مضخات efflux Xenobiotic نشطة للغاية في الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف (HSPCs) وتسبب قذف TMRM، صبغة الفلورسنت غشاء الميتوكوندريا المحتملة. هنا، نقدم بروتوكول لقياس بدقة إمكانات غشاء الميتوكوندريا في HSPCs من قبل TMRM في وجود فيراباميل، مثبط مضخة efflux.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحسين دقة التقييم السيتومتري للتدفق لإمكانات الغشاء الميتوكوندريا في الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف من خلال تثبيط مضخات Efflux
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كما التمثيل الغذائي الخلوي هو منظم رئيسي للخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) التجديد الذاتي، وقد درست الأدوار المختلفة التي لعبتها الميتوكوندريا في التوازن المكونة للدم على نطاق واسع من قبل الباحثين HSC. وتنعكس مستويات نشاط الميتوكوندريا في إمكانات الغشاء (ΔM)، والتي يمكن قياسها بالأصباغ الموجبة المفترضة بالخلايا مثل TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). قدرة مضخات efflux لقذف هذه الأصباغ من الخلايا يمكن أن تحد من فائدتها، ومع ذلك. ويتسم تحيز القياس الناتج عن ذلك بأهمية بالغة عند تقييم مركبات HSCs، حيث أن الناقلين الزنيوبيين يظهرون مستويات أعلى من التعبير والنشاط في هذه المراكز مقارنة بالخلايا المتمايزة. هنا، ونحن نصف بروتوكول باستخدام فيراباميل، مثبط مضخة efflux، لقياس بدقة ΔM عبر مجموعات نخاع العظام متعددة. وتبين أن تثبيط نشاط المضخة الناتج عن ذلك يزيد من كثافة TMRM في الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (HSPCs)، مع تركها دون تغيير نسبي في الكسور الناضجة. وهذا يسلط الضوء على الاهتمام الوثيق بنشاط صبغ efflux المطلوب عند استخدام الأصباغ المعتمدة على ΔM، وكما هو مكتوب وتصور، يمكن استخدام هذا البروتوكول لمقارنة بدقة إما مجموعات مختلفة داخل نخاع العظام، أو نفس السكان عبر نماذج تجريبية مختلفة.
المقدمة
الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) هي تجديد ذاتي، متعددة القوة، وقادرة على أن تؤدي إلى جميع خلايا الدم1،2. التمثيل الغذائي الخلوي هو منظم رئيسي لصيانة HSC، جنبا إلىجنب مع العوامل النسخية، والإشارات الجوهرية والبيئة الدقيقة 3،4،5. وبالتالي فإن السيطرة السليمة على وظيفة الميتوكوندريا والجودة أمر بالغ الأهمية لصيانة HSC6،7.
إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ΔM) هي معلمة رئيسية في تقييم الميتوكوندريا لأنها تعكس مباشرة وظائفها، والتي تستمد من....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من كلية ألبرت أينشتاين للطب.
1. إعداد الحلول
- تلطيخ العازلة (الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) + 2٪ مصل البقر الجنيني (FBS)): إضافة 10 مل من FBS في 500 مل من محلول PBS معقمة.
ملاحظة: يمكن تخزين هذا الحل عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل في حالة معقمة. قبل البدء في الإجراءات التالية، وضع aliquot من هذا الحل (50 مل) على الجليد. - ACK (الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم) اللعنالعازلة: وضع aliquot من ACK lysing العازلة (1 مل) على الجليد قبل بدء الإجراء.
ملاحظة: لإعداد نفس العازلة غير التجارية، ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتيح البروتوكول الموضح أعلاه العزل السهل للمركبات المتعددة الجنسيات من طراز M-MNCs من طراز الماوس. يلخص الشكل 1 الخطوات الرئيسية للبروتوكول: عزل العظام، وطرد نخاع العظام، وملطات خلايا الدم الحمراء، وتلطيخ الأجسام المضادة متبوعاً بتلطيخ TMRM لقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا في مجموعة محددة من الدم .
تحتوي الشركات المتعددة الجنسيات BM على العديد من مجموعات الخلايا، بما في ذلك مركبات HSCs. الكوكتيلات المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول راسخة في تنقية HSCs (CD34-.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قياس غشاء الميتوكوندريا المحتملة هو حجر الزاوية في تحليل وتقييم الميتوكوندريا، والتي هي حاسمة للحالة الأيضية للخلية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتحليل ΔM من قبل TMRM تلطيخ. TMRM هو صبغة فلورية خلية permeant التي تتراكم في الميتوكوندريا النشطة بسبب ΔM، ومستويات كل منها لا تزال في التوازن بين المقصورات خارج الخلية، السيتوبلازمية والميتوكوندريا10. ويمكن تكييف هذا البروتوكول مع الأصباغ المختلفة، بما في ذلك رباعي ميثيل رودادومين، إستر الإيثيلي (TMRE) وJC-1. ظروف تلطيخ مناسبة حاسمة لتحقيق نتائج دقيقة. وتشمل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
ويشكر المؤلفون جميع أعضاء مختبر آيتو، ولا سيما K Ito وH Sato، ومعهد أينشتاين للخلايا الجذعية على التعليقات ومرافق قياس التدفق الخلوي والتصوير التحليلي (الممولة من المعهد الوطني للسرطان منحة P30 CA013330) ل المساعدة في إجراء التجارب. ويدعم K.I. من قبل المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01DK98263, R01DK115577, و R01DK100689) ووزارة الصحة في ولاية نيويورك كمدير أساسي لعلم الجينوم أحادي الخلية /Epigenomics (C029154). K.I. Ito هو باحث في جمعية سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ACK للتحلل عازلة | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD العلوم البيولوجية | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP / Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC / Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| محلول DAPI (1 مجم / مل) Life | Technologies | 62248 | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7R & alpha - البيوتين | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE / Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF الفئران | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM تقنيات | الخلايا الجذعية | المتوسطة 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| فيراباميل هيدروكلوريد | ميليبور سيجما | V4629-1G |
المراجع
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
