Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس السلوك بناء العش في الفئران ، والتي من المعروف ان يكون ضعف في العديد من الاضطرابات العصبية والامراض. ويفحص هذا البروتوكول فائده أربعه مواد ويتيح الفرصة لقياس اتفاق التقدير الكمي في التهديف ، وتحسين صحة المقايسة وموثوقيها.
Abstract
بناء نيست هو سلوك فطري في القوارض الذكور والإناث ، حتى عندما تثار في إعدادات المختبر. علي هذا النحو ، العديد من الباحثين توفير القوارض الاصطناعية و/أو المواد الطبيعية (مثل خيوط ، والانسجه ، والقطن ، والورق ، والقش) كمقياس لرفاهيتهم العامة وكتقييم التبعية للتنبؤ احتمال انخفاض في الإدراك. عاده ، تشير التغييرات في سلوكيات التعشيش ، مثل الفشل في إنشاء عش ، إلى حدوث تغيير في الصحة أو الرعاية الاجتماعية. الاضافه إلى ذلك ، السلوك التعشيش حساسة للعديد من التحديات البيئية والفسيولوجية ، فضلا عن العديد من الطفرات الجينية الكامنة وراء الامراض المرضية. يصف البروتوكول التالي نموذج سلوك التداخل الذي يستكشف استخدام أربعه أنواع من مواد التداخل. الاضافه إلى ذلك ، يستخدم البروتوكول الارتباطات داخل المرساة لإثبات ان الاعتمادية البينية اعلي عندما يتم بناء الأعشاش من الورق الممزق بالمقارنة مع غيرها من المواد التعشيش المشتركة مثل مربعات القطن ، والتقلبات ورقه ، والكوز الناعمة الاسره. وقد تكون المنهجية المختارة والاعتبارات الاحصائيه (اي الارتباط داخل الرابطة) لهذا الفحص ذات فائده لأولئك الذين يجرون تجارب لتقييم نوعيه معيشة الفئران.
Introduction
مبني نيست هو السلوك الفطري في العديد من الكائنات مثل الطيور والأسماك والقوارض والقردة العظمي ، وانها تجذب المزيد من الاهتمام لفائدتها المحتملة في دراسة الامراض العصبية والاضطرابات التي تتميز بانخفاض الرفاه وضعف أنشطه الحياة اليومية1. الفئران ، من الذكور والإناث علي حد سواء ، وبناء أعشاش الحجم بالمثل لأغراض الإنجاب ، والحفاظ علي الحرارة ، والماوي ؛ الأهم من ذلك ، فانها تستمر في القيام بذلك حتى عندما أثيرت في الإعدادات المختبرية2. هيس ، بتروفيتش ، و غودوين3 يجادل بان المحفزات المناسبة بيولوجيا هي الراجحة للحث علي السلوكيات المناسبة بيولوجيا مثل التعشيش. ومع ذلك ، وقد استخدمت مجموعه متنوعة من المواد الطبيعية والاصطناعية ، مثل القش والقنب وخيوط القطن وشرائط الورق والقطن كرات الأسنان ، والمربعات القطن الضغط ، لتقييم السلوك بناء عش2. التغييرات في هذه السلوكيات التعشيش (اي الفشل في إنشاء عش من المواد المقدمة) تشير عموما إلى تغيير في الصحة أو الرفاه. وفي معظم الحالات ، يعزي الافتقار إلى بناء العش إلى عده عوامل تؤثر سلبا علي الرفاه. وتشمل هذه الامثله التي قللت بشكل فعال من جوده بناء العش في الفئران درجات الحرارة القصوى. التحفيز المؤلم. الامراض المستحثة والعدوى ؛ الطفرات الجينية; وآلافات الدماغية في المناطق الوسطي الإنسي ، الحاجز ، والحصين4،5،6.
مرض الزهايمر هو مرض الأعصاب التقدمية التي تتميز بفقدان انسجه المخ ، تراكم لويحات اميلويد-β خارج الخلية ، والتشابك داخل الخلايا العصبية الخلوية التي تتالف من فرط فوسفوريلاتيد ميكروتوبولي-المرتبطة البروتين ، تاو7. بالاضافه إلى ذلك ، يتميز مرض الزهايمر ، ولا سيما ، العجز في التعلم والذاكرة والعاات في أنشطه الحياة اليومية. في الفئران ، يتم فحص أنشطه الحياة اليومية عاده عن طريق الركض بالعجلات الايقاعيه8،9،10،11، علي الرغم من ان البدائل الجديدة ، مثل التعشيش ، تتزايد شعبيتها. وقد تبين ان التعشيش حساس للتلاعب (علي سبيل المثال ، الطفرات الجينية ، والضغوط البيئية) التي تم تحديدها كعوامل خطر و/أو أسباب مرض الزهايمر. علي هذا النحو ، يمكن استخدام التعشيش كمقايسة اضافيه أو تكميليه في العديد من سلالات الماوس التي نموذج تلك الخصائص من مرض الزهايمر. علي سبيل المثال ، الشماس والزملاء12 قياس بناء عش من الفئران Tg2576 مع بروتين السلائف اميلويد السويدية (appswe) و presenilin 1 (PS1) الطفرات الجينية. وكانت نوعيه الأعشاش التي شيدتها الفئران Tg2576 المجموعات اسوا بكثير من الضوابط البرية في كل من 3-و 12 شهرا من العمر. الاتفاق مع هذه النتائج ، ذكرت شركه "فلالي وآخرون13 " ان الفئران الذكور APPSWE/PS1 الفردية بالنظر إلى قطعتين من القطن 5 × 5 سم بنيت أعشاش أفقر بكثير كما تم تصنيفها علي مقياس 1-5 (1 = نيسليت لا تطرق ، 5 = عش الكمال بالقرب). الفئران المعدلة وراثيا باستمرار بناء أعشاش اسوا في 6-, 9-, و 12 أشهر من العمر مقارنه مع نظرائهم البرية, وفي بعض الحالات, الفئران Appswe/PS1 فشلت تماما في بناء عش من القطن المقدمة.
