Vi presentiamo un piccolo protocollo di riparazione della libreria di RNA dettagliato con meno distorsione rispetto ai metodi standard e una maggiore sensibilità per 2'-O-metilRNA. Questo protocollo può essere seguito utilizzando reagenti fatti in casa per risparmiare sui costi o utilizzando kit per comodità.
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Articolo metodologico
Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo studio dei piccoli RNA (sRNA) da parte del sequenziamento di nuova generazione (NGS) è messo in discussione da problemi di pregiudizio durante la preparazione della libreria. Diversi tipi di sRNA come i microRNA vegetali (miRNA) portano una modifica di 2'-O-metile (2'-OMe) al loro nucleotide terminale 3'. Questa modifica aggiunge un'altra difficoltà in quanto inibisce la legatura dell'adattatore da 3'. In precedenza abbiamo dimostrato che le versioni modificate del protocollo "TruSeq (TS)" hanno meno pregiudizi e un miglioramento del rilevamento di 2'OMe RNA. Qui descriviamo in dettaglio il protocollo 'TS5', che ha mostrato le migliori prestazioni complessive. TS5 può essere seguito utilizzando reagenti fatti in casa o reagenti dal kit TS, con le stesse prestazioni.
Introduzione
I piccoli RNA (sRNA) sono coinvolti nel controllo di una diversità di processi biologici1. Gli sRNA normativi eucarioti sono in genere di dimensioni comprese tra 20 e 30 nt; i tre tipi principali sono i microRNA (miRNA), gli RNA che interagiscono con il piwi (piRNA) e i piccoli RNA interferenti (siRNA). I livelli di espressione dell'aberrro miRNA sono stati implicati in una varietà di malattie2. Ciò sottolinea l'importanza dei miRNA nella salute e nelle malattie e la necessità di strumenti di ricerca accurati e quantitativi per rilevare gli sRNA in generale.
Il sequenziamento di nuova generazi....
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Protocollo
1. Isolamento di piccoli RNA
- Estrarre l'RNA totale usando reagenti a base di fenolo o qualsiasi altro metodo. Verificare se l'RNA è di buona qualità.
- Pre-eseguire un 15% gel TBE-urea (vedi Tabella dei Materiali)per 15 min a 200 V.
- Mentre il gel è in esecuzione, mescolare 5-20 g di RNA totale in un volume di 5-15 l con un volume uguale di colorante da carico formamide (vedi Tabella dei materiali; 95% deionizzato formamide, 0.025% bromophenol blu, 0.025% xylene cyanol, 5 mM EDTA pH 8) in un 200L. Allo stesso modo, mescolare 10 l (200 ng) di scala di RNA piccolo (vedi Tabella dei materiali) ....
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Risultati
I passaggi critici sono l'isolamento della piccola frazione di RNA del materiale RNA totale iniziale (Figura 3) e del prodotto biblioteca finale desiderato (Figura 4). Entrambi i passaggi comportano la purificazione del gel di poliacrilammide; piccolo RNA è isolato dal 15% di gel di urea TBE, mentre le librerie finali sono isolate dai gel TBE nativi del 6%. Piccolo RNA isolato dal gel può essere analizzato su un piccolo chip di elettroforesi capillare di RNA (
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Discussione
La preparazione della piccola libreria di RNA rimane impegnativa a causa della distorsione, introdotta principalmente durante le fasi di legatura dell'adattatore. Gli RNA con una modifica di 2'OMe alla loro estremità 3' come miRNA vegetali, piRNA in insetti, nematodi e mammiferi e piccoli RNA interferenti (siRNA) negli insetti e nelle piante sono particolarmente difficili da studiare perché la modifica di 2'-OMe inibisce la legatura dell'adattatore 3'. Un certo numero di soluzioni sono state proposte in letteratura per m.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Center for Scientific Research (CNRS), dal Francese Alternative Energies and Atomic Energy Commission (CEA) e dall'Università Parigi-Sud. Tutta la preparazione della biblioteca, il sequenziamento dell'illuminazione e le analisi bioinformatiche per questo studio sono stati eseguiti presso l'impianto I2BC Next-Generation Sequencing (NGS). I membri della struttura NGS I2BC sono riconosciuti per la lettura critica del manoscritto e suggerimenti utili.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Strumento bioanalizzatore 2100 | Agilent | G2939BA | |
| acido-fenolo:Cloroformio, pH 4,5 (con IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosina 5'-Trifosfato (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalizzatore Kit DNA ad alta sensibilità | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalizzatore Kit per piccoli RNA | Agilent | 5067-1548 | |
| Filtri per provette per centrifuga Corning Costar Spin-X | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminatore | vari suppier | ||
| , con dNTP | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | gel |
| Novex TBE opzionali 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Gel di urea Novex TBE 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Kit di rimozione nucleotidica | Qiagen | 28304 | |
| Kit di base per la quantificazione del Qubit 4 | ThermoFisher | Q33227 | |
| test del DNA Qubit ThermoFisher | Q10212 | ||
| Colorante di caricamento su gel di RNA (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| Colorante di caricamento su gel di RNA (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| Inibitore della RNasi, murino | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Trascrittasi inversa | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher S11494 | ||
| T4 RNA Ligasi 1 (ssRNA ligasi) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligasi 2, troncato | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Kit di preparazione per librerie di RNA piccole | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | glicogeno |
| ultrapuro | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR scala a RNA piccolo | Zymo Research | R1090 | |
| gli ultimi due numeri corrispondono all'insieme degli indici |
Riferimenti
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8
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Ristampe e permessi
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