Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

עצם השתלת מח פלטפורמת לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים במחלה שתל-מול מארח

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60083
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

שתל-מול-מארח מחלה הוא סיבוך גדול לאחר השתלת מח עצם allogeneic. תאים דנדריטים לשחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של השתל-מול-מארח המחלה. המאמר הנוכחי מתאר פלטפורמת השתלת מח עצם רומן כדי לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים בפיתוח של מחלת השתל מול מארח את השתל-נגד לוקמיה אפקט.

Abstract

השתלת מח עצם אלוגנאית (BMT) הוא טיפול יעיל עבור ממאירות המטולוגית בשל השפעת השתל נגד לוקמיה (GVL) האפקט לבער גידולים. עם זאת, היישום שלו מוגבל על ידי פיתוח של השתל-מול-מארחים מחלה (GVHD), סיבוך גדול של BMT. GVHD היא עוררה כאשר T-תאים ב שתלי התורם העצמית המתבטאת באמצעות התאים הנמען ולטעון התקפות אימונולוגיים לא רצויים נגד רקמות בריאות הנמען. לפיכך, טיפולים מסורתיים נועדו לדכא את כל פעילות ה-T-cell של התורם. עם זאת, גישות אלה פוגעות באופן משמעותי באפקט GVL כך שהישרדותו של הנמען אינה משופרת. הבנת ההשפעות של גישות טיפוליות על BMT, GVL, ו-GVL, כך חיוני. בגלל האנטיגן-הצגת ו cy, הפרשה יכולות לעורר את התורמים T-תאים, תאים דנדריטים הנמען (DCs) לשחק תפקיד משמעותי אינדוקציה של GVHD. משום כך, מיקוד בקרי תחום של נמענים הופך לגישה פוטנציאלית לשליטה ב-GVHD. עבודה זו מספקת תיאור של פלטפורמת BMT הרומן לחקור כיצד DCs מארחים להסדיר את התגובות גבול ו GVL לאחר ההשתלה. הציג גם מודל BMT יעיל ללמוד את הביולוגיה של GVHD ו GVHD לאחר ההשתלה.

Introduction

שיטת השתלת תא גזע המטמית (bmt) היא טיפול יעיל לטיפול בממאירות המטולוגית1,2 דרך השתל-נגד לוקמיה (gvl) אפקט3. עם זאת, לימפוציטים התורם תמיד לטעון התקפות אימונולוגיים לא רצויים נגד רקמות הנמען, תהליך הנקרא השתל-מול-מארחים מחלה (GVHD)4.

מודלים murine של GVHD הם כלי יעיל כדי ללמוד את הביולוגיה של GVHD ואת תגובת GVHD5. עכברים הם מודל חסכוני בחיות מחקר. הם קטנים וביעילות עם מולקולות ומוצרים ביולוגיים בשלבים מוקדמים של פיתוח6. עכברים הם חיות מחקר אידיאלי למחקרים גנטיים מניפולציה כי הם מוגדרים היטב גנטית, אשר אידיאלי עבור לימוד מסלולים ביולוגיים ומנגנונים6. מספר העכבר הגדול ביותר מורכב היסטולתאימות (mhc) mhc-מודלים לא תואמים של gvhd הוקמה היטב, כגון C57BL/6 (h2ב) כדי balb/c (h2d) ו fvb (h2q) → C57BL/6 (h2ב)5,7. אלה הם דגמים יקרי ערך במיוחד כדי לקבוע את התפקיד של סוגי תאים בודדים, גנים, וגורמים המשפיעים על GVHD. השתלת מ C57/BL/6 (H2ב) תורמים הורים לנמענים עם מוטציות ב mhc I (B6. c-H2bm1) ו/או Mhc II (B6. c-H2bm12) חשף כי אי התאמה הן בכיתה mhc i ו-class ii היא דרישה חשובה להתפתחות של gvhd חריפה. זה מרמז כי הן CD4+ ו CD8+ T-תאים נדרשים להתפתחות המחלה7,8. Gvhd הוא גם מעורב במפל דלקתי המכונה "הפרו-דלקת ציטוקינים" סערה9. שיטת המיזוג הנפוצה ביותר במודלים murine היא הקרנה מוחלטת של הגוף (TBI) על ידי X-ray או 137Cs. הדבר מוביל לאבלציה של המטופל, ובכך מאפשר לתאי גזע של תורם להתחשבן ולמנוע דחייה של השתל. פעולה זו מתבצעת על-ידי הגבלת ההתפשטות של תאי T של הנמען בתגובה לתאי תורם. בנוסף, הפערים הגנטיים ממלאים תפקיד חשוב באינדוקציה למחלות, שתלויה גם באי-התאמה משנית של MHC10. לכן, מינון myeloablative הקרנה משתנה בזנים שונים של העכבר (g., BALB/c → C57BL/6).