وقد أظهرت البحوث السابقة من مختبرنا ان الفئران البرية C57BL/6J بناء أعشاش أفضل بكثير من المربعات القطن مقارنه CRND8 و CRND8/E4 الفئران9. ومع ذلك ، فان غالبيه التجارب باستخدام مربعات القطن المضغوطة تبدو متغيرة ، مع الفئران البرية تفشل في إظهار الدرجات العالية المتوقعة مقارنه بالفئران المعدلة وراثيا التي من المتوقع ان تظهر درجات منخفضه جدا في التعشيش2، والتي قد تؤدي جزئيا إلى عدم وجود اختلافات في المعايير المقدرة (اي الفروق المتوسطة) والدلالة الاحصائيه. قد يعزي عدم وجود اختلافات جزئيا إلى عدم كفاية الشيخوخة من الفئران أو الوقت المخصص للتداخل. بدلا من ذلك ، قد تكون المواد التعشيش تحديا إضافيا ، مما يؤدي إلى مزيد من التباين بسبب تفضيلات الباحثين المنهجية في كميه ونوع المواد ، والتي قد تتفاعل حتى مع سلاله الماوس. علي سبيل المثال ، قدمت روبنسون-جونكير والزملاء14 مواد الفراش المجهزة أو غير المجهزة من احجام مختلفه (اي رقائق صغيره أو كبيره) إلى C3H/hencrl الفئران والفئران Balb/canncrl ، والتي لوحظت عاده ، علي التوالي ، والفقراء وقويه العش بناه. عندما قدمت الفراش غير المجهزة ، C3H الفئران بنيت اقل تعقيدا ، ولكن مماثله في أعشاش الجودة بالمقارنة مع تلك الفئران BALB/c. المثل, مارتن وزملاءه15 مقارنه التعقيد العش من المواد التعشيش المختلفة المعطية للفئران الغزلان, قريب بعيد من الأنواع الmusculusه التي لها اختلافات تطوريه متميزة (اي, أكثر عرضه للبرصف في الأشجار و خمائل وأكثر نشاطا في الأسر) ، ولكن الحصول علي رعاية تربيه مماثله كفئران المختبرات المشتركة وبناء أعشاش من اي لينه المتاحة ، المواد الليفية16،17،18. الإناث ومربي مع الجراء في قفص المنزل بنيت أعشاش أكثر تعقيدا من الذكور ، والمؤلفين تشير إلى ان هذه الاختلافات السلوكية قد يكون بسبب التغيرات المرتبطة في تركيزات البروجسترون في الفئران الغزلان15. الأهم من ذلك ، بنيت الفئران أعشاش أكثر تعقيدا تتالف من الورق البني تليها مربعات القطن وأسطوانات القطن ، والأعشاش الأقل تعقيدا تم بناؤها من الورق الأبيض وفرقت المربعات الصغيرة القطن.
وعلي الرغم من تزايد شعبيه التعشيش ، فان الاعتبارات المتعلقة بالممارسات السليمة علميا والفعالة من حيث التكلفة والحساسة للوقت تناقش بادني حد. ونظرا للتحديات المنهجية والاقتصادية المذكورة أنفا ، فان هذا البروتوكول يحقق في فائده المواد المتداخلة المختلفة-مربعات القطن ، وتقلبات الورق ، والورق المبشور ، والفراش المجهز-في السلوك المتداخل. علي وجه التحديد ، قدمنا جميع المواد التعشيش لكل من الذين تتراوح أعمارهم بين C57BL/6J الضوابط البرية ومرض الزهايمر APOE e4 الفئران من أجل التحقيق في اي النمط الجيني المحتملة من التفاعلات المادية في نوعيه التعشيش. الاضافه إلى ذلك ، سعت التجربة إلى تقييم موثوقيه الأعشاش التي شيدت من مواد مختلفه. معا ، هذا البروتوكول يدل علي تفوق ماده واحده التعشيش في هذه العينة-ورقه تمزيقه-من حيث نوعيه العش والاتفاق هداف ، بهدف تحسين صحة وموثوقيه المقايسة التعشيش.
Protocol
وقد تمت الموافقة علي جميع الإجراءات من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي لجامعه جورج ميسون وهي وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها التقييم واعتماد الرعاية الحيوانية المختبرية.
1-الماشية والاعتبارات السابقة للتقييم
- لهذا البروتوكول ، واستخدام الكبار ، 9-12-الشهر القديم C57BL/6J (n = 10) (الأسهم # 000664) الفئران البرية والفئران apoe e4 (n = 11) من J20 hemizygous (الأسهم #006293) x هووزجيوس apoe e4 (الأسهم #012307) الصليب.
- في غرفه السكن ، والفئران منزل المجموعة مع أصحاب الصغار من نفس الجنس مع الإثراء المناسب (علي سبيل المثال ، لهذا البروتوكول ، وقدمت الفئران عجله التشغيل ، الإسكيمو ، والنايلون لعبه صغيره مضغ). المجموعة البيت 4-6 الفئران الإناث ، و 4 الذكور في 356 mm L x 485 mm W x 218 مم H قفص المنزل.
