توضح هذه المقالة بروتوكولًا لتوليد خلايا CD8 T الخاصة بالمستضد، وتوسيعها في المختبر، بهدف إنتاج أعداد كبيرة من الخلايا T الوظيفية لاستخدامها في المختبر وفي الجسم الحي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
توليد عالي الكفاءة من الخلايا T السامة للماوس الأولية الخاصة بالمستضد للاختبار الوظيفي في نموذج مرض السكري المناعي الذاتي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتميز مرض السكري من النوع 1 (T1D) بالحصانة الذاتية الخاصة بالأنواع مما يؤدي إلى تدمير خلايا بيتا والفقدان المطلق لإنتاج الأنسولين. في نموذج الماوس غير السمنة التلقائي ة مرض السكري (NOD)، الأنسولين هو الهدف الرئيسي، والتلاعب الوراثي لهذه الحيوانات لإزالة epitope الأنسولين مفتاح واحد يمنع المرض. وهكذا، فإن القضاء الانتقائي على المستضد المهني للخلايا المقدمة (APCs) التي تحمل هذا الظهارة المسببة للأمراض هو نهج لمنع استجابات المناعة الذاتية غير المرغوب فيها الخاصة بالأنسولين، ومن المرجح أن يكون لديه إمكانات أكبر للترجمة.
يمكن لمستقبلات مستضد الشميري (CARs) إعادة توجيه الخلايا T لاستهداف المستضدات المسببة للأمراض بشكل انتقائي. هذه التقنية أساسية للمحاولات الأخيرة لاستخدام الهندسة الخلوية لعلاج الخلايا بالتبني لعلاج السرطانات المتعددة. في هذا البروتوكول، ونحن نصف الأمثل T-خلية الرجعية (RV) transduction وبروتوكول التوسع في المختبر الذي يولد أعدادا كبيرة من الخلايا وظيفية مستضد محدد CD8 CAR-T بدءا من عدد قليل من الخلايا السذاجة. وقد تم وصف بروتوكولات خلايا CAR-T متعددة في السابق، ولكن عادة مع كفاءة تحويل منخفضة نسبيا وصلاحية الخلية بعد التحويل. وعلى النقيض من ذلك، يوفر بروتوكولنا ما يصل إلى 90٪ من كفاءة التحويل، والخلايا التي تم إنشاؤها يمكن البقاء على قيد الحياة أكثر من أسبوعين في الجسم الحي وتأخير كبير بداية المرض بعد ضخ واحد. نحن نقدم وصفا مفصلا لصيانة الخلايا وبروتوكول التحويل، بحيث يمكن اتباع الخطوات الحرجة بسهولة. يمكن تنفيذ الإجراء بأكمله من عزل الخلية الأساسية إلى تعبير CAR في غضون 14 يومًا. يمكن تطبيق الطريقة العامة على أي نموذج مرض الماوس الذي يعرف الهدف. وبالمثل، فإن التطبيق المحدد (الذي يستهدف مركباً من الفئة الثانية للبببتيد المسبب للأمراض) ينطبق على أي نموذج آخر من نماذج أمراض المناعة الذاتية التي تم تحديد مركب رئيسي لها.
المقدمة
وبالنظر إلى احتمال انخفاض خطر الآثار غير المرغوب فيها خارج الهدف، فإن العلاجات المناعية الخاصة بالمستضد (ASI) هي علاجات واعدة لأمراض المناعة الذاتية مثل T1D. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن الاستجابات المناعية للأنسولين (بريبرو) قد تكون ذات أهمية خاصة في T1D1. في العقد الماضي، والدراسات من مجموعات متعددة، بما في ذلك منطقتنا، تشير بقوة إلى أن تقديم epitope التي تحتوي على الأنسولين B سلسلة الأحماض الأمينية 9 إلى 23 من قبل جزيئات محددة MHC الفئة الثانية (B:9-23/MHCII)، يلعب دورا هاما في تطوير T1D في الفئران والبشر2،3،4،5. ل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحفاظ على الفئران في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في مرفق الماوس المعدلة وراثيا، وأجريت جميع التجارب الحيوانية وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها كلية بايلور للرعاية الحيوانية والاستفادة منها لجنة.
ملاحظة: تتطلب التجربة إعداد الفيروس والخلايا T في نفس الوقت. ويلخص الجدول 1 البروتوكول. يتم سرد الكواشف الرئيسية والمخازن المؤقتة في جدول المواد. ونحن نركز على توليد وتوسيع خلايا CAR-T التي تستهدف مجموعات محددة من الناقلات المضادة للأفراد في هذا البروتوكول.
1. توليد والتحقق من صحة واحدة سلسلة فاب الأجسام المضادة (scFab) -CARs.
ملاحظة:
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عادةً ما تكون كفاءة التحويل باستخدام هذا البروتوكول ~ 60-90%. في التجربة المبينة في الشكل 3، قبل الفرز تقريبا ، 70 ٪ من خلايا CD8 T شارك في التعبير GFP. كما شاركا في التعبير عن CD28 وCD3 (الشكل3C). الأهم من ذلك، كل من "اختبار" GFP+ الخلايا أيضا ملطخة بالمشاركة مع IAG7-B: R3 رباعيات، ولكن ليس مع رباعي التحكم (الشكل4). وبالمثل، فإن اختبار فرز والسيطرة على خلايا CAR-T كل تفرز مستوي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لإنتاج خلايا CD8 CAR-T الخاصة بالمستضد عن طريق الانكلب الفيروسي. كفاءة نقل بروتوكولنا عادة عالية، ويلاحظ عموما التعبير القوي عن جمهورية أفريقيا الوسطى. تحتفظ خلايا CAR T الموسعة بالميزات الأساسية للخلايا T التي يتم تنشيطها من قبل الوالدين، وخصوصية الأجسام المضادة، وهي مناسبة لكل من المختبر وفي استخدام الجسم الحي. لقد طبقنا Ab-CAR CD8 T الخلايا في إعادة برمجة مرض السكري من النوع 1 في الفئران NOD7.
يتضمن بروتوكولنا العديد من التعديلات الهامة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
MAb287 ومشتقاتها محمية بموجب براءة اختراع أمريكية صدرت في عام 2014.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل JDRF المنح 1-INO-2015-74-S-B، 2-SRA-2016-238-S-B، و SRA-2-S-2018-648-S-B، جائزة التعليم والعمل في مجال مرض السكري، وصندوق كارولين ويس القانوني للبحوث في الطب الجزيئي في كلية بايلور للطب. تم دعم فرز الخلايا من قبل علم الخلايا وخلية فرز الأساسية في كلية بايلور للطب بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (S10RR024574 و P30CA125123). تم الحصول على جميع رباعيات الببتيد MHC من مرفق نواه رباعي النواة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 & mu ؛ م |
| 5 ' RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| الأجسام المضادة CD28 المضادة للفأر | eBioscience | 14-0281-86 | التركيز النهائي عند 1 & micro ؛ جم / مل |
| الأجسام المضادة CD3e المضادة للفأر | eBioscience | 145-2C11 | التركيز النهائي عند 1 & micro ؛ جم / مل |
| البيوتين الفئران المضادة للفأر IFN-& غاما; | BD Biosciences | 554410 | تركيز العمل عند 0.5 & micro ؛ جم / مل |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| مجموعة Maxi-Prep خالية من Endo | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 & micro ؛ جم / مل. |
| معطلة الحرارة FCS | Hyclone | SH30087.03 | نهائي 10٪ FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | مرفق رباعي المعاهد الوطنية للصحة في إيموري | لكل موافقة | تركيز العمل عند 6 & ميكرو ؛ جم / مل |
| IAg7-الأنسولين P8E رباعي المعاهد الوطنية | للصحة مرفق رباعي في إيموري | لكل موافقة | تركيز العمل عند 6 وميكرو ؛ جم / مل |
| الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم - الإيثانولامين (ITS 100x) التركيز | النهائي 51500056 | ThermoFisher هو 1x | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a + T T Cell Isolation | KitMiletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a + T T Cell Insulation | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM متوسط | ThermoFisher | 31985070 | |
| البنسلين الستربتومايسين (5000U / مل) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U / ml |
| خلايا Phoenix-ECO | ATCC | CRL-3214 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| منقى الفئران المضادة للفأر IFN- & جاما ؛ | BD Biosciences | 551216 | تركيز العمل عند 3 & micro; جم / مل |
| عازلة تحلل الخلايا الحمراء | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | تركيز العمل عند 50 & micro ؛ جم / مل في PBS |
| rhIL-2 (تركيز المخزون 105< / sup> IU / ul) | Peprotech | 200-02 | التركيز النهائي عند 200 وحدة دولية / مل |
| rmIL-7 (تركيز المخزون 50ng / ul) | R & D | 407-ML-005 | التركيز النهائي عند 0.5 نانوغرام / مل |
| RPMI-1640 | جيبكو | 11875-093 | |
| مصافي الخلايا المعقمة | فيشر سيانتيفك | 22-363-548 | |
| تريبل | جيبكو | 12605-028 |
المراجع
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
- Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).
- Nakaya....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