הפעלת תאים T-בתאי התורם על ידי מארח אנטיגן הצגת תאים (APCs) חיוני עבור פיתוח GVHD. בין ה-APCs, התאים הדנדריטים (DCs) הם החזקים ביותר. הם בעלי יכולת לספק GVHD בשל ספיגת אנטיגן מעולה שלהם, ביטוי של T-cell שיתוף מולקולות, והפקה של ציטוקינים pro-דלקתיים המיקטט T-תאים לתוך מערכות המשנה הפתוגניים. בקרי תחום של נמענים הם קריטיים להקלה על הטרמה של תא T והשראה לאחר השתלת11,12. בהתאם לכך, DCs הפכו למטרות מעניינות בטיפול ב-GVHD12.

נדרש TBI כדי להגביר את התיאום של תא התורם. עקב האפקט TBI, Dc DCs מופעלים ולשרוד זמן קצר לאחר ההשתלה12. למרות הפיתוחים העיקריים בשימוש בביולומינציה או בזריחה, הקמת מודל אפקטיבי לחקר התפקיד של בקרי התחום של הנמענים ב-GVHD עדיין מאתגרת.

מכיוון T-cell התורם הם כוח המניע של פעילות GVL, אסטרטגיות טיפול באמצעות תרופות מדכאים חיסוני כגון סטרואידים כדי לדכא את הפעילות alloreactivity לעתים קרובות לגרום להישנות הגידול או זיהום13. לכן, בקרי תחום של נמענים עלולים לספק גישה חלופית לטיפול ב-GVHD תוך שמירה על האפקט של GVHD והימנעות מהידבקות.

בקצרה, המחקר הנוכחי מספק פלטפורמה כדי להבין כיצד סוגים שונים של איתות בקרי Dc של נמענים מסדיר פיתוח GVHD והאפקט GVHD לאחר BMT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש באוניברסיטת מרכז פלורידה.

1. האינדוקציה GVHD

הערה: מח עצם Allogeneic (BM) השתלת תא (שלב 1.2) מבוצעת בתוך 24 שעות לאחר ההקרנה. כל ההליכים המתוארים להלן מתבצעים בסביבה סטרילית. לבצע את ההליך במכסה התרבות רקמה להשתמש ריאגנטים מסוננים.

