Hier presenteren we een op mechanica gebaseerd protocol om de gap junction connexin 43 te verstoren en de daaropvolgende impact te meten die dit heeft op endotheliale biomechanica via observatie van tracties en intercellulaire spanningen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Perturbing endotheliale biomechanica via Connexin 43 structurele verstoring
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Endotheelcellen zijn opgericht voor het genereren van intercellulaire spanningen en tractie's, maar de rol gap knooppunten spelen in endotheliale intercellulaire stress en tractie generatie is momenteel onbekend. Daarom presenteren we hier een op mechanica gebaseerd protocol om de invloed van Gap Junction connexin 43 (Cx43) op endotheliale biomechanica te hebben door de confluente endotheliale monolagen bloot te stellen aan een bekende Cx43 remmer 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) en meten van de impact van deze remmer op tractie en intercellulaire spanningen. We presenteren representatieve resultaten, die een afname vertonen in zowel tractie en intercellulaire spanningen onder een hoge Chalcon dosering (2 μg/ml) in vergelijking met controle. Dit protocol kan worden toegepast op niet alleen Cx43, maar ook op andere tussen punten, mits de juiste remmer wordt gebruikt. Wij geloven dat dit protocol nuttig zal zijn op het gebied van cardiovasculaire en mechanobiologie onderzoek.
Inleiding
Het veld dat verwijst naar de studie van de effecten van fysieke krachten en van mechanische eigenschappen op cellulaire en weefsel fysiologie en pathologie staat bekend als Mechanobiology1. Een paar nuttige technieken die zijn gebruikt in de mechanobiologie zijn monolaag stress microscopie en tractiekracht microscopie. Tractiekracht microscopie maakt het mogelijk voor de berekening van tracties gegenereerd op de celsubstraat interface, terwijl monolaag stress microscopie maakt het mogelijk voor de berekening van intercellulaire spanningen gegenereerd tussen aangrenzende cellen binnen een monolaag2 ,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Polyacrylamide (PA) gels maken
-
Voorbereiding van Petri schaaltje
- Bereid BIND silaan oplossing door het mengen van 200 mL ultrapuur water met 80 μL azijnzuur en 50 μL 3-(trimethoxysilyl) Propylmethacrylaat. BIND silaan is een oplossing die wordt gebruikt voor het functionaliseren van het glasbodem Petri schaaloppervlak voor hydrogel bevestiging.
- Roer de BIND silaan-oplossing op een roer plaat gedurende ten minste 1 uur.
- Behandel het centrum goed van de Petri schaal met BIND silaan oplossing voor 45 min.
- Verwijder BIND silaan oplossing en spoel de Petri schaal af met ultra zuiver water 2x-3x. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Fase contrast beelden van controle, 0,2 μg/ml, en 2 μg/ml Chalcon behandelde monolagen werden 30 minuten voor Chalcon behandeling (Figuur 1A-C) en 2 uur na Chalcon behandeling (figuur1D-F) genomen. Cel-geïnduceerde kraal verplaatsingen (μm) werden waargenomen te verminderen in zowel de lage dosis Chalcon en hoge dosis Chalcon voorwaarden (Figuur 2E, F
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Onze groep, evenals anderen, heeft met succes tfm en MSM gebruikt om de invloed van celcelknooppunten in verschillende pathologische en fysiologische cellulaire processen in vitro7,15,18,27 te sonde . Bijvoorbeeld, Hardin et al. presenteerde een zeer inzichtelijke studie die suggereert intercellulaire stress transmissie begeleidt paracellulaire gap vorming in endotheliale cellen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de University of Central Florida start-up funds en het National Heart, Lung en Blood Institute van het National Institute of Health under Award K25HL132098.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Onmisbaar om polyacrylamide gels plat te maken |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component van polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | Om de Cx43 structuur te verstoren |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stockoplossing om bind-silaanmengsel met azijnzuur en ultra-zuiver water te maken |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component van polyacrylamide gel |
| Azijnzuur | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Onmisbaar om bind-zoutoplossing te maken |
| Alexa Fluro 488 geiten-anti-muis IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secundaire antistof |
| Ammoniumpersulfaat | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerisatiemiddel |
| Rundserumalbumine (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | Om blokkeeroplossing te maken |
| Rund Type I Atelo-Collageen Oplossing, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Gebruiken als extracellulaire matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Bufferoplossing nodig voor celcultuur |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | Om chalcone op te lossen en stockoplossing te maken |
| Fluoromount-G met DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Montagemedium voor immunokleuring gebruikt om te kleuren voor DAPI |
| Fluorescente microsfeer Carboxylaat-gemodificeerde korrels | ThermoFisher | F8812 | 0,5 micrometer carboxylaat-gemodificeerde korrels (rood), 2% vaste stoffen |
| HEPES bufferoplossing 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Onmisbaar om |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Onmisbare HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Onmisbaar medium voor HUVEC celcultuur |
| Muis monoklonaal Cx43 antilichaam (CX - 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primaire antistof voor Cx43 |
| Petrischaal (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petrischaal met een 20 mm middenputje |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Onmisbaar om polyacrylamide geloppervlak te functionaliseren |
| SYLGARD 184 Siliconen Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Siliconen elastomeer met uithardingsmiddel om PDMS te maken |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerisatiemiddel |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | Om cellen te permeabiliseren |
| Trypsine -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Gebruikt om cellen los te maken |
Referenties
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrate....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