ملاحظه: يمكن للباحثين النظر في تنفيذ استراتيجيات قبل و/أو بعد التعشيش من أجل تجنب العدوان القفص زميله عندما يتم أعاده الفئران بعد التجارب التعشيش. وقد تشمل هذه الاستراتيجيات ، علي سبيل المثال لا الحصر ، المناولة اليومية قبل الاختبارات السلوكية لتحسين تاقلم الفئران مع التعامل اثناء الاختبارات السلوكية ، والباحثين ، والعاملين في التربية19، وفصل والسكن بشكل فردي الفئران العدوانية ، أو الحد من عدد الفئران في المنزلية20، اعتمادا علي شده القتال داخل القفص ، لاحظ الجروح21، الخ.
2. غرفه والتعشيش الاعداد
- تاكد من ان كل ماوس يكمل أربع تجارب (ماده واحده لكل تجربه). عشوائيا ترتيب المواد التعشيش لكل الماوس لتجنب تاثير النظام.
- اعداد الأقفاص في غرفه اختبار منفصلة. سجل الظروف البيئية (علي سبيل المثال ، 22.2-22.3 درجه مئوية ، 45-47% الرطوبة ، أضواء علي 9:00 ص – 9:00 م) بحيث تكون متسقة عبر المحاكمات ومطابقه لغرفه السكن. توفير الغذاء والماء الإعلان حسب.
- تعيين كل ماوس رقم تعريف عشوائي (ID) أو حرف. ارفق بطاقة المعرف العشوائي إلى قفص 29.2 × 18.4 سم.
- تسجيل الهوية الحيوانية الاصليه/الوسم وغيرها من الهوية اللازمة في سجل مستعمره لضمان ان المساعدين والعاملين في تربيه الماشية لا تزال عمياء للظروف.
- بشكل عشوائي وضع قفص النظام في غرفه الاختبار من هذا القبيل ان الفئران البرية والمحورة وراثيا ليست مفصوله بشكل غير لائق (اي علي الجانبين المعاكس من الغرفة ، علي رفوف منفصلة ، الخ).
- اعداد المواد التعشيش بما فيه الكفاية تغطي الجزء السفلي من القفص. استخدام ما يقرب من 100 غرام من الوزن الجاف من الفراش كوز لمربع ، تويست ، والتجارب ورقه تمزيقه ، وتقريبا 100 غرام من الفراش الكوز لينه للمحاكمة الكوز الناعمة.
- إذا كان استخدام الكاس لتفريق المواد التعشيش ، ثم ملء الكاس لا يزيد عن 100 mL مع الفراش كوز أو الفراش الكوز الناعمة.
- وضع أول ماده التعشيش في تسلسل قبل إدخال الماوس في القفص. استخدم هذا البروتوكول (1) مربع واحد القطن الضغط ، (2) تويست ورقه واحده ، (3) 100g من الفراش الكوز الناعمة فقط (اي لا الفراش اضافيه أو المواد التعشيش المضافة) ، و (4) 2.5 غرام من النظيفة (لا الحبر) ، تمزيقه ورقه الطابعة البيضاء إلى شرائط 5-7cm. تفريق المواد التعشيش كما هو مبين في الشكل 1 (خط الأساس).
الشكل 1: قفص اعداد لكل ماده. أكملت جميع الفئران محاكمه واحده مع كل نوع من المواد لما مجموعه أربع محاكمات. واصطف الفراش corncob الجزء السفلي بأكمله من الأقفاص التي تحتوي علي تطور ورقه ، مربع القطن الضغط ، وتمزيقه ورقه. تم تفريق الفراش الكوز الناعمة بالتساوي عبر القفص لتشجيع الفئران لفصل المربعات القطن الصغيرة من corncob. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
3-التجربة المتداخلة
- بدء أول تجربه تعشيش في نفس الوقت من اليوم في بداية دوره الضوء (علي سبيل المثال ، 9:00 AM).
- جلب المنزلية التي تحتوي علي الفئران في غرفه الاختبار. أزاله كل الماوس من المنزل ووضعه في قفص التعشيش المعين مع المواد التي وضعت بالفعل في القفص. أعاده المنزلية إلى غرفه السكن.
- السماح للفئران بإكمال محاكمه واحده لمده 24 ساعة دون عائق.
- 24 ساعة بعد بدء المحاكمة الاولي ، والعودة إلى غرفه الاختبار.
- أزاله غطاء القفص بعناية وتصوير عش الماوس ، والتقاط المعرف المعين في الصورة والتقليل من ظهور اي مواد خارج القفص.
ملاحظه: انتظر الماوس للانتقال من العش قبل محاولة ازالته من القفص. ويوصي بشده لتصوير العش في حين ان الماوس في القفص ولكن قباله العش. محاولة أزاله الماوس من القفص قبل تصوير يمكن ان يسبب الماوس لتصبح الدهشة ، التالي التحرك علي راس ، وتفريق ، والمواد التعشيش. - أزاله الماوس برفق من قفص التعشيش ووضعه في قفص مؤقت القابضة. التخلص من الفراش وأي مواد التعشيش ، واستبدال الفراش وتوفير المواد التعشيش المقبل في التسلسل ، وأعاده الماوس إلى قفص التعشيش.
- كرر حسب الضرورة للحصول علي عشرات لجميع المحاكمات 4. فمن المستحسن استخدام ورقه تمزيقه ومعايير التهديف المصاحبة ، علي الرغم من ان الباحثين قد تكون مهتمة في استخدام المواد البديلة التي نوقشت في هذا البروتوكول.
- عندما تكون جميع المحاكمات كامله ، والعودة الفئران إلى أقفاص منزلهم. مراقبه الفئران لأي سلوك العدوانية المحتملة. قد يحدث العدوان في الذكور البرية القديمة.
ملاحظه: لأغراض هذا البروتوكول ، تم اختبار الفئران مره واحده في حوالي 9 – 12 شهرا من العمر. وينبغي ان تجري التعشيش في عده اعمار (اي في سن مبكرة ، تعتمد علي السلالة المختارة ، قبل بداية الصفات الظاهرية) لتوثيق الانخفاض في قدره التعشيش مع مرور الوقت وإثبات الدور المسبب المحتمل للتنكس العصبي.
4. تسجيل وتقييم الاعتمادية البينية
- توفير صور أساسيه لكل ماده تعشيش لشخصين علي الأقل اعمي للدراسة. علي الرغم من انه غير مطلوب ، تاكد من ان الهدافين علي دراية بمفهوم التعشيش. عند تدريب الهدافين ، تقديم سلسله من الأعشاش المثال (علي سبيل المثال ، الشكل 2 للورق تمزيقه) لتعريف الهدافين مع كل نوع من المواد (ان وجدت) ومعايير التهديف.
- تقييم كل عش علي مقياس من 1 – 5 باستخدام معلومات المقياس التالية (مقتبسه من الشماس ، 2006)2. انظر الشكل 2 علي سبيل المثال التهديف باستخدام ورقه ممزقه.
- تعيين درجه من 1 عندما الورق تمزيقه أو المربعات الصغيرة بقيت متناثرة في جميع انحاء القفص ، أو مربع القطن أو تطور بقيت لم يمسها ؛
- تعيين درجه من 2 عندما تم بناء بعض المواد في عش ، ولكن أكثر من 50 ٪ من المواد لم تستخدم لبناء العش (اي ، ظلت متناثرة أو معظم المواد الاصليه بقيت لم يمسها) ؛
- تعيين درجه من 3 عندما شيدت عش ملحوظ ، ولكن كانت لا تزال متناثرة عده قطع.
- تعيين درجه من 4 عندما تقريبا تم استخدام جميع المواد للععش ، ولكن لم يبق سوي عدد قليل من المواد المتناثرة أو كانت بالقرب من العش ؛
- تعيين درجه من 5 عندما تم استخدام جميع المواد لجعل عش يمكن التعرف عليها.
ملاحظه: يجب علي الهدافين أخذ فواصل وأعاده البحث في الصور الاساسيه من أجل تجنب التعب والتحيز اثناء اجراء تسجيل النقاط. يجب علي الهدافين عدم مناقشه العشرات مع بعضهم البعض لتجنب التحيز. يجب علي الهدافين مناقشه النقاط بعد اكتمال التهديف ، أو إذا كانت هناك حاجه إلى مزيد من المناقشة لتغيير الدرجات ، والتي يمكن ان تحل المشاكل مع الارتباطات داخل المرساة (ICC). سيتم اجراء الارتباطات داخل القائمة باستخدام الخطوات المذكورة في القسم 4.2.
الشكل 2: مثال لتسجيل النقاط باستخدام معايير الورق الممزق ، المادة المفضلة. من اليسار إلى اليمين: 1 -بقيت الورقة الممزقة لم يمسها ؛ 2 -وقد شيدت بعض الورق في عش ولكن معظم القطع لا تزال متناثرة. 3 -تم بناء عش ملحوظ ، ولكن العديد من القطع كانت لا تزال مبعثرة. 4 -وقد استخدمت معظم القطع لعش ، ولكن كانت متناثرة بعض القطع بالقرب من العش ؛ 5 -تم استخدام جميع القطع لجعل العش. لاحظ انه في الصور الفوتوغرافية ، يظهر الرقم المخصص للحيوان لتجنب العمي. لون البطاقة عشوائي. يجب علي الباحثين السماح للماوس بالبقاء في القفص من أجل تجنب مذهله الماوس ، والتي يمكن ان تفرق احتمال العش. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
- جمع وإدخال عشرات وتنسيق ملف البيانات بحيث ان كل النقاط لكل هداف لكل ماده في أعمده منفصلة.
ملاحظه: إذا كنت تستخدم الملف التكميلي 1، يرجى ملاحظه ان البرنامج النصي الترميز لهذا التحليل يتطلب الحرة ، والبرمجيات المفتوحة المصدر (علي سبيل المثال ، حزمه Irr في rstudio)22،23. يزيل البرنامج النصي الرؤوس ومتغيرات الموضوعات (اي الصف العلوي ومعرفات الحيوانية) لاجراء الارتباط داخل الرابطة (ICC). تشغيل البرنامج النصي لاجراء ثنائي الاتجاه ، والاتفاق ، والمتوسطات يقيس ICC عن طريق تسليط الضوء علي المقطع الذي تم ترسيمه من التعليمات البرمجية وضرب Ctrl + Enter أو الأوامر + Enter. - قارن المحكمة الجنائية الدولية بالمعايير القائمة24و25و26. بشكل عام ، تتوافق قيم ICC أعلاه 0.80 مع الاعتمادية القوية بين الشركات الدولية ، وتبرر العلامات التي سيتم حساب متوسطها في نقطه زمنيه معينه (الملف التكميلي 2).
- استخدم نفس معايير ICC الخاصة بالاعتمادية الداخلية ، والتي قد تكون ذات فائده لأولئك الذين يقومون بالتسجيل للمرة الاولي.
تحذير: يجب علي الهدافين تسجيل نفس الأعشاش المصورة في غضون أسبوع من التقييم الاولي. المضي قدما بحذر مع متوسط البيانات عندما ICC منخفضه ، لان هذا قد تشوه البيانات أو إنتاج نتائج فارغه. إذا كانت قيم ICC منخفضه ، ثم (1) التدريب الإضافي لهدافي قد يكون مطلوبا ، (2) الهدافين قد تحتاج إلى مناقشه المنطق الخاصة بهم لعشرات العش ، (3) قد تكون هناك حاجه إلى مراجع مستقل آخر لاتخاذ قرار بشان النتائج ، أو (4) داخل الخاطر قد تحتاج إلى تقييم الموثوقيه. إذا كانت الاعتمادية الداخلية ضعيفه ، فقد يتطلب الأمر تدريبا إضافيا أو هدافا مختلفا.
5-الاعتبارات الاحصائيه
- اجراء تحليلات احصائيه ، حسب الاقتضاء. للبيانات التي لا تنتهك الافتراضات الطبيعية ولكن استخدام مواد متعددة لكل الماوس (اي تاثير داخل الموضوعات) ، استخدم تحليل مختلطة من التباين (ANOVA).
- إذا كنت تستخدم رموز المقدمة كملفات تكميليه ، يرجى تحميل اضافيه الحزم المضافة التي تم تحديدها في البرنامج النصي27،28،29،30.
- في حاله اجراء ANOVA مختلطة باستخدام البرنامج النصي المتوفر ، قم بتشغيل البرنامج النصي لتحويل اي ملفات بيانات بتنسيق عريض إلى تنسيق طويل (علي سبيل المثال ، بدلا من المتغيرات المتكررة عبر الاعمده ، تحويل الخلايا إلى تكرار عبر الصفوف). يتم تضمين ملف بيانات مثال في هذه المخطوطة لتوضيح كيفيه تحويل ملف بيانات من تنسيق عريض إلى تنسيق طويل.
- اجراء ANOVA مختلطة ، كما هو محدد في البرنامج النصي. لاحظ انه إذا تم انتهاك اختبار [موكي] كرويه ، فقم بتنفيذ عوامل التصحيح مثل تصحيح جيسسر الاحتباس الحراري.
- اجراء إيه اختبارات posthoc الضرورية لفحص الاختلافات بين العوامل مع أكثر من 2 مستويات ، كما هو محدد في البرنامج النصي الترميز. في هذا المثال ، اجراء اختبارات Bonferroni posthoc لمقارنه أنواع مختلفه من المواد التعشيش.
ملاحظه: إذا فقط باستخدام ماده واحده التعشيش ، ثم لا تدمج عامل داخل الموضوعات. غير ان جمع البيانات في نقاط زمنيه متعددة يتضمن هذه التدابير المتكررة كما لو كانت مستويات عامل داخل الموضوع.
ملاحظه: في بعض الحالات ، قد يكون الفئران البرية عشرات الكمال ، التالي سوف تظهر تاثير السقف ، مما يؤدي إلى التوزيع غير العادي2. النظر في الاختبارات الاحصائيه المناسبة (مثل الاختبارات غير الحدودية مع التدابير البديلة للاتجاه المركزي والتشتت) ، وأساليب التطبيع ، أو النهج القوية (نمذجة الآثار المختلطة للتدابير المتكررة) عند تحليل البيانات.
Representative Results
يتم شرح النتائج من أربعه مواد التعشيش المختلفة المقدمة إلى النوع البري و APOE e4 الفئران علي النحو التالي. واستنادا إلى المعايير القائمة ، أظهرت المحكمة الجنائية الدولية اتفاقا قويا بين جميع المبرمجين الثلاثة لجميع مواد التعشيش الاربعه (ورقه ممزقه icc = 0.94 ؛ ساحة icc = 0.91 ؛ الفراش Icc = 0.87 ؛ تويست icc = 0.87) ؛ ولذلك ، تم حساب متوسط العشرات معا لخلق درجه واحده لكل المواد المقدمة. A 2 × 4 المختلطة ANOVA أسفرت عن تاثير رئيسي كبير من النمط الجيني ، F(1 ، 19) = 31.30 ، p < 0.01 ، كم2 = 0.62. عبر جميع المواد الاربعه المقدمة ، سجلت الفئران البرية اعلي علي جوده العش (3.18 ± 0.20) بالمقارنة مع الفئران APOE e4 (1.98 ± 0.16). الاضافه إلى ذلك ، حققت ANOVA مختلطة تاثير رئيسي كبير من المواد ، F(3 ، 57) = 57.48 ، p < 0.01 ، كم2 = 0.75. وأظهرت مقارنات الاقران مع تصحيح Bonferroni ان ورقه تمزيقه (4.11 ± 0.20) تم تصنيف اعلي بكثير (p < 0.05) في نوعيه من مربع (1.95 ± 0.21) ، والفراش (2.21 ± 0.21) ، أو تويست (1.94 ± 0.20) المواد ، مع عدم وجود الاختلافات ينظر بين مربع ، والفراش ، وتطور المواد (جميع p > 0.99). ولم يكن هناك تفاعل كبير بين النمط الجيني والمادة. وترد البيانات في الشكل 3.
وقد أثمرت تجارب أخرى من مختبرنا نتائج مماثله في النماذج المبكرة من مرض الزهايمر. علي سبيل المثال ، كما هو موضح في الشكل 4، 5.5-الشهر الماضي P301L rTg4510 (htau) الفئران بنيت أعشاش اسوا بكثير من الورق تمزيقه مقارنه مع نظرائهم النوع البري المتطابقة العمر31. المثل ، بنيت مزدوجة J20 (hAPP)/htau والفئران htau واحده الأعشاش الفقيرة من الورق تمزيقه مقارنه مع النوع البري ونظراءه CAMKIIa المروج فقط ، علي حد سواء في 3.5-و 7 أشهر من العمر32 (البيانات لم تظهر).
الشكل 3: تصنيف نوعيه الأعشاش المصنوعة من مواد مختلفه قدمت إلى النوع البري والفئران apoe e4. وأظهرت الآثار الرئيسية للنمط الجيني (* p < 0.01) ان الفئران البرية باستمرار بناء أعشاش أفضل مصنوعة من الورق الممزق ، والمربعات القطن الضغط ، وتطور ورقه ، والفراش الكوز لينه مقارنه مع الفئران APOE e4. وقد اظهر التاثير الرئيسي للمواد (* * p < 0.01) أيضا ان الأعشاش التي شيدت من الورق الممزق كانت مصنفه بجوده اعلي مقارنه بالمواد الثلاث الأخرى. وكانت الورقة الممزقة اعلي مقاييس الموثوقيه البينية التي قيمتها المحكمة الجنائية الدولية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أعشاش الورق المبشور التي بناها الفئران البرية و htau ، علي أو قباله المياه الزنك. (ا) الأعشاش التمثيلية التي شيدها الفئران البرية التي يبلغ عمرها 5.5 شهرا والفار htau ، علي السيطرة (صنبور) المياه أو المياه تستكمل مع 10 أجزاء لكل مليون الزنك (البيولوجية التي تورطت في مرض الزهايمر). وسجلت الأعشاش علي مقياس 1-5 باستخدام المعايير المحددة. من اليسار إلى اليمين: وايلد نوع + الزنك المياه (4.54 ± 0.52) ؛ wildtype + المياه التحكم (4.15 ± 0.80) ؛ htau + المياه السيطرة (3.08 ± 0.64) ؛ htau + الزنك المياه (2.46 ± 0.97). (ب) اظهر تفاعل المياه بالنمط الجيني ان فئران htau علي مياه الزنك قد شيدت أعشاشا اسوا بكثير مقارنه بالمجموعات الأخرى (*) ؛ الاضافه إلى ذلك ، أظهرت اثار بسيطه ان الفئران htau علي الزنك المياه بنيت أعشاش اسوا من الفئران htau علي المياه السيطرة. الفئران البرية علي المياه السيطرة والزنك التي بنيت أعشاش المياه من اعلي ، ونوعيه مماثله ، مقارنه مع نظرائهم htau. طبع من مجلة مرض الزهايمر, المجلد 64, كريفن, كم, Kochen WR, هيرنانديز CM, Flinn JM, الزنك يفاقم علم الامراض تاو في نموذج الماوس تاو, 671-630, حقوق الطبع والنشر (2018), مع اذن من دائره الرقابة النظام الصحافة31. المنشور متوفر في IOS Press من خلال http://dx.doi.org/10.3233/JAD-180151. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: ملف الترميز التكميلي-التعشيش. R الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: نتائج الدراسة AD التعشيش. csv الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
التعشيش هو سلوك قوارض مهم تطوريا وقد استخدم لتقييم نشاط الحياة اليومية والرفاه العام في الفئران2. سهوله اجراء الاختبار ، موثوقيته ، وصلاحيته الوجه تجعل التعشيش تكمله عمليه للعديد من الاختبارات السلوكية مثل التجشؤ ، وإيقاع الايقاعيه ، والاستمالة. ولكن ، كما يصبح التعشيش أكثر شيوعا في المختبر ، وتركيبات مختلفه لاجراء ، كمي ، وتفسير زيادة التعشيش. علي هذا النحو ، هناك حاجه إلى مزيد من البحوث لاستكشاف أفضل الإجراءات السليمة منهجيا وعمليا للتداخل ، بحيث لا يتم التضحية بصحة وموثوقيه الفحص للتكاليف ، ووقت الاختبار ، وغيرها من الإجراءات التي تقلل من عبء الاختبار .
العش نوعيه المبني هو في الواقع حساسة لنوع من الفراش المقدمة ، فضلا عن النمط الجيني. عموما ، بنيت الفئران البرية أفضل بكثير الأعشاش بالمقارنة مع الفئران APOE e4 بغض المهم عن المواد التعشيش. ومع ذلك ، فان كلا من الأنواع البرية وفئران APOE e4 بناء أعشاش عاليه الجودة بشكل ملحوظ من الورق الممزق مقارنه بالمواد الثلاث الأخرى التعشيش. وتقدم دراسات أخرى أدله داعمه فيما يتعلق بالورقة الممزقة: الفئران شيدت أعشاش أكثر تعقيدا من شرائط الورق تمزيقه من المربعات القطنية الضغط ، والانسجه ، والفراش اسبن33. وعلاوة علي ذلك ، تم تقييم الأعشاش التي شيدت من شرائط الورق الممزقة نوعيا باعتبارها أكثر "طبيعيه" من تلك المصنوعة من مواد أخرى ، والتي تتميز بشكل العش نفسه وارتفاع الجدران حول تجويف العش في من أجل تشكيل قبة6،33. علي هذا النحو ، اختيار المواد المناسبة لهذا الفحص أمر بالغ الاهميه من أجل مراقبه أفضل للسلوك الطبيعي في بيئة تسيطر عليها نسبيا ، اي اعداد المختبر. والاهم من ذلك ، علي الرغم من ان هذا البروتوكول يقيم التعشيش مره واحده في 9-12 شهرا من العمر ، ونحن نشدد علي ان التعشيش ينبغي ان تجري في عده سنين. بساطه هذا البروتوكول يسمح لها ان تجري عده مرات ، من الناحية المثالية قبل بداية العجز التي تصاحب الضمور العصبي. القياسات المتكررة تحمل الفرصة لتوثيق الدور المسبب المحتمل لتنكس الأعصاب في انخفاض قدره التعشيش.
وقد تبين ان بناء عش الطبيعية تختلف بين الفئران من سلالات خلفيه مختلفه34، وعلي هذا النحو ، فان الجودة الشاملة وشكل العش قد تختلف لا بسبب الجينات من الفائدة ، ولكن نظرا لسلاله الخلفية. علي سبيل المثال ، كانت تعتبر أسلاف الفئران C57BL/6 "ثقب" نيسرز ، في حين ان أسلاف BALB/C الفئران كانت تعتبر "سطح" نيسرز35. الفئران علي الخلفية C3H أو الصلبان مع هذه السلالة ، مثل الهجين C3H/He-C57BL/6 مع E4 المستخدمة في غرابيال وآخرون9 وتعتبر أيضا ان يكون الفقراء نيسرز ؛ التالي ، ينبغي علي الباحثين بشده النظر في استخدام الفئران التحكم علي نفس الخلفية مثل الفئران المحورة وراثيا ، والتي من شانها ان تحسن عموما الدور المباشر ، المسبب للجينات (ق) ، بدلا من الخلفية ، في الضمور العصبي والعجز اللاحقة في عش بناء السلوك.
بعض التجارب غالبا ما تستخدم هداف واحد للحكم نوعيا علي تعقيد العش. ومع ذلك ، فاننا جعل حجه لتشمل المزيد من الهدافين ، والاهم من ذلك ، الهدافين اعمي للظروف التجريبية. ومن خلال هذا النهج ، استخدمنا ثلاثه هدافين مستقلين ومكفوفين وعلاقة داخلية لتقييم الاتفاق بين الهدافين ، الذين حققوا ، بالتدريب الأساسي ، ارتباطات عاليه داخل الشركات كانت مؤشرا علي موثوقيه عاليه فيما بين البلدان واتفاق قوي بشان نوعيه العش. وعلاوة علي ذلك ، كانت عشرات الأعشاش المكونة من الورق الممزق ومربعات القطن اعلي الارتباطات داخل المرساة ، مما يدل علي اتفاق اقوي واتساق أكبر بين الهدافين. ويوفر الاتفاق القوي أيضا مبررا لمتوسط النقاط المتعددة معا ، وهي استراتيجية عشوائيا تنفيذها في البحوث السلوكية. علي الرغم من ان هذه الاستراتيجية تتطلب المزيد من الافراد ، ويفترض ان المزيد من الوقت لتسجيل الأعشاش ، فانه يقلل بشكل فعال من التحيز في التقييمات النوعية مثل التعشيش.
وكانت المواد التعشيش المستخدمة في هذا الفحص متساوية تقريبا في السعر باستثناء الفراش الكوز الناعمة. الاسره التجارية لتعشيش قد تكون الحيلة اقتصاديا لبعض المجربين. ومع ذلك, مارتن وآخرون15 لاحظ ان مربعات القطن, بالمقارنة مع غيرها من المواد مثل الورق مجعد, هي واحده من اغلي المواد المتاحة للشراء. قد يكون هذا بسبب سهوله التوافر ، والتخزين ، والاداره ، ولكن الباحثين الآخرين قد تختار لمواد صالحه وموثوق بها بالمثل ، وخاصه عندما تحدها اعداد كبيره من الماشية في منشاه ، وعدد من التجارب التعشيش ، والقيود الزمنيه تسجيل الأعشاش ، وارتفاع تكاليف القفص. التالي ، قد تكون الورقة الممزقة خيارا أكثر جدوى وملاءمة. الاضافه إلى ذلك ، يمكن اجراء التقاط البيانات لطريقنا علي الفور (اي تسجيل النقاط شخصيا) ، علي الرغم من انه ينبغي النظر إلى الصور بشكل كبير من أجل تسجيل الأعشاش وحفظها وأعاده قياسها ، إذا رغبت في ذلك لأغراض تقييم ما بين الأسر وداخلها موثوقيه في أوقات لاحقه. وكما ذكرنا ، نشدد بقوة علي ادراج الهدافين المتعددين في ممارسات "الاختبار وأعاده الاختبار" لتقييم الاتفاق ، لان هذه الإجراءات السليمة منهجيا كثيرا ما تغفل.
وفي الختام ، نعتقد ان المنهجية والاعتبارات الاحصائيه (اي الارتباط داخل الرابطة) لهذا الفحص قد تكون ذات فائده للتجارب التي تقيم نوعيه المعيشة والرفاه العام وأنشطه الحياة اليومية في الفئران.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
نود ان نشكر كيفن كوانت ، ماريو مارتينيز ، وايدوين بورتيلو لتسجيل الأعشاش ، راشيل Barkey للمساعدة في التحضير للتصوير ، و ستيفن ليبي و ديبورا نيلي لتصحيح هذه المخطوطة. ونود أيضا ان نشكر أداره علم النفس علي تغطيه تكاليف أقفاص لهذه التجربة ، ومرفق الحيوانية معهد كراسالان الرعاة لدعمهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corncob bedding | Envigo | 7092 | 1/8 in bedding for cotton squares, shredded paper, and paper twist trials |
| Cotton Squares | Envigo | Iso-Blox | |
| Diamond Twists | Envigo | 7979C.CS | Paper twists used in protocol |
| Mouse - APOE4 e4 | Jackson Laboratories | #012307 | Homozygous APEO4 e4 mouse bred with hemizyous J20 mouse |
| Mouse - C57BL/6J | Jackson Laboratories | #000664 | Wildtype mouse for controls |
| Mouse - J20 | Jackson Laboratories | #006293 | Hemizygous mouse bred with the homozygous APOE e4 mouse to generate cross |
| Rstudio | R Core Team | V1.1.463 | Run with R version 3.5.3 (2019-03-11) -- "Great Truth". Note: additional R Packages are included in provided code and can be installed from CRAN |
| Soft Cob | Envigo | 7087C |
References
- Torres-Lista, V., Gimenez-Llorta, L. Impairment of nesting behavior in 3cTg-AD mice. Behavioural Brain Research. 247, 153-157 (2013).
- Deacon, R.
- Hess, E., Petrovich, S., Goodwin, E. Induction of Parental Behavior in Japanese Quail. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 90 (3), 244-251 (1976).
- Deacon, R. Hippocampal cytotoxic lesion effects on species-typical behaviors in mice. Behavioural Brain Research. 132, 203-213 (2002).
- Deacon, R. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139, 139-155 (2003).
- Gaskill, B. N., Karas, A. Z., Garner, J. P., Pritchett-Corning, K. R. Nest building as an indicator of health and welfare in laboratory mice. Journal of Visualized Experiments. (82), 51012 (2013).
- Mayeux, R., Stern, Y.
- Boggs, K. N., Kakalec, P. A., Smith, M. L., Howell, S. N., Flinn, J. M. Circadian wheel running behavior is altered in an APP/E4 mouse model of late onset Alzheimer's disease. Physiology and Behavior. 182, 137-142 (2017).
- Graybeal, J. J., et al. Human ApoE ε4 alters circadian rhythm activity, IL-1β, and GFAP in CRND8 mice. Journal of Alzheimer's Disease. 43 (3), 823-834 (2015).
- Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
- Zhou, L., Gao, Q., Nie, M., Gu, J. L., Hao, W., Wang, L., Cao, J. M. Degeneration and energy shortage in the suprachiasmatic nucleus underlie the circadian rhythm disturbance in ApoE-/- mice: Implications for Alzheimer's disease. Scientific Reports. 6, 36335 (2016).
- Deacon, R., et al. Age-dependent and -independent behavioral deficits in Tg2576 mice. Behavioural Brain Research. 189, 126-138 (2008).
- Filali, M., Lalonde, R., Riverst, S. Cognitive and non-cognitive behaviors in an APPswe/PS1 begenic model of Alzheimer's disease. Genes, Brain and Behavior. 8, 143-148 (2009).
- Robinson-Junker, A., Morin, A., Protchett-Corning, K., Gaskill, B. Sorting it out: Bedding particle size and nesting material processing method affects nest complexity. Laboratory Animals. 51 (2), 170-180 (2017).
- Martin, T., Balser, S., Young, G., Lewis, S. Cost and effectiveness of commercially available nesting substrates for Deer Mice (Peromyscus maniculatus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (4), 412-418 (2016).
- Crossland, J. P., et al. Caring for Peromyscus spp. in research environments. Lab Animal. 43 (5), 162-166 (2014).
- Eisenberg, J. Studies on the Behavior of Peromyscus maniculatus gambelii and Peromyscus californicus parasiticus. Behaviour. 19 (3), 177-207 (1962).
- Joyner, C. P., Myrick, L. C., Crossland, J. P., Dawson, W. D. Deer mice as laboratory animals. ILAR Journal. 39 (4), 322-330 (1998).
- Neely, C., Lane, C., Torres, J., Flinn, J. The Effect of gentle handling on depressive-like behavior in adult male mice: Considerations for human and rodent interactions in the laboratory. Behavioural Neurology. , 2976014 (2018).
- Van Loo, P. L., Mol, J. A., Koolhaas, J. M., Van Zutphen, B. F., Baumans, V. Modulation of aggression in male mice: Influence of group size and cage size. Physiology & Behavior. 72 (5), 675-683 (2001).
- Kappel, S., Hawkins, P., Mendl, M. T. To group or not to group? Good practice for housing male laboratory mice. Animals. 7 (12), 88 (2017).
- Gamer, M., Lemon, J., Fellows, I., Singh, P. Irr: Various coefficients of interrater reliability and agreement. R package version 0.84. , Available from: http://CRAN.R-project.org/package=irr (2012).
- RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. , Boston, MA. Available from: http://www.rstudio.com/ (2016).
- Cicchetti, D. V. Guidelines, criteria, and rules of thumb for evaluating normed and standardized assessment instruments in psychology. Psychological Assessment. 6 (4), 284-290 (1994).
- Hallgren, K. A. Computing inter-rater reliability for observational data: An overview and tutorial. Tutorials in Quantitative Methods for Psychology. 8 (1), 23-34 (2012).
- McGraw, K. O., Wong, S. P. Forming inferences about some intraclass correlation coefficients. Psychological Methods. 1 (1), 30-46 (1996).
- Ahlmann-Eltze, C. ggsignif: Significance Brackets for 'ggplot2'. R package version 0.5.0. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggsignif (2019).
- Lawrence, M. A. ez: Easy Analysis and Visualization of Factorial Experiments. R package version 4.4-0. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ez (2016).
- Lenth, R. V. Least-Squares Means: The R Package lsmeans. Journal of Statistical Software. 69 (1), 1-33 (2016).
- Wickham, H. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
- Craven, K. M., Kochen, W. R., Hernandez, C. M., Flinn, J. M. Zinc exacerbates tau pathology in a tau mouse model. Journal of Alzheimer's Disease. 64, 617-630 (2018).
- Lippi, S. L., Smith, M. L., Flinn, J. M. A novel hAPP/htau mouse model of Alzheimer's Disease: Inclusion of APP with tau exacerbates behavioral deficits and zinc administration heightens tangle pathology. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 382 (2018).
- Hess, S. E., et al. Home improvement: C57BL/6J mice given more naturalistic nesting materials build better nests. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 47 (6), 25-31 (2008).
- Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
- Van Oortmerssen, G. Biological significance, genetics and evolutionary origin of variability in behaviour within and between strains of mice (Mus musculus). A behavior genetic study. Behaviour. 38 (1), 1-92 (1971).