  1. יום 0: הכן את עכברי הנמען.
    1. השתמש בסוג פראי נקבה (WT) עכברים על רקע BALB/c (CD 45.2+ H2kd +), 10 לפחות 12 שבועות הישנים כנמענים.
    2. תייג את האוזן ושקול את הנמענים לפני TBI. ואז, למקם עד 11 עכברים בחדר ההקרנה ולשמור אותו בתוך הסקה. הקרינים במנה אחת של 700 cGy במשך 10 עד 15 דקות.
    3. החזר בעלי חיים שעברו הקרינה לכלובים והבית אותם במתקנים ללא פתוגן לפני ההשתלה.
      הערה: משקל הגוף המינימלי של הנמענים צריך להיות בסביבות 20 גר'. השתמש במשקל זה כאסמכתא לחישוב אובדן משקל הגוף במהלך התקופה הניסיונית.
  2. יום 1: הכנת מח עצם מרוקן T (TCD-BM) מעכברי התורם.
    1. המתת חסד CD 45.1/Ly 5.1 C57BL/6 עכברים על ידי CO2 חנק ולחכות 2 עד 3 דקות עד שהם מחוסר הכרה. לבצע פריקה צוואר הרחם כמו המתת חסד משנית אם יש צורך.
    2. לשים כל עכבר על לוח עבודה נקייה. בעזרת הפרווה והעור עם 70% איזופנול.
    3. לאסוף את השוקה ואת הירך משתי הרגליים באמצעות מלקחיים ומספריים. שים אותם בקרח קר RPMI המכיל 1% FCS ו 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין ו 2 מ"מ L-גלוטמין (1% RPMI) ב 50 מ"ל צינורות חרוט. נקה את עצם הירך ואת עצמות השוקה ביסודיות על ידי הסרת כל רקמות השריר באמצעות מלקחיים ומספריים. העבר את עצם הירך ואת שוקה מן 50 mL מצינורות חרוט לצלחת פטרי 92 מ"מ המכיל 1% RPMI.
    4. באמצעות מספריים, חותכים את קצות עצם הירך או השוקה. מילוי שפופרת 50 mL עם 25 מ ל של 1% RPMI 1640 בינונית. השתמש באפשרות זו כדי למלא 3 מזרק mL מוצמד מחט G 26 עם 3 מ ל של 1% RPMI. הכנס מזרק זה לתוך העצם ולדחוף את הבוכנה כדי לשטוף את מח העצם (BM) מתוך חלל לתוך צינור האוסף עם 1% RPMI (~ 3 mL/עצם).
    5. חזור על השלב 1.2.4 עבור כל עצמות שוקה ועצם הירך שנותרו מעכברים תורמים אחרים. לשמור את כל צינורות האוסף על הקרח.
    6. הפוך את התא הבולם היחיד על ידי שטיפה של פיסות מח העצם באמצעות מסננת תא 75 יקרומטר. לאסוף את ההשעיה התא בודד בצינור 50 mL.
    7. צינורות צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מנושף ומוותר על הסופרנטאנט השהה מחדש את הגלולה ב-PBS מאגר המכיל 0.5% בסרום בקון (BSA) ב 20 x 106 תאים/mL. שמור הנורית של 2 x 106 תאים עבור כתמים טוהר.
    8. הוסף את 1 הנוגדן שלך ב 0.05 μg/106 תאים14 ו-דגירה עבור 30 דקות ב 4 ° c. התרחץ פעם אחת עם 25 מ ל בקרח קר. השעיה מחדש ב 20 x 106/ml ב 0.5% bsa/10% ארנב צעיר משלים/2% DNase (10,000 U/mL ב-H סטרילי2O). מודטה עבור 45 דקות ב 37 ° צ' ולשטוף 2x כמו לפני.
      הערה: תאי T מרוקנים באמצעות mAb ספציפי עבור Thy1, חלבון המבוטא על ידי כל T-תאים, אבל לא אחרים לוקיציטים.
    9. השהה מחדש את התאים ב-20 מ ל של מאגר PBS המכיל 0.5% BSA. לספור את התאים מח העצם ב 1% חומצה אצטית באמצעות הומוציטוטומטר. שמור סדרת מחלקים של 2 x 106 תאים עבור בדיקת טוהר ידי הזרמת cy, לאחר טיהור תאים.
      הערה: עכבר תורם אחד בדרך כלל מייצר כ 25 x 106 TCD-BM.
    10. השתמש cy, לנסות לאשר מחסור מוצלח תא T. כתם 1 x 106 תאים, נשמר משלבים 1.2.7 (לפני המחסור t-cell) ו 1.2.9 (tcd-BM לאחר דלדול t-cell) עם נוגדנים הבאים: α-CD3 (17A2), α-CD4 (gk 1.5), ו α-CD8α (53-6.7).
  3. יום 1: הכנת תאי T מעכברי התורם
    1. השתמש ב45.2 CD+ H2kb + C57BL/6 מסוג פראי (WT) כתורמים לתאי T.
    2. המתת חסד C57BL/6 עכברים על ידי פחמן דו חמצני (CO2) חנק כפי שמתואר בשנת 1.2.1.
    3. לנקות את הפרווה ואת העור של העכבר ביסודיות עם 70% אתנול. כבלו טחולים ובלוטות הלימפה ולהפריד אותם לתוך תא אחד הבולם של הטחול באמצעות מזרק במזרק ו 40 יקרומטר רשת שינוי. לשטוף את מסננת ואת המזרק עם 1% RPMI (1% FBS המכיל מדיה RPMI) כדי לאסוף את כל הטחול.
    4. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. הוסף 5 מ ל של מאגר ACK ליסינג (1 מ"מ Na2edta, 10 מ"מ khco3, 144 mm NH4Cl, pH 7.2) לאחר מחיקת supernatant. מודקון תא ההשעיה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: מאגר הליזה ACK משמש ללישר כדוריות דם אדומות.
    5. הוסף 5 מ ל של 1% RPMI להפסיק את הליזה. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
    6. הכן קרח קר מגנטי המופעל מיון תא (מקינטוש) מאגר (0.5% BSA, 2 מ"מ EDTA ב PBS, pH 7.2). דגה את המאגר לפני השימוש. השהה מחדש את כדורי התא ב-5 מ ל של מאגר מקינטוש.
    7. לספור את הטחול ולבדוק את התאים החיים והמתים באמצעות הומוציטומטר ו 1% טריקון כחול. שמור סדרת מחלקים של 2 x 106 תאים כדי להעריך את תפוקת הטיהור עם הזרימה cy, לנסות לנתח.
    8. השהה מחדש את הטחול בריכוז של 200 x 106/mL במאגר מקינטוש. הוסף 0.03 μl של ביוטין נגד עכבר-Ter-119, 0.03 μl של ביוטין נגד עכבר-CD11b, 0.03 μl של ביוטין נגד העכבר-CD45R, ו-0.03 μl של ביוטין נגד עכבר-DX5לכל 10 תאים . דגירה של 15 דקות ב-4 ° c.
      הערה: ביוטין נגד עכבר-Ter-119, ביוטין נגד עכבר-CD11b, ביוטין נגד עכבר-CD45R, ו ביוטין נגד עכבר-DX5 שימשו כדי להגיב עם אריתרופואיד, גרנולוציטים, B-תאים, ו-NK תאים בהתאמה. לפיכך, ערכות המשנה של תאים אלה מרוקנים את השלב הבא בצעד15.
    9. הוסף 10 מ ל של מאגר מקינטוש קר-קרח להשעיה של התא. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
    10. השהה מחדש את כדורי התא במאגר מקינטוש בריכוז של 100 x 106/Ml. הוספת מיקרוחרוזי אנטי-ביוטין (0.22 μL/106 תאים) עד לה, השעיית הטחול. מערבבים היטב ומשלבים תוספת של 15 דקות ב -4 ° c. לשטוף את ההשעיה התא פעם עם 10 מ ל של מאגר מקינטוש קר קרח. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ולהיפטר supernatant.
    11. שים טור מגנטי מפריד. בשדה המגנטי לשטוף את העמודה עם 3 מ ל של מאגר מקינטוש. שחרר את ההשעיה של התא על העמודה. לאסוף את הזרימה-דרך המורכבת של T מאוגדים, מועשר בתאי טי, בצינור חדש 15 mL חרוט. לשטוף את עמודת MS עם 3 מ ל של מאגר מקינטוש קר קרח.
      הערה: ודא שהעמודה ריקה לפני ביצוע שלבי הכביסה.
    12. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. השהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-5 מ ל של מאגר מקינטוש.
    13. ספור את התאים ב-1% טריקון כחול באמצעות הומוציטומטר. שמור סדרת מחלקים של 2 x 106 תאים עבור בדיקת טוהר על ידי הזרימה cy, לנסות.
      הערה: התשואה הממוצעת של תאי T-הטחול מבודדים בשיטה זו היא ~ 20/25 x 106 תאים לכל עכבר.
    14. אשר את התשואה של העשרה תא T על ידי הזרימה cy, לנסות. כתם 1 x 106 תאים, נשמר משלבים 1.3.7 (לפני המחסור t-cell) ו 1.3.13 (tcd-BM לאחר דלדול t-cell), עם נוגדנים הבאים: α-CD3 (17A2), α-CD4 (gk 1.5), ו α-CD8α (53-6.7).
  4. יום 1: הכנס עכברים שעברו הקרינה עם תאי T עם תורם ו-TCD-BM.
    1. שטוף את ה-TCD-BM ו-T-תאים 2x עם PBS (800 x g עבור 5 דקות ב -4 ° c). השהה מחדש את התאים. בערוץ הקרח הקר להזרקה כוונן את ריכוז התא ל-20 x 106/ML עבור TCD BM ו-4 x 106/mL עבור תאי T.
    2. מחממים את החיה באמצעות מנורת חימום כדי להגדיל את הניראות של הורידים הדו. במידת הצורך, הצב את העכבר בתוך הרסן.
    3. נקה את פני השטח של הזנב באמצעות 70% איזופנול. הכנס את TCD-BM (5 x 106 תאים/עכבר) עם או בלי T-תאים (0.75 x 106 תאים/עכבר). להיזהר לא להחדיר שום אוויר לתוך המזרק.
    4. להסיר את המחט ולהחיל משטח חיטוי ישירות לאתר ההזרקה 5-10 על מנת לעצור דימום.
  5. הערכת GVHD בימים 2 עד 80.
    1. . לעקוב אחר הישרדות החיות ניטור הסימנים הקליניים של GVHD מותאם ממערכת הבקיע שהוקמה בעבר על ידי קוק ואח '16 ואת משקל הגוף של עכברי הנמען 2x בשבוע. השתמש במשקל הגוף שנקבע לפני TBI כדי לחשב את אובדן משקל הגוף.
    2. שוקלים כל עכבר בנפרד. ציון ירידה במשקל כדלקמן: כיתה 0 = פחות מ 10%; כיתה 1 = 10%-20%; כיתה 2 = יותר מ 20%.
    3. ציון סימן התנוחה של הנמענים: כיתה 0 = ללא תחושת בטן; כיתה 0.5 = תחושת בטן קלה אך מיישר בעת הליכה; כיתה 1 = בעל חיים נשאר מתחת לרגל; כיתה 1.5 = בעל חיים אינו מתיישר; כיתה 2.0 = בעל חיים לעמוד על הבהונות האחוריות.
    4. ציון הסימן הניידות של הנמענים: כיתה 0 = פעיל מאוד; כיתה 0.5 = איטי יותר מאשר עכברים תמימים; כיתה 1.0 = מהלכים רק בזמן שהוא מתקע; כיתה 1.5 = מהלכים מעט כאשר הם השתקע; כיתה 2.0 = לא זז כאשר התקע.
    5. ציון העור של הנמענים: כיתה 0 = אין שריטות, נגעים או שינוי גודל; כיתה 0.5 = אדמומיות באזור ספציפי אחד; כיתה 1 = שחיקה באזור אחד או שחיקה קלה בשני אזורים; כיתה 1.5 = שריטות חמורות בשני אזורים או יותר; כיתה 2.0 = שריטות חמורות, פיצוח עור, דם יבש.
    6. ציון הפרווה של הנמענים: כיתה 0 = אין סימנים חריגים; כיתה 0.5 = מחפר בצד הבטן או העורף של הצוואר, כיתה 1.0 = מעבר או צד של הבטן והצוואר; כיתה 1.5 = פרווה מוזנחת ומרופאת; כיתה 2.0 = פרווה מלאה בבטן ובגב.
    7. ציון השלשול של הנמענים: כיתה 0 = ללא שלשול; כיתה 0.5 = שרפרף קל ועדין; כיתה 1.0 = מתון (שרפרף צהוב); כיתה 1.5 = מתונה (שרפרף צהוב עם מעט דם); כיתה 2 = חמור (צהוב בהיר שרפרף דמים, "שרפרפים העוגה מיובשים" מופיעים באזור אנאלי).

2. השתלת מודל

  1. יצירת מח עצם הנגזרים הדנדריטים תאים (BM-DCs).
    1. לבודד מח עצם מן המוח ואת tibias של WT או פקטור B (פנסיון מלא)-/- עכברים על רקע B6 כפי שמתואר בשלבים 1.2.3-1.2.4. לסובב את התאים ב 800 x g עבור 5 דקות.
    2. להשעות את הגלולה ב 5 מ ל של מאגר ליסינג ACK לפירוק תא דם אדום. מודקון תא ההשעיה עבור 5 דקות על הקרח. הוסף 10 מ ל של 1% RPMI ההשעיה התא לעצור את הליזה ואת צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
    3. השהה מחדש את כדורי התא 10 מ ל של מדיית התרבות (RPMI 1460 המכיל 10% FBS, 100 U/mL של פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ"מ l-גלוטמין, ו 50 mM β-mercaptoethanol) ולהתאים את עוצמת הקול כדי לעמוד בריכוז הסופי של 2 x 106 תאים/mL.
    4. הוסף 20 ng/mL מקרופאג המושבה-מגרה גורם ממריץ (GM-שדרתי) להשעיה התא. התרבות התאים מח העצם ב 100 x 15 מ"מ מנות פטרי ב 37 ° c ב 5% CO2 עבור 6 ימים.
    5. החלפת מחצית מדיית התרבות המתמשכת (כ-5 מ"ל) עם מדיה טרייה המכילה 40 ng/mL GM-שדרתי ביום 3.
    6. חמם את מדיית התרבות באמבט מים ב-37 ° c. לאסוף כ 5 מ ל של התקשורת מתוך מנות תרבות מח העצם. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט השהה מחדש את הגלולה בתוך 5 מדיית תרבות של mL המכילה 40 ng/mL GM-שדרתי.
    7. הוסף 25 μg/mL ליפופוליד (lps) למדיה ביום 6 של התרבות כדי להבשיל את ה-BM-DCs. שמור סדרת מחלקים של 2 x 106 תאים כדי לקבוע את היעילות DC בידול על ידי הזרימה cy, try.
    8. לאסוף מתבגר בקרי DCs: להשתמש בתאים לשפשף בעדינות בקרי בדים מתוך מנות פטרי. לאסוף את כל השעיות התא בצינורות חרוט 50 mL. צנטריפוגה ב 800 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט לשטוף את כדורי 3x תא עם 50 mL של הקרח קר PBS. שמור על 2 x 106 מוניטור-בקרי עבור ניתוח האימונוולוגית על ידי זרימה cy, לנסות.
  2. לבצע שיתוף השתלת תא דנדריטי של BMT (DC-coמשתלת BMT).
    הערה: השתמש בעכברים FVB (H2kq) כתורמים לתאי T ו-BM. הקרין B6 בלבד 5.1 עכברים הנמען במינון של 1,100 cGy (2 מנות, 3 h מרווח). ראה פרטים בשלב 1.1.
    1. בודד BM מ עצמות ו הטייה של עכברים התורמים fvb. ראה פרטים בצעדים 1.2.3-1.2.10.
      הערה: השתמש במח העצם הבודד הכולל במקום TCD-BM במודל זה.
    2. טיהור תאים מתוך הבלוטות ובלוטות הלימפה של העכברים התורמים FVB. ראה פרטים בשלבים 1.3.1-1.3.13.
    3. הכנס BM (5 x 106/עכבר), T-תאים (0.5 x 106/עכבר) עם BM-DCs (2 x 106/עכבר) ביום 0 של הקורס ניסיוני.
    4. ביום 3 לאחר ההשתלה, לבחון את החוקה החדש של DC התורם על ידי הזרמת cy, try.
      1. לאסוף דם מעיני הנמענים.
      2. שאיפת התקליטור ה45.1/Ly 5.1 באופן מידי 3% השאיפה לאינהלציה. בדקו את עומק ההרדמה. על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן
      3. מניחים צינור ניקוי זכוכית סטרילית ב canthus האמצעי של העין בבימויו של מונחה בזווית 30-45 ° מהמטוס של האף. הפעילו לחץ תוך כדי שאתם מסתובבים בעדינות בצינור.
      4. שחרר את הדם לתוך 10 μL הפארין-המכילה צינורות מיקרוצנטריפוגה סטרילית 1.5 mL. העבר 50 μL של דם לתוך 5 שפופרות זרימת זכוכית mL.
      5. הוסף 2 מ ל של מאגר ליסינג ACK. מודקון ב 37 ° c באמבט מים עבור 45 דקות. הוסף 2 מ ל של מאגר מכתים של FACS. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
      6. השהה מחדש את כדורי התא עם 200 μL של מאגר FACS המכיל את הזרימה המתאימה נוגדנים מכתים (חיים/מוות צהוב, α-H-2Kb, α-cd 45.1, α-cd 45.2, α-CD11c, ו α-MHCII). המשך 15 דקות ב -4 ° c בחשכה. שטוף 2x עם מאגר FACS 1 mL. השהה מחדש את כדורי התא ב-200 μL של מאגר FACS ובצע את הניתוח באמצעות הזרמת cy, try.

3. GVHD/GVHD מודלים של BMT

  1. ביצוע האינדוקציה GVHD/GVHD.
    1. תרבות the לוציפראז התמרה לימפומה של תא ב-A20 בתקשורת התרבות RPMI.
    2. הקרינה BALB/c רקע WT או Ly 5.1 הנמען ב 700 cGy (מנה אחת). ראה פרטים בשלב 1.1.
    3. בידוד TCD-BM מהמורס והטיטיה של B6. . עכברים תורמים באופן אנוכי ראה פרטים בשלבים 1.2.1-1.2.10.
    4. לטהר את התאים מפני טחולים ובלוטות הלימפה של העכברים תורם C57BL/6. ראה פרטים בצעדים 1.3.1-1.3.15.
    5. לשטוף את לימפומה A20 2 x עם 25 מ ל של PBS. השהה מחדש את כדורי התא ב -10 מ ל. של הערוץ הקרח הקר קח השעיה תא (10 μL) ולספור את התאים באמצעות 1% טריקון כחול ו-הומוציטומטר. כוונן את ריכוז התא ל-20,000 תאים/mL.
    6. הכנס TCD-BM (5 x 106/עכבר) עם או בלי T-תאים (0.75 x 106/עכבר) ו A20 לימפומה (5,000 תאים/עכבר).
    7. מעקב על הישרדות הנמען, שלטים קליניים GVHD, וירידה במשקל הגוף במהלך הקורס הנסיוני. ראה פרטים בשלב 1.5.
  2. ביצוע הדמיה ביולומי,
    1. נטר את צמיחת הגידול בנמען על-ידי הזרקת עכברי הנמען עם 4 מ ג של D-לluciferin. דגירה עבור 5 דקות כדי להבטיח לוספרין מגיב עם לוספרין.
    2. הורד את העכבר באמצעות 3% isofליקאן בחדר של ביולומינסנציה ודימוי הנמענים עבור 5 דקות בשדה D וזמן החשיפה של 1 דקות.
    3. ניתוח נתונים באמצעות תוכנות לניתוח תמונות. שינוי קנה המידה של תמונות צבע מדומה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
      הערה: כל התמונות חייבות להיות באותה מידה על פני ניסויים.
    4. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לקבוע את אזורי הריבית ולכמת את צפיפות האות על ידי חישוב שטף (פוטונים/s) להיות נפלט מכל אזור של עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ה-MHC הגדול-לא תואם B6 (H2kb)-balb/C (H2kd) מודל התכתב היטב לפיתוח gvhd לאחר ההשתלה (איור 2). כל ששת הסימנים הקליניים GVHD שנקבעו בעבר על ידי קוק ואח '16 אירע הנמענים המושתלים עם WT-B6 T-תאים, אבל לא הנמענים מושתלים עם BM לבד (שלב 1.5), אשר ייצגו את הקבוצה gvhd-שלילי. קיימים שני שלבים בפיתוח ה-GVHD במודל זה. ראשית, שיא החומרה הוא כ 11 ימים לאחר ההשתלה, ואחריו ירידה בתוצאות הקליני התאוששות משקל הגוף עד 16 ימים. בשלב זה, מנגנונים מסוימים כגון דלקת הנגרמת על-ידי הקרנה ותסמונת חרט כוננים את הפתוגניות המחלה ו-GVHD. הנמענים בצורה אחידה נכנעים ל-GVHD כ-30 יום לאחר ההשתלה.

לפחות 85% של ה-BM הבדיל לתוך DCs (איור 3א). מעניין, השתלת עם fB-/- DCs שיפרה את הישרדות הנמען ואת הציון הקליני gvhd (איור 3B, C). בהינתן כי fB-/- DCs יש פחות אנטיגן הצגת קיבולת הפגינו על ידי ביטוי MHCII נמוך ומופחתת ביטוי מגירוי שיתוף בביטוי17, פרוטוקול שיתוף השתלת עשוי להיות מספיק לבדיקת איתות שונים או מטרות DCs בקרי הנמען בפיתוח GVHD לאחר bmt.

הטוהר בתאי T היה 90% לאחר העשרה (איור 4א). לוציפראז-התמרה לימפומה בתאים B מאפשר ניטור צמיחת הגידול בבעלי חיים חיים (איור 4ב). במודל זה, אם הנמענים מתו ללא כל אות ו-GVHD גבוה הציון הקליני, הגיע למסקנה כי הם מתו של GVHD. כל המקבלים BALB/c הנמענים שהתקבלו BM לבד בתוספת A20 מתו מהישנות הגידול (איור 3ב). לעומת זאת, אם החיה מתה מצפיפות האותות הגבוהה, המסקנה היא כי הם מתו מהישנות הגידול. כפי שמתואר באיור 3B, הנמענים WT balb/c מושתלים עם BM ו-T-תאים מ ACC1FL/חליל B6 (ACC1+/+ T-תאים) מת של gvhd. אם חיות מתו עם אותות של מחלה, זה הגיע למסקנה שהם מתו של GVHD והתדרדרות הגידול. בעלי החיים שהתקבלו BM ו-T-תאים מתוך ACC1fl/חליל x CD4 התורם B6 (ACC1-/- T-תאים) מתו של הן gvhd והן התדרדרות הגידול (איור 3B). בעלי חיים ניתן להניח חזרה בכלוב כדי להיות הדמיה בנקודת זמן מאוחרת יותר או מורדמים עבור הדמיה vivo ex. באמצעות התוכנה, מסת הגידול בבעל החיים יכול גם לנתח בנפרד (איור 3ב).

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של הליך ה-BMT. (א) ערכה עבור mhc-לא תואם B6 ← b/c bmt דגם. (ב) תוכנית עבור DC co-שתילת החברה fvb → מודל B6. (ג) הערכה עבור B6 → balb/C מודל gvhd/gvhd. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: רס ן MHC לא תואם B6 → BALB/c GVHD מודל. עכברים BALB/c היו לקרינה באופן מידי מושתלים והושתל עם 5 x 106 BM לבד או עם 0.75 x 106 T-תאים. (א) הישרדות נתונים, (ב) אובדן משקל הגוף, ו (ג) נתונים קליניים של הנמענים של BM לבד או עם T-תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: DC משותף מודל HCT. BM היה בודד מ WT ו fB-/- B6 עכברים והבדיל לתוך DCs על ידי culturing עם GM-שדרתי. (א) הטוהר של בקרי התחום נבדק על ידי הזרימה cyCD11c try על ידי כתמים עם ו MHCII. המקבלים לקרינה B6 מטופלים מושתלים עם BM (3 x 106/עכבר) פלוס מטוהרים T-תאים (1 x 106/עכבר) מן התורמים fvb. הנמענים קיבלו גם 2 x 10שישה WT או פנסיון מלא-/- B6 מוניטור-DCs תאים ביום ההשתלה. ההישרדות (ב) ו הציון הקליני (C) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מייג-MHC לא תואמת B6 → BALB/c GVHD/GVHD מודל. הנמענים WT BALB/c היו מושתלים עם TCD-BM (5 x 106/עכבר) לבד או עם ACC1+/+ t-תאים או ACC1+/+ t-תאים (1 x 106/עכבר) מבודדים מ B6 הרקע עכברים. בנוסף, הנמענים קיבלו 2 x 103 A20-לוק בזמן ההשתלה. הטוהר תא T נבדק על ידי זרימה cy, לנסות באמצעות כתמים עם חיים/מוות צהוב, CD3, CD4, ו CD8 להזרים נוגדנים (א). המטופלים היו מנוטרים על גידול הגידול שנקבע על ידי הדמיה ביולומינציה גוף שלם (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השימוש בתאי גזע להתאים אדם מסוים היא גישה יעילה לטיפול בסרטן מתקדם ועמיד18. תרופות מולקולה קטנה, עם זאת, נותרו זמן רב המוקד העיקרי של טיפול בסרטן אישית. מצד שני, בטיפול הסלולר המון אינטראקציות בין התורמים והמארחים יכולים להשפיע באופן מוחלט על תוצאות הטיפול, כגון פיתוח של GVHD לאחר BMT1.

רס ן MHC לא תואם מודלים העכבר של BMT הם כלי רב ערך בהבנת הביולוגיה של GVHD ובדיקת היעילות של תרופות בטיפול שלה. ביניהם, C57BL/6 (h2ב) כדי balb/c (h2d) ו fvb (h2q) → C57BL/6 (h2ב) הם דגמים מבוססים5,7. מודלים אלה לשלב או מיזוג קרינה myeloablative כמו מנה אחת (BALB/c) או מינון מפוצל (C57BL/6) שבו 3 – 8 מרווחי השעה נדרשים כדי להקטין את רעילות המעיים5. שני הדגמים תלויים הן CD8+ ו CD4+ T-תאים. במודלים אלה, חומרת GVHD והישרדות הם התוצאות העיקריות נמדד, ואת הנמען הושתל יש קינטיקה מהירה עקבית ו 100% החדירה. על מנת לפקח על הגירה T-cell והתרחבות, T-תאים מתוך לוציפראז התמרה עכברים תורם יש להשתמש עבור vivobioluminescence הדמיה19. עם זאת, בעוד 90% של BMT ביצע הם MHC בהתאמה, מודל B6-BALB/c לא דומה באופן מושלם למצב הקליני. הגילוי של MHC ו-אנטיגנים היסטוליים מינורי (miHAs) תרם באופן משמעותי כדי לקדם את השדה של BMT10. העכבר הקטן MHC-לא תואם GVHD מודלים מקרוב יותר לחקות את החולה GVHD20. מיזוג אינטנסיביות כדי לגרום התורם תא התורמים גורם נזק לרקמות והוא יכול להשפיע על התוצאה GVHD21. התניה משטרי במודלים murine מערבת לעתים קרובות tbi בניגוד כימותרפיה בהגדרות קליניות22,23. לכן, מודל כימותרפיה מדכאים חיסוני נעשה שימוש כדי לחקות עוצמה מותנית מופחתת במרפאות. מודל העכבר היה C57BL/6 (H2ב) כדי balb/c (h2d) ו נמענים מושתלים פיתחו סימפטומים קליניים והיסטולוגית הקשורים gvhd24.

היתרון הפוטנציאלי של פרוטוקול שיתוף המושתלים הוא לבדוק את התפקיד של בקרי התחום של הנמענים בלי להסתמך באופן ספציפי על CD11c העכברים מרוקנים. כי הדור מוניטור-DC בוצע ex vivo, פרוטוקול זה ניתן גם להחיל כדי לבדוק את התפקיד של סוגי תאים אחרים כגון מקרופאגים או נויטרופילים ב-GVHD פשוט על ידי שינוי תנאי התרבות. באמצעות CD 45.1+ B6 עכברים כנמענים מאפשר לחוקרים להבחין BM-DCS (cd 45.2+ CD11c+) מקבוצת בקרי הנמענים (cd 45.1+ CD11c+) על-ידי ניתוח זרימה. מספר גמיש של תאים שנוצרו ex vivo ו מאומצים לנמענים המושתלים הוא יתרון נוסף של פרוטוקול השתלת שיתוף. יתרה מזאת, התרבות הvivo לשעבר מאפשרת לנו להקרין את התרופות הפוטנציאליות לשליטה ב-GVHD.

היכולת לעקוב אחר דפוסי הגידול ב vivo הוא כלי רב עוצמה שיש לו את הפוטנציאל לבדוק אם התרופה יכולה להשפיע על פעילות GVL. באמצעות זה GVHD/GVHD מודל, התקדמות הגידול גרורות ניתן לפקח על חיות חיים16. יתר על כן, הגדרה זו ניתן להשתמש לבדיקת האפקט GVL בסוגי סרטן מרובים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת מרכז פלורידה המכללה לרפואה סטארט-up מענק (כדי HN), אוניברסיטת פיטסבורג מרכז רפואי הילמן מרכז הסרטן להתחיל מענק (כדי HL), ארצות הברית NIH מענק #1P20CA210300-01 ו-ויאטנמית משרד מענק בריאות #4694/QD-BYT (כדי PTH). אנו מודים ד ר Xue-zhong יו באוניברסיטת הרפואית של דרום קרוליינה עבור מתן חומרים למחקר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 157 תא גזע המטפיאה השתלת מח עצם השתלת שתל-מול-מארח המחלה השתל-לעומת לוקמיה הדנדריטים תאים שיתוף השתלת התא הדנדריטים
עצם השתלת מח פלטפורמת לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים במחלה שתל-מול מארח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, H. D., Huong, P. T.,… More

Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T. H., Alvarez, A. M., Le, N. T., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter