Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come microiniettare una miscela DNA/DOTAP in boccioli di occhiali di embrioni di Xenopus laevis di un giorno, e come immaginare e ricostruire singole proteine fluorescenti verdi (GFP) che esprimono arbori assonali ottici nei midbrain intatti, vivono girini Xenopus.
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Articolo metodologico
Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles
In questo articolo
Sommario
Abstract
La proiezione visiva primaria dei girini della rana acquatica Xenopus laevis serve come un eccellente sistema modello per studiare i meccanismi che regolano lo sviluppo della connettività neuronale. Durante la creazione della proiezione retino-tectale, gli assoni ottici si estendono dall'occhio e navigano attraverso regioni distinte del cervello per raggiungere il loro tessuto bersaglio, il tectum ottico. Una volta che gli assoni ottici entrano nel tectum, elaborano arbori terminali che funzionano per aumentare il numero di connessioni sinaptiche che possono fare con interneuroni bersaglio nel tectum. Qui, descriviamo un metodo per esprimere il DNA che codifica la proteina fluorescente verde (GFP), e i costrutti genici di guadagno e perdita di funzione, nei neuroni ottici (cellule gangliari retiniche) negli embrioni di Xenopo. Spieghiamo come microinietare un reagente combinato DNA/lipofection in bulbi oculari di embrioni vecchi di un giorno in modo tale che i geni esogeni siano espressi in un numero singolo o piccolo di neuroni ottici. Etichettando i geni con GFP o co-iniettando con un plasmide GFP, gli arbori assonali terminali di singoli neuroni ottici con segnalazione molecolare alterata possono essere immagine direttamente nel cervello di girini Dello Xenopo intatti diversi diversi diversi diversi giorni dopo, e la loro morfologia può essere quantificato. Questo protocollo consente la determinazione di meccanismi molecolari auto-autonomi alla base dello sviluppo dell'arborizzazione ottica degli assoni in vivo.
Introduzione
Durante lo sviluppo del sistema nervoso, assoni di neuroni pressinaptici navigare attraverso diverse regioni del cervello per raggiungere le loro aree di destinazione. Quando gli assoni invadono i loro tessuti bersaglio, stabiliscono connessioni sinaptiche con neuroni bersaglio postsinaptici. In molti tipi di neuroni, gli assoni aumentano il numero e l'estensione spaziale delle connessioni sinaptiche che possono effettuare elaborando reti di rami terminali o arbori1. La proiezione retino-tectale dei girini della rana acquatica Xenopus laevis è un potente modello vertebrato per esaminare i meccanismi alla base dell'arborizzazione degli ....
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Protocollo
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Touro University California (Protocollo - TUCA003TE01X).
1. Ottenere X. laevis Embrioni
- Ottenere gli embrioni X. laevis mediante accoppiamento naturale di coppie di rane adulte maschili e femminili innescate con gonadotropina corionica umana (HCG), con la fecondazione in vitro degli ovuli versati da rane adulte, innescate con HCG, o ordinando direttamente (Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordin....
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Risultati
Il protocollo descritto in questo articolo produce un tasso di successo del 30-60% degli embrioni di Xenopo iniettati che esprimono GFP (da solo o insieme a costrutti di DNA aggiuntivi) in uno o dieci arbori assonali ottici. Nella Figura 3, mostriamo immagini confocali rappresentative di GFP esprimendo controllo e artifungi assonali ottici mutanti in tattili Xenopus intatti Xenopus giri dal nostro studio recentemente pubblicato7. Per questo studio, a.......
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Discussione
In questo articolo, dimostriamo come esprimere costrutti di DNA esogeni in singoli o piccoli tipi di neuroni ottici e come immaginare singoli arbori assonali ottici che esprimono arbori assonali ottici con segnalazioni molecolari normali e alterate in tapole intatte e viventi della rana X . lave. Spieghiamo anche come ricostruire e quantificare la morfologia di GFP esprimendo arbori assonali ottici da immagini catturate in vivo. Per esprimere plasmidi di DNA esogeno in piccoli numeri di neuroni ottici, microinie.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo touro University California College of Osteopathic Medicine per aver sostenuto la nostra ricerca. Riconosciamo gli studenti precedenti in laboratorio (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) che hanno contribuito a implementare questa tecnica di microiniezione nel nostro laboratorio. Siamo grati alla dott.ssa Christine Holt, nel cui laboratorio è stata sviluppata per la prima volta questa tecnica di microiniezione/lipofezione del DNA negli embrioni di Xenopus.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Micropipette da 3,5" | Drummond Scientific | 3-000-203 - Software G/X | |
| μ-manager (Versione 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Gonadotropina corionica umana) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forcipe #5 | Strumenti per le scienze | 11250-10 | |
| Eclipse E800 microscopio a epifluorescenza | Nikon | Obiettivi: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (versione 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative | |||
| Microfil | |||
| World Precision Instruments | MF 34G-5 | ||
| adattatore universale e base di supporto | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Estrattore per micropipette | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorizzato z-stage | Strumentazione scientifica applicata | MFC-2000 | |
| Iniettore Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Versione 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embrioni | Nasco | LM00490 |
Riferimenti
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: d....
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Ristampe e permessi
