

De volledige montage van de kern/shell nozzle en de set-up van de spuit wordt getoond in Figuur 2. De eerste functionele prototype van de nozzle lichaam werd vervaardigd door CNC frezen een blok van polyoxymethyleen (POM). Compatibiliteit en afdichting tussen het element, een G27 naald en slang werd getest door het installeren in Vitaprint. Er werd geen lekkage van het omhulselmateriaal waargenomen in de nozzle, Luer-lock-connector of tussen lichaam en naald. Het mondstuk lichaam past strak met de naald naaf (Luer connector), waardoor de gesynchroniseerde beweging van de hele nozzle met de extruder wordt verzekerd.

Steiger gebouw
De meest eenvoudige benadering van het fabriekeren van steigers is door het storten van materialen laag voor laag waar de afdrukrichting wordt gewijzigd elke opeenvolgende laag, meestal onder een hoek van 90 °. Door de visco-elastische en hygroscopische eigenschappen van de hydrogels blijft het behoud van de vorm getrouwheid van de gedrukte structuren een uitdaging. Het belangrijkste doel van dit protocol gedeelte is het 3D printen van perfbruikbare core/shell steigers met behulp van twee polymeren, die eerder veelbelovende resultaten hebben getoond voor steiger Building (ALG en CMC) met de toevoeging van cellulose nanovezels (NFC) voor verhoogde mechanische stabiliteit. Zowel ALG als CMC zijn negatief geladen, in water oplosbare lineaire copolymeren48 en beide bevatten carboxylgroepen, die kunnen worden kruislings gekoppeld met de toevoeging van divalente kationen. CA2 + deeltjes vormen Ionische bindingen met twee functionele groepen tegelijk, die verbindingen vormen tussen polymeerketens, waardoor de gelstijfheid toeneemt.

Bedrukking van perfbruikbare steigers
Het doel van dit proces is het 3D-printen van eenvoudige houtstapel steiger constructies, die over meerdere lagen beslaan en hun vorm getrouwheid en perfusability behouden totdat ze volledig kruislings gekoppeld zijn. Dit vereist zelfs coextrusie van Core en shell zonder crossover of terugtrekking bewegingen, die de stroom kan onderbreken. Daarom zijn typische CAD-modellering en snijden methoden minder geschikt. In dit werk wordt een handmatig ontworpen g-code gebruikt en een op python gebaseerde g-code generator is ontwikkeld voor snelle voorbereiding van g-code.

De steigers werden gestructureerd in een hout stapel grid vorm en gebouwd op een vlakke glazen oppervlak. De fabricage werd laag-voor-laag uitgevoerd, waarbij de kruisende lijnen van elke volgende laag in een hoek 90 ° naar de vorige lagen. Bovendien was elke volgende laag 2% smaller in de X-en Y-richtingen, waardoor doorlopende filament ondersteuning door voorgaande lagen werd verzekerd. De afstand tussen filamenten (macroporie grootte) kan nauwkeurig in de g-code worden ontworpen door rekening te houden met de buitendiameter van de geëxtrudeerde gloeidraad (0,8 mm) en de afstand tussen de rasterlijnen (3 mm).

Steigers moesten voldoen aan belangrijke Inclusiecriteria voor verdere behandeling. Ten eerste waren steigers met ten minste 4 lagen in hoogte nodig om hun structurele integriteit en geometrie (bv. macroporie grootte) tijdens het printen te behouden om in aanmerking te komen voor verdere ontwikkeling. Ten tweede moesten steigers behouden blijven (stabiele microkanalen), zelfs nadat ze 7 dagen in celkweek media op 37 °C werden geïnineerd. Op gepaste tijdstippen (1, 2, 5, en 7 dagen) werden de steigers uit de kweekmedia gehaald en getest om te zien of ze nog steeds perfinzetbaar waren. In Fig. 4atoont de dwarsdoorsnede van een vers bedrukte en achteraf bewerkte steiger een duidelijk zichtbaar hol kanaal in de gloeidraad. In figuur 4bis het duidelijk dat, zelfs na 72 h incubatie in celkweek media bij 37 °c, de gloeidraad de holle structuur door de hele steiger lengte behoudt.

Verschillende formuleringen waren printbaar, bleven structureel stabiel, behouden de gedrukte geometrie en bleven perfbruikbaar; Er werd echter één gekozen voor verdere tests (d.w.z. 3 gew .% ALG + 3 gew .% CMC + 1,5 gew .% NFC), waardoor het afdrukken van perfbruikbare steigers met maximaal 10 lagen mogelijk werd. Het afdrukproces met de aangepaste nozzle wordt weergegeven in figuur 5a. Core/shell Printing was mogelijk met minder visceuze formuleringen; gels met hogere concentraties stonden echter niet toe dat de nozzle continu doorstroming werd. Voor primaire dwarsbinding (kernmateriaal, geleverd tijdens het printen) werd 100 mM CaCl2 gebruikt, die de continue vorming van een holle filament adequaat stabiliseerde, zonder dat er gel-stolling in de nozzle werd veroorzaakt. Na het drukken werden de steigers geweekt in een 5 gew .% CaCl2 -oplossing om de hydrogel volledig te koppelen aan de lange-termijn vorm getrouwheid. Een afgewerkte steiger monster wordt afgebeeld in Figuur 5b. Tijdens het optimalisatieproces van de formulering werd een kunstmatige kleurstof gebruikt in de kernoplossing, om visuele evaluatie mogelijk te maken en de kwaliteit van de geëxtrudeerde gloeidraad te onderzoeken. De kleurstof werd niet gebruikt voor de fabricage van de laatste steigers, die werden voorbereid voor het zaaien en kweken van cellen.

Live/Dead assay
Na incubatie werd een levende/dode assay gebruikt om de ECs te visualiseren en onderscheid te maken tussen de levende (groene) en de dode (rode) cellen binnen de geïnde ruimte. Dit diende twee hoofddoelen: A) om te bepalen of de steigers een biocompatibele omgeving bieden om groei en hechting te bevorderen zonder schadelijke effecten op de cel te vertonen, en B) om de structurele integriteit van buisvormige structuren en hun intern kanaalsysteem in meer detail.

De resultaten van de Live/Dead assay worden weergegeven in Figuur 6. In aanwezigheid van intracellulaire esterases, wordt het plasma membraan permeabel Calcein-AM omgezet in Calcein, wat groen fluorescentielicht uitstraalt in levende cellen. Aan de andere kant, apoptotische cellen worden gevisualiseerd door membraan ondoordrijvend propidium jodide, die fluoresceert in rood wanneer geïntercaleerd in de DNA dubbele helix. Live/Dead beelden en helder-veld foto's van steigers werden gecombineerd om te helpen visualiseren van de cellen in de holle kanalen. De kleurings oplossing werd geïnjecteerd en de test trad rechtstreeks op in de 3D-geprinte steigers na de incubatie van de steiger voor 48 uur.

Opgemerkt moet worden dat een relatief kleine zaaien dichtheid van ECs werd gebruikt (340.000 cellen/ml), als deze studie diende alleen als een proof-of-concept voor Core/shell afdrukken van perfbruikbare steigers. De belangrijkste conclusie van de levende/dode assay is dat zelfs na 48 h, geen dode cellen (rood) werden waargenomen, wat bewijst dat noch het Steiger materiaal zelf, noch zijn afbraakproducten toxische effecten vertoonden. Bovendien, de ECs deed in feite hechten en blijven gehecht binnen de steigers en leek te vormen gelijkmatig verdeelde agglomeraten wanneer geteeld in de kanalen. Dit suggereert dat de beschreven fabricagemethode en de steiger-formulering een geschikt kader bieden voor het bouwen in vivo, relevante, tubulaire weefsel morfologieën. Naast het nabootsen van CELECM-interacties en strakke celcelcommunicatie in alle drie de ruimtelijke dimensies, vereist complexe weefsel engineering ook een constante celblootstelling aan vers medium om hun levensvatbaarheid te behouden. Dit kan op zijn beurt worden bereikt door een dicht kanaalnetwerk onder voortdurende perfusie, die verder onderzoek in toekomstige werk rechtvaardigt, en zal vereisen optimalisatie van materiaal en groei parameters om lange termijn weefsel engineering van vasculature te vergemakkelijken.

Figure 1
Figuur 1: prototype van de kern/shell-nozzle. A) het algehele ontwerp en de hoofdcomponenten van het prototype van het nozzle-lichaam worden weergegeven. Het mondstuk wordt voltooid door het inbrengen van een Blunt-end G27 naald door de bovenkant. De bovenste en onderste naald houders immobiliseren en opnieuw uitlijnen van de naald met de nozzle-as, ervoor te zorgen dat de tip zich uitstrekt van de nozzle door het centrum.  Om de nozzle te verbinden met het "shell"-materiaal dat uit de secundaire spuit wordt geëxtrudeerd, wordt slang met een Luer-lock-connector aan de laterale ingang bevestigd. Vanaf hier wordt het materiaal door een smal kanaal naar de nozzle doorgestuurd. De fabricage van het genoemde kanaal vereist boren in twee posities, het produceren van gaten die moeten worden afgedekt na de productie). B) afgebeeld is een close-up van de nozzle met een ingebracht G27 naald, die zich uitstrekt uit de nozzle. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Final core/shell-opstelling. (A) getoond is de voltooide core/shell nozzle met correct bevestigde spuiten met de hydrogel (rechts), het bouwen van de "shell" en dwars koppelings oplossing (links) geëxtrudeerd als de "kern". (B) getoond is de core/shell set-up geïnstalleerd in het Vitaprint systeem met twee extruders. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: G-code van de buisvormige steiger. Hier wordt een screenshot van de printersoftware getoond, met name de Path Preview (a) en RAW g-code van de eerste laag (B). De g-code is een set instructies met doel coördinaten in absolute ruimtelijke richtingen (X, Y, Z), evenals extrusie (A, B) in relatieve richtingen. De G-opdracht bepaalt het type instructie, terwijl G1 de lineaire beweging naar de doel coördinaten vertegenwoordigt en G92 de initiële startpositie bepaalt. Bovendien wordt de feed-rate van de volgende commando's bepaald met instructie F in mm/min. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: dwarsdoorsnede van een steiger strand met een hol interieur. A) het doorsnede segment van de vers gedrukte en achteraf bewerkte steiger. B) is het transversale segment van de steiger nadat het in celkweek media voor 72 uur is geïnineerd. Terwijl de mondstuk vorm de extrusie van een buis met een ronde dwarsdoorsnede definieert, lijkt het filament enigszins afgevlakt op depositie. Het interne kanaal blijft echter intact en behoudt zijn vorm tijdens de incubatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Core/shell Printing van steigers. Hier worden fabricage (A) van een drie-laags holle buis steiger en de uiteindelijke vorm (B) getoond. Voor een verbeterde visualisatie werd de crosslinking-oplossing in de kern gekleurd met een rode kleurstof. De formulering vertoont voldoende mechanische stabiliteit om steiger stabiliteit te behouden, zelfs als dikkere structuren (tot 10 lagen, gegevens niet weergegeven) zijn gefabriceerd. De buitenste afmetingen van de uiteindelijke structuur waren ongeveer 27 mm x 27 mm x 3,5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Live/Dead assay die rechtstreeks in de steigers wordt uitgevoerd. Een suspensie van HUVECs werd geïnjecteerd in het binnenste steiger kanaal, geïnventariseerd voor 48 h, en behandeld met levende/dode kleurstof. Levensvatbare HUVECs uitzenden groen fluorescentielicht, dat wordt weergegeven in de heldere vlekken van het beeld. Dode cellen stralen groen fluorescentielicht uit; echter, geen zijn zichtbaar in de waargenomen Scaffold. De verdeling van de cellen betekent ook de vorm en de bewaarde perfusie capaciteiten van de kanalen. In mindere mate heeft de Live/Dead assay-oplossing ook het Steiger materiaal bevlekt, waardoor licht fluorescentie onder de Microscoop wordt geproduceerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Ontwerp van de nozzle
Met behulp van de ontwikkelde Core/shell nozzle, geïntegreerd in een twee-extruder Vitaprint systeem, holle, buisvormige steigers werden vervaardigd in een proces in één stap. Om een gelijkmatige dikte van de buiswand door de meeste van de voorbereide steigers te bereiken, moet de naald centraal op de as van de buitenste extrusiering worden geplaatst. Standaard Gauge naalden vertonen vaak een lichte, maar significante excentricplaats van de as. Zo is de nozzle-body ontworpen om de naald op twee plaatsen te houden, eenmaal aan de bovenkant (de naaf vast te stellen) en één keer voor de laatste kern/shell kamer (de canule zelf te bevestigen), waardoor de axiale uitlijning wordt gecorrigeerd. De precisie van de axiale uitlijning neemt toe met de afstand tussen het fixatie punt. Er is echter een afweging tussen naald lengte en beschikbaar mondstuk kamervolume. Om de functionaliteit van de set-up verder te verbeteren, kunnen bepaalde wijzigingen van de nozzle worden geïmplementeerd: A) een nozzle-bevestiging met verbeterde stabiliteit, B) extra nozzles voor een breder bereik van naald compatibiliteit, C) een nauwkeurig instelmechanisme voor Nozzle-positionering, en D) het integreren van extra ingangen en microfluïdische apparaten voor on-the-fly materiaal voorbereiding.

Hydrogel-optimalisatie
Om te bepalen van de optimale ALG: CMC ratio, verschillende materiaal iteraties zijn geëvalueerd. In het algemeen, Core/shell afdrukken met concentraties boven 3 gew .% van beide componenten werd onmogelijk gemaakt, omdat het niet mogelijk voor een continue hydrogel stroom of resulteerde in verstopping van het mondstuk. In het bijzonder verhoogde ALG-concentratie boven 3 gew .% de viscositeit overmatig en resulteerde in het verstopping van de nozzle, terwijl lagere ALG-concentraties en hogere CMC (> 3 gew .%) concentraties de Kruis koppelings tijden vertraagde en dus niet voldoende structurele steun van de steiger. Core/shell Printing was mogelijk met minder visceuze formuleringen; geëxtrudeerde gel viscositeit moet echter voldoende zijn om de vorm getrouwheid op lange termijn te ondersteunen. Uiteindelijk bleek een 1:1 ALG: CMC ratio de meest geschikte keuze te zijn die een eerdere studie van Maver et al.49bevestigt. De toevoeging van NFC heeft de bedrukbaarheid en structurele stijfheid van de kern/schelp geprinte steigers aanzienlijk verbeterd, maar had geen significant effect op de cross-linking eigenschappen van het materiaal.

Aangepaste toepassingen, geoptimaliseerd voor specifieke celtypen en experimentele opstellingen zullen goed op maat gemaakte steiger materialen vereisen, die variëren in samenstelling en cross-linking mechanismen. De methode die in dit werk wordt beschreven, is gebaseerd op een gemengde polymeeroplossing van alginaat-cellulose, die Ionisch wordt gecrosslinkt met CA2 + ionen. Alginaat zelf is een lineair polymeer van blokken van (1, 4)-gekoppeld β-d-mannuronaat (M) en α-l-guluronaat (G) residuen die omkeerbaar kunnen worden gecrosslinkt door toepassing van CA2 + en andere divalente kationen zoals SR2 +, BR2 +, mg 2 +. Niettemin, de meest gebruikte Ion voor cross-linking van alginaat blijft CA2 + in de vorm van CACL2. CA2 + kan ook worden gebruikt in de vorm van caso4 of CaCO3; echter, de lage oplosbaarheid van CaSO4 ten opzichte van CACL2 betekent tragere gelatie. CaCO3 levert nog langzamere gelatie tijden, wat kan resulteren in zwakke en inconsistente mechanische eigenschappen.

Langere gelatie tijden produceren doorgaans een meer homogene constructie, maar bepaalde toepassingen, zoals core/shell Printing, vereisen een snelle gelatie snelheid50. Mg2 + ionen induceren ook gelatie; echter, hun cross-linking efficiëntie is ongeveer 5x-10x lager, in vergelijking met CA2 +, met cross-linking tijden van 2-3 h. Bovendien zijn magnesium ionen selectiever in de richting van guluronische eenheden, vandaar dat de dwarsbinding meer afhangt van de chemische samenstelling van de ALG51. In dit geval is een snel gelatie percentage essentieel om continue holle kanaal vorming te garanderen voordat de holle structuur kan instorten. CaCl2 levert de snelste gelatie snelheid, wat cruciaal is voor de directe afzetting van holle filamenten. 100 mM CaCl2 werd gebruikt, die de continue vorming van een holle gloeidraad adequaat stabiliseerde zonder gel-stollen in de nozzle te veroorzaken.

Printen en nabewerken van steigers
De volgende stappen moeten worden overwogen tijdens dit deel van het proces, inclusief 1) om ervoor te zorgen dat alle oplossingen en materialen, inclusief de 3D bioprinter, goed worden gesteriliseerd voordat ze worden afgedrukt. 2) bij de bereiding van de hydrogel is homogeniteit van het materiaal cruciaal voor continu printen. Introductie van onzuiverheden of luchtbellen moet worden vermeden, omdat ze het mondstuk kunnen verstoppen en/of de extrusie verstoren. 3) de spuiten moeten correct worden aangesloten op de kern/shell nozzle via het Luer-Lock mechanisme en correct worden ingebracht in de extruder mounts zoals te zien in Fig. 2a, B. 4) voordat u een complexe structuur afdrukt, is het raadzaam om een klein gedeelte van de gel en dwars koppelings oplossing vooraf te extrueren om de overtollige luchtbellen in de kern/shell-nozzle te wissen en een continue hydrogel-stroom te garanderen. Dit kan direct in de g-code worden opgenomen om de herhaalbaarheid te verbeteren. 5) het is handig om een rok rond de steiger toe te voegen om te zorgen voor het leggen van een homogene holle gloeidraad voordat de druk van de steiger zelf begint.

Bovendien, 6) om de hechting tussen het druk filament en de ondergrond te verbeteren, wordt aanbevolen om een vlakke ondergrond te gebruiken met een goede hechting (d.w.z. een glazen glijbaan of Petri schaaltje). 7) de extrusienozzle mag niet in direct contact staan met de ondergrond om een ononderbroken stroom van de hydrogel mogelijk te maken. De initiële afstand zal de kwaliteit van de print sterk beïnvloeden, maar de dikte van de geëxtrudeerde gloeidraad is een goede benadering van de initiële instelling. 8) de beginhoogte van de druk in de g-code moet worden aangepast aan de individuele behoeften. Nadat de afdrukparameters zijn geoptimaliseerd, moet de steiger g-code worden geïmporteerd in Planet CNC-software en het afdrukproces is gestart zoals beschreven in het protocol. 9) om de hydrogel stroom te controleren en te optimaliseren met de intentie om optimale steigers af te drukken, moeten zowel de formulerings samenstelling als de druk parameters worden gevarieerd (d.w.z. druksnelheid, extrusiedruk, druk temperatuur, afstand tussen de ondergrond en extrusiesproeier, laag hoogte, steiger grootte, enz.).

Over het algemeen zijn hogere stromingssnelheden nodig om formuleringen met een hogere viscositeit af te drukken. Zoals vermeld, alle hydrogel formuleringen, die geschikt zijn voor onmiddellijke chemische cross-linking, toestaan voor één stap fabricage van holle buizen en kan worden gebruikt met de beschreven core/shell set-up. De druk-en dwars koppelings mechanismen moeten dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd. Na het drukken werden alle steigers post-verwerkt door secundaire dwarsbinding met 5 gew .% CaCl2 -oplossing, die volledige dwarsbinding van de alg-CMC component verzekerde en gesteriliseerd van beide zijden onder een UV-licht gedurende ten minste 30 minuten. Er moet voor worden gezorgd dat de steiger volledig met de dwars koppelings oplossing wordt overspoeld en lang genoeg wordt ingeïninbroed om het kruislings proces te voltooien. De nabewerking zal verschillen op basis van het gebruikte materiaal-en dwars koppelingsmechanisme, dat vooraf moet worden overwogen. Na de verwerking moeten steigers zorgvuldig worden verwijderd uit het substraat, overgebracht naar celkweek media, en geïnnobeerd in een gecontroleerde atmosfeer gedurende ten minste 24 uur vóór het zaaien van de cel. Het gebruik van een kleurloos medium zal de zichtbaarheid van de celsuspensie tijdens de injectie in de steigers verbeteren.

Live/Dead assay
De levende/dode oplossing moet direct worden bereid voordat de test wordt verricht en in het donker wordt gehouden voordat de test wordt verricht, aangezien deze fluorescentie kleurstoffen bevat die gevoelig zijn voor bleken. Na de gewenste incubatietijd moet de celkweek media zorgvuldig worden weggegooid rond de steigers en worden gespoeld met PBS. Idealiter moet hetzelfde ingangspunt worden gebruikt voor het zaaien van cellen, gevolgd door de levende/dode assay die in de steigers wordt geïnjecteerd.

Belang van de resultaten
Zowel ALG als CMC zijn al gebruikt ter bevordering van angiogenese in vitro. Op basis van de ECM-mimetic functies, fysieke cross-linking en biocompatibiliteit, is ALG vaak gebruikt als een component voor levering en gecontroleerde afgifte van angiogene groeifactoren (bijv. bFGF, HGF, VEGF164 en ang-1 * respectievelijk)52 ,53,54. Bovendien is CMC in combinatie met gelatine ook gebruikt voor het inkapen van vasculaire endotheliale cellen vanwege de snel kruislings mogelijkheden onder fysiologische omstandigheden55. NFC werd toegevoegd om de mechanische stabiliteit en vorm getrouwheid van steigers verder te verhogen. Er moet worden benadrukt dat het doel niet was om de vascularisatie te verbeteren, maar om de mogelijkheid aan te tonen om perfbruikbare, holle ALG-CMC-steigers te produceren, gedrukt in core/shell-mode, die ook de hechting en proliferatie van Endotheelcellen navelstreng aderen. De keuze voor het gebruik van een ALG-CMC-mengsel was gebaseerd op de bevindingen van veelgebruikte, gemakkelijk toegankelijke en biocompatibele basismaterialen die de core/shell-afdrukken van holle kanalen mogelijk zouden maken. Veel andere materialen kunnen meer levensvatbare opties voor het verbeteren van angiogenese; Sommige zijn echter niet geschikt voor het printen van kern/shell, omdat ze geen snelle gelatie/cross-linking mogelijk maken, wat cruciaal is in deze aanpak.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

De auteurs willen de financiële steun voor dit project van het Sloveense onderzoeksbureau erkennen (subsidie nummers: P3-0036 en i0-0029), en het ministerie van Wetenschappen, onderwijs en sport (subsidie nummer: 5442-1/2018/59).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alginic acid sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) 180947 powder; Mw ~80,000
ATTC HUV-EC-C [HUVEC] LGC Standards (UK) ATCC-CRL-1730 Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings.
Axiovert 40 inverted optical microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany) three contrastingtechniques in one objective – e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC
Calcium chloride Sigma-Aldrich (Germany) C1016 anhydrou; granular; ≤7.0 mm; ≥93.0%
Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v)) The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA) nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns
ELGA Purelab water purification system Veolia Water Technologies (UK)
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) AMF4300 a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications
Gibco Advanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Advance DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 12491015 high glucose; no glutamine; phenol red
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 21063029 high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red
Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 10270106 FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS
Hypodermic Sterican needle B. Braun Melsungen AG (Germany) 9180117 0.40 x 25mm, 27G x 1''
L-glutamine Sigma-Aldrich (Germany) G3126 ReagentPlus®, ≥99% (HPLC)
Live/Dead Cell Double Staining Kit Sigma-Aldrich (Germany) 4511 contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence
Nunc EasYFlask cell culture flasks ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 156367 Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2
Omnifix syringe B. Braun Melsungen AG (Germany) 4617053V 5 mL Luer Lock
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) P3032 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich (Germany) P4417 tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 °C
Sodium carboxymethyl cellulose Sigma-Aldrich (Germany) 419338 powder; average Mw ~700,000
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich (Germany) S9137 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Ultra-pure water Veolia Water Technologies (UK) 18.2 m? cm at 25?C
VitaPrint 3D bio-printer IRNAS (Slovenia)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51, (1), 8-12 (2016).
  2. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering complex tissues. Science Translational Medicine. 4, (160), (2012).
  3. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P., Langer, R. Progress in tissue engineering. Scientific American. 300, (5), 64-71 (2009).
  4. Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22, (2), 101-113 (2016).
  5. Park, K. M., Shin, Y. M., Kim, K., Shin, H. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2017: A Year in Review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24, (5), 327-344 (2018).
  6. Mattei, G., Giusti, S., Ahluwalia, A. Design criteria for generating physiologically relevant in vitro models in bioreactors. Processes. 2, (3), 548-569 (2014).
  7. Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three‐dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100, (1), 59-74 (2011).
  8. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, (5-6), 240-249 (2013).
  9. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12, (4), 207-218 (2014).
  10. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews Drug Discovery. 15, (11), 751-769 (2016).
  11. Di Nardo, P., Minieri, M., Ahluwalia, A. Stem Cell Engineering. Springer. 41-59 (2011).
  12. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. Journal of the Royal Society Interface. 8, (55), 153-170 (2011).
  13. Tayalia, P., Mooney, D. J. Controlled growth factor delivery for tissue engineering. Advanced Materials. 21, (3233), 3269-3285 (2009).
  14. Caddeo, S., Boffito, M., Sartori, S. Tissue Engineering Approaches in the Design of Healthy and Pathological In Vitro Tissue Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 40 (2017).
  15. Chang, H. -I., Wang, Y. Regenerative medicine and tissue engineering-cells and biomaterials. InTech. (2011).
  16. Rice, J. J., et al. Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials. Advanced Healthcare Materials. 2, (1), 57-71 (2013).
  17. Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocols. 11, (10), 1775-1781 (2016).
  18. Yu, Y., Alkhawaji, A., Ding, Y., Mei, J. Decellularized scaffolds in regenerative medicine. Oncotarget. 7, (36), 58671-58683 (2016).
  19. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, (4), 655-663 (2009).
  20. Lovett, M., Lee, K., Edwards, A., Kaplan, D. L. Vascularization strategies for tissue engineering. Tissue Engineering Part B: Reviews. 15, (3), 353-370 (2009).
  21. Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26, (8), 434-441 (2008).
  22. Bae, H., et al. Building vascular networks. Sci Transl Med. 4, (160), (2012).
  23. Štumberger, G., Vihar, B. Freeform Perfusable Microfluidics Embedded in Hydrogel Matrices. Materials. 11, (12), 2529 (2018).
  24. Ibrahim, M., Richardson, M. K. Beyond organoids: In vitro vasculogenesis and angiogenesis using cells from mammals and zebrafish. Reproductive Toxicology. 73, 292-311 (2017).
  25. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Influence of adult mesenchymal stem cells on in vitro vascular formation. Tissue Engineering Part A. 15, (7), 1751-1761 (2009).
  26. Davies, N. H., Schmidt, C., Bezuidenhout, D., Zilla, P. Sustaining neovascularization of a scaffold through staged release of vascular endothelial growth factor-A and platelet-derived growth factor-BB. Tissue Engineering Part A. 18, (1-2), 26-34 (2012).
  27. Li, X., He, J., Zhang, W., Jiang, N., Li, D. Additive manufacturing of biomedical constructs with biomimetic structural organizations. Materials. 9, (11), 909 (2016).
  28. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, (8), 773 (2014).
  29. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35, (26), 7308-7325 (2014).
  30. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Advanced Materials. 26, (19), 3124-3130 (2014).
  31. Huang, Y., Zhang, X. F., Gao, G., Yonezawa, T., Cui, X. 3D bioprinting and the current applications in tissue engineering. Biotechnology Journal. (2017).
  32. Wang, X., et al. 3D bioprinting technologies for hard tissue and organ engineering. Materials. 9, (10), 802 (2016).
  33. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1, (9), e1500758 (2015).
  34. Rocca, M., Fragasso, A., Liu, W., Heinrich, M. A., Zhang, Y. S. Embedded Multimaterial Extrusion Bioprinting. SLAS Technology. 23, (2), 154-163 (2018).
  35. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1, (9), e1500758 (2015).
  36. Huang, S., Yang, Y., Yang, Q., Zhao, Q., Ye, X. Engineered circulatory scaffolds for building cardiac tissue. Journal of Thoracic Disease. 10, (Suppl 20), S2312-S2328 (2018).
  37. Hoch, E., Tovar, G. E., Borchers, K. Bioprinting of artificial blood vessels: current approaches towards a demanding goal. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 46, (5), 767-778 (2014).
  38. Yeo, M., Lee, J. S., Chun, W., Kim, G. H. An Innovative Collagen-Based Cell-Printing Method for Obtaining Human Adipose Stem Cell-Laden Structures Consisting of Core-Sheath Structures for Tissue Engineering. Biomacromolecules. 17, (4), 1365-1375 (2016).
  39. Liu, W., et al. Coaxial extrusion bioprinting of 3D microfibrous constructs with cell-favorable gelatin methacryloyl microenvironments. Biofabrication. 10, (2), 024102 (2018).
  40. Gao, Q., He, Y., Fu, J. Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial nozzle-assisted 3D bioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  41. Akkineni, A. R., Ahlfeld, T., Lode, A., Gelinsky, M. A versatile method for combining different biopolymers in a core/shell fashion by 3D plotting to achieve mechanically robust constructs. Biofabrication. 8, (4), 045001 (2016).
  42. Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Advanced Materials. 28, (4), 677-684 (2016).
  43. Kim, G., Ahn, S., Kim, Y., Cho, Y., Chun, W. Coaxial structured collagen–alginate scaffolds: fabrication, physical properties, and biomedical application for skin tissue regeneration. Journal of Materials Chemistry. 21, (17), 6165-6172 (2011).
  44. Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2, (6), 777-783 (2013).
  45. Mistry, P., et al. Bioprinting Using Mechanically Robust Core-Shell Cell-Laden Hydrogel Strands. Macromolecular Bioscience. 17, (6), (2017).
  46. Banović, L., Vihar, B. Development of an extruder for open source 3D bioprinting. Journal of Open Hardware. 2, (1), (2018).
  47. HUV-EC-C [HUVEC] (ATCC® CRL-1730™) Homo sapiens umbilical vein. Available from: http://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1730.aspx?geo_country=si#documentation (2019).
  48. Habib, A., Sathish, V., Mallik, S., Khoda, B. 3D printability of alginate-carboxymethyl cellulose hydrogel. Materials. 11, (3), 454 (2018).
  49. Maver, T., et al. Combining 3D printing and electrospinning for preparation of pain-relieving wound-dressing materials. Journal of Sol-Gel Science and Technology. 1-16 (2018).
  50. Kuo, C. K., Ma, P. X. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: Part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties. Biomaterials. 22, (6), 511-521 (2001).
  51. Topuz, F., Henke, A., Richtering, W., Groll, J. Magnesium ions and alginate do form hydrogels: a rheological study. Soft Matter. 8, (18), 4877-4881 (2012).
  52. Perets, A., et al. Enhancing the vascularization of three-dimensional porous alginate scaffolds by incorporating controlled release basic fibroblast growth factor microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 65, (4), 489-497 (2003).
  53. Ruvinov, E., Leor, J., Cohen, S. The effects of controlled HGF delivery from an affinity-binding alginate biomaterial on angiogenesis and blood perfusion in a hindlimb ischemia model. Biomaterials. 31, (16), 4573-4582 (2010).
  54. Peirce, S. M., Price, R. J., Skalak, T. C. Spatial and temporal control of angiogenesis and arterialization using focal applications of VEGF164 and Ang-1. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, (3), H918-H925 (2004).
  55. Kageyama, T., et al. In situ cross-linkable gelatin-CMC hydrogels designed for rapid engineering of perfusable vasculatures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2, (6), 1059-1066 (2016).
Kern/shell druk steigers voor weefsel engineering van buisvormige constructies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Milojević, M., Vihar, B., Banović, L., Miško, M., Gradišnik, L., Zidarič, T., Maver, U. Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures. J. Vis. Exp. (151), e59951, doi:10.3791/59951 (2019).More

Milojević, M., Vihar, B., Banović, L., Miško, M., Gradišnik, L., Zidarič, T., Maver, U. Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures. J. Vis. Exp. (151), e59951, doi:10.3791/59951 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter