Summary
يصف هذا البروتوكول التجارب الميكروبية تحت ضغوط مرتفعه للدراسة في عمليات البيولوجيا الموضعية. ويستخدم النهج التجريبي مفاعلا هزازا عالي الضغط مزودا بخليه تفاعل من الذهب والتيتانيوم تحتوي علي ثقافة جرثوميه في وسط حمضي غني بالحديد.
Abstract
وتتقاسم الدراسات المختبرية التي تحقق في العمليات الميكروبية تحت السطحية ، مثل النض المعدني في رواسب الخامات العميقة (الإحيائي) ، عقبات مشتركه وصعبه ، بما في ذلك الظروف البيئية الخاصة التي يلزم تكرارها ، مثل الضغط العالي وفي بعض الحالات الحلول الحمضية. الاولي يتطلب الاعداد التجريبية مناسبه للضغط تصل إلى 100 بار ، في حين ان هذا الأخير يتطلب حاويه السوائل مع مقاومه كيميائية عاليه ضد التاكل والتفاعلات الكيميائية غير المرغوب فيها مع جدار الحاوية. لتلبيه هذه الشروط لتطبيق في مجال الحيوية في الموقع ، استخدمت في هذه الدراسة خليه مرنه خاصه للرد علي الذهب والتيتانيوم داخل مفاعل هزاز عالي الضغط. وقد سمح النظام الموصوف بمحاكاة البيولوجيا الاحيائيه في الموقع من خلال الحد من الحديد الميكروبي الذي يحركه الكبريت في بيئة تجريبية غير سامه وخاضعه للضغط وخاملة كيميائيا للغاية. يمكن ان تستوعب خليه رد الفعل المرنة من الذهب والتيتانيوم ما يصل إلى 100 مل من محلول العينة ، والتي يمكن أخذ عينات في اي نقطه زمنيه معينه بينما يحافظ النظام علي الضغط المطلوب. ويمكن اجراء التجارب علي الجداول الزمنيه التي تتراوح بين ساعات وأشهر. تجميع نظام مفاعل الضغط العالي مضيعه للوقت إلى حد ما. ومع ذلك ، عندما العمليات المعقدة والصعبة (الميكروبيولوجية) التي تحدث في أعماق الأرض تحت سطح التربة في السوائل العدوانية كيميائيا يجب التحقيق في المختبر ، مزايا هذا النظام تفوق مساوئ. ووجدت النتائج انه حتى عند الضغط العالي فان اتحاد الميكروبات نشط ، ولكن بمعدلات ايضيه اقل بكثير.
Introduction
وخلال العقد الماضي ، ازدادت الجهود الرامية إلى التقليل إلى ادني حد من اثر التعدين علي البيئة. التعدين حفره مفتوحة لاستخراج المواد الخام من الخامات (علي سبيل المثال ، خامات كبريتيد النحاس الغنية) ، يؤثر علي المناظر الطبيعية المحيطة بها من قبل أنشطه الحفر والاحجام الكبيرة المتبقية من الصخور النفايات وبقايا الخام المصنعة بعد استخراج الثمينة المعادن مثل النحاس. ومن شان استخراج النحاس مباشره من الخام في باطن السطح ان يقلل كثيرا من هذه الآثار. وتكنولوجيا البيولوجيا في الموقع هي مرشح واعد لهذه العملية1. يصف هذا المنشور استخدام النشاط الميكروبي المحفز لاستخراج المعادن النفيسة من الخام إلى محلول مائي في باطن السطح. التالي ، يمكن ضخ حل غني بالنحاس بسهوله مره أخرى إلى السطح لزيادة تركيز المعدن ، علي سبيل المثال.
وقد درس نشاط الكائنات الدقيقة اسيدوفيليك الرشح الخام في العديد من المختبرات لمجموعه متنوعة من المعلمات2,3,4,5,6. ومع ذلك ، اثار الضغط علي النشاط الميكروبي الناجمة عن الفرق بين الظروف مختبر السطح المحيط (بالقرب من 1 بار) وتحت سطح الأرض علي عمق 1,000 م مع الظروف الهيدروستاتيكي (~ 100 بار) ، ليست موثقه توثيقا جيدا. ولذلك ، تم التحقيق في اثار الضغط علي التقليل من الحديد الميكروبي من خلال مختلف الطرق التجريبية7. هنا ، يتم وصف التقنية الأكثر ملاءمة بالتفصيل.
وقد استخدمت مفاعلات الضغط العالي علي نطاق واسع لدراسة ردود الفعل علي الضغوط ودرجات الحرارة التي تحدث في باطن الأرض. وتتكون هذه المفاعلات من سفينة مفاعل في القاع يمكن ان تحتوي علي عينه سائله ذات ثقافة جرثوميه. ويوفر راس المفاعل ، الذي يجلس فوق سفينة المفاعل ، مجموعه متنوعة من الوصلات والواجات لتدابير السلامة وأجهزه استشعار الرصد (مثل درجه الحرارة أو الضغط). معظم المفاعلات عاليه الضغط مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدا. هذه المواد توفر مرونة عاليه وخصائص آلات جيده ، ولكن مقاومه التاكل من سطح الفولاذ المقاوم للصدا ليست كافيه لكل تطبيق. علي سبيل المثال ، إذا تم التحقيق في المحاليل المائية الحمضية أو الشديدة الانخفاض ، قد تحدث ردود فعل هامه للمركبات ذات الاهتمام بجدار المفاعل. طريقه واحده لتجنب هذا هو ادراج بطانة في سفينة المفاعل ، علي سبيل المثال بطانة مصنوعة من زجاج بوروسيليكات7. فمن السهل لتنظيف ويمكن تعقيمها عن طريق التعقيم. الاضافه إلى ذلك ، فانه لا يهاجم من قبل الحمضية أو الحد من المحاليل المائية. علي الرغم من ان بطانة يمكن ان تساعد علي منع التفاعلات الاصطناعية للحل أو الميكروبات في الحل مع جدار المفاعل الفولاذ المقاوم للصدا ، لا تزال هناك عده مشاكل. لأحد ، إذا تم تشكيل غاز التاكل ، مثل كبريتيد الهيدروجين التي تنتجها البكتيريا التي تقلل من كبريتات ، وهذا الغاز قد تتفاعل مع السطح المكشوف لراس المفاعل يجلس فوق البطانة. والعيب الآخر هو انه ليس من الممكن سحب عينه من المفاعل مع الحفاظ علي الضغط.
للتغلب علي هذه القيود ، تم تطوير خلايا التفاعل المرنة المتخصصة داخل مفاعلات الضغط العالي لمجموعه متنوعة من التطبيقات. تم تصميم خليه تترافلوروايثيلين مرنه (PTFE)8 لدراسات الذوبان في الأملاح في المحاليل الملحية عاليه الملوحة. ومع ذلك ، فان الحد من هذا النظام هو ان بعض الغازات يمكن ان تتخلل بسهوله PTFE. الاضافه إلى ذلك ، لا تزال هذه المواد لديها استقرار درجه حرارة منخفضه نسبيا. وهكذا ، تم تحسين النظام عن طريق تصميم حقيبة ذهبيه مرنه مع رئيس التيتانيوم9 لوضعها داخل مفاعل الفولاذ المقاوم للصدا عاليه الضغط. سطح الذهب هو مقاومه للتاكل ضد الحمضية أو الحد من الحلول والغازات. سطح التيتانيوم هو أيضا خاملة للغاية عندما تخفته تماما لتشكيل طبقه ثاني أكسيد التيتانيوم المستمر. اثناء أخذ العينات من هذه الخلية رد الفعل من خلال أنبوب أخذ العينات التيتانيوم متصلة ، يتقلص كيس الذهب في الحجم. يتم الحفاظ علي الضغط الداخلي للنظام عن طريق ضخ نفس الحجم من الماء ، كما يتم سحبها عن طريق أخذ العينات ، في مفاعل الفولاذ المقاوم للصدا عاليه الضغط استيعاب خليه رد الفعل. يتم الاحتفاظ بالعينة داخل خليه رد الفعل في الحركة عن طريق هزاز أو أماله مفاعل الضغط العالي بأكثر من 90 درجه خلال التجربة.
تتكون خليه رد الفعل من الأجزاء المبينة في الشكل 1: الحقيبة الذهبية ، طوق التيتانيوم ، راس التيتانيوم ، غسالة الفولاذ المقاوم للصدا ، حلقه ضغط التيتانيوم الترباس ، أنبوب أخذ العينات التيتانيوم مع الغدد المقاوم للصدا والياقات لضغط عاليه اتصالات مترابطة علي كلا الجانبين ، وصمام التيتانيوم. الحقيبة الذهبية هي الذهب أسطواني (Au 99.99) الخلية مع سمك الجدار من 0.2 ملم ، والقطر الخارجي من 48 ملم ، وطول 120 ملم.
جميع أجزاء التيتانيوم مصنوعة خصيصا من قبل ورشه عمل من قضبان التيتانيوم الصف 2. ابعاد طوق ، الراس ، غسالة ، وضغط حلقه الترباس مرئية في الشكل 2. أنبوب أخذ العينات التيتانيوم هو الشعرية من التيتانيوم مع القطر الخارجي من 6.25 ملم وسمك الجدار من 1.8 مم ، مما ادي إلى القطر الداخلي من 2.65 ملم. وهو ثابت في الراس التيتانيوم وصمام التيتانيوم بواسطة الضغط العالي coned والوصلات المترابطة ضمان ختم التيتانيوم مقابل التيتانيوم السطوح. وقد تم تجهيز صمام التيتانيوم عاليه الضغط مع جذع فتح بطيئه للسماح لفتح السيطرة جدا أو أخذ العينات حتى في الضغط العالي. استعملت هذا نظامه كان في يتعدد دراسات10,11,12.
Protocol
1. اعداد المتوسطة وتلقيح الثقافة الميكروبية
- اعداد متوسط الملح القاعدي لتغذي النواة وفقا للتقنيات المنشورة13. تذوب وتخلط المواد الكيميائية أدناه في الماء المقطر (مغ/لتر): Na2حتى4· 10h2س (150) (NH4)2حتى4 (450) ، kcl (50) ، MGSO4· 7h2O (500) ، KH2PO4 (50) ، و Ca (لا 3) 2· 4h2O (7).
- أضافه 1 مل/لتر من 1 ، 000x المركزة عنصر تتبع الحل التي تحتوي علي (g/L): ZnSO4· 7h2س (10) ، cuso4· 5h2o (1) ، mnso4· ح2س (0.76) ، زو4· 7h2o (1) ، crk (حتى4)2· 12h2o (0.4) ، H3BO3 (0.6) ، namoo4· 2h2o (0.5) ، niso4· 6h2o (1) ، Na 2 SeO4 (0.51) ، Na2WO4· 2h2O (0.1) ، و navo3 (0.1). ضبط درجه الحموضة إلى 1.8 باضافه حمض الكبريتيك 5 M.
- تعقيم المتوسطة في الاوتوكلاف في 121 درجه مئوية و 1.2 بار لمده 20 دقيقه وتعقيم محلول الحديد الحديديك عن طريق الترشيح من خلال فلتر المسام 0.22 μm حجم الحقنه.
- نقل 50 مل من متوسط الملح القاعدي تعقيمها في زجاجه المصل وأضافه محلول الحديد الحديديك والكبريت عنصري للتركيز النهائي من 50 mM و 10 g/L ، علي التوالي.
- تطعيم الوسط مع ثقافة مختلطة تتالف من العديد من ميسواسيدوفيليك الحديد-المؤكسدة النواة14.
- غطاء زجاجه المصل مع السدادات المطاطية بوتيل المعقمة وختم مع تجعيد ألمنيوم.
- فقاعه بقوة الوسط الثقافة مع N2 لتجريد الأكسجين المذاب لمده 25 دقيقه. استخدام اثنين من الابر ، ووضع واحد أعمق في راس زجاجه ، والاخر علي مقربه من الغطاء.
- حقن co2 للحصول علي 90 ٪ ن2 و 10 ٪ co2 الغلاف الجوي في فراغ من زجاجه المصل. احتضان الثقافة دون أثاره في 30 درجه مئوية في الظلام.
2-اعداد خليه التفاعل بين الذهب والتيتانيوم ومفاعل الضغط العالي
- تنظيف خليه رد فعل الذهب والتيتانيوم.
- تفكيك خليه رد الفعل في أجزاء الفردية لتجنب الاتصال من حمض مع أجزاء الفولاذ المقاوم للصدا ، أو التعرض للأجزاء المجمعة مع خصائص التمدد الحراري مختلفه للحرارة.
- نظف الأسطح التي ستكون علي اتصال مع العينة اثناء التجربة (اي الحقيبة الذهبية وراس التيتانيوم وأنبوب أخذ عينات التيتانيوم وصمام التيتانيوم).
- ضع الحقيبة الذهبية وراس التيتانيوم في كوب زجاجي.
- أضافه ما يكفي من 10 ٪ HCl لتغطيه جميع الأجزاء.
- سخني الحمض علي صفيحه تسخين إلى 50 درجه مئوية لمده 3 ساعات اثناء تحريكه.
- أزاله الأجزاء مع ملاقط PTFE من محلول حمض وشطفها بالماء منزوع الأيونات.
- شطف السطح الداخلي للكيس الذهب وراس التيتانيوم جيدا مع 65 ٪ HNO3 ومن ثم مع الماء منزوع الأيونات.
- شطف السطح الداخلي لأنبوب أخذ العينات التيتانيوم وصمام التيتانيوم مع 10 ٪ حمض الهيدروكلوريك ، تليها المياه منزوعة الأيونات ، 65 ٪ HNO3، ومن ثم منزوع الأيونات الماء مره أخرى.
- نظف جميع الأجزاء من التلوث العضوي عن طريق شطفها بالأسيتون.
- جففي جميع الأجزاء في الفرن عند 105 درجه مئوية لمده 1 ساعة علي الأقل.
- تسخين أسطح الحقيبة الذهبية ، وراس التيتانيوم ، وأنبوب أخذ العينات من التيتانيوم من خلال تعريضها لدرجه حرارة 450 درجه مئوية لمده 4 ساعات في فرن معثر في جو جوي.
ملاحظه: هذا الاجراء تعقيم الأسطح والنتائج في تشكيل طبقه من ثاني أكسيد التيتانيوم التخريله علي جميع أسطح التيتانيوم. يجب ان يكون لأجزاء التيتانيوم اللون الأصفر إلى الأزرق بعد المعالجة الحرارية. - اننيل الخلية الذهبية لزيادة مرونة الذهب عن طريق أعاده تعيين مجالات تبلور صغيره عن طريق تطبيق الحرارة مع الشعلة البروبان. تسخين سطح الذهب في جميع انحاء للحد من مكامن في الذهب التي قد تشكلت خلال الانكماش الأخير من حجم حقيبة الذهب في تجربه. تاكد من عدم تسخين الذهب كثيرا في مكان واحد لتجنب ذوبانه.
ملاحظه: توهج احمر من سطح الذهب يظهر التدفئة كافيه. - تجميع الحقيبة الذهبية في طوق التيتانيوم ، وأنابيب التيتانيوم أخذ العينات في الراس التيتانيوم باستخدام عزم الدوران من 10 نانومتر للغده.
- افحص مفاعل الضغط العالي
- فحص بصريا المفاعل للاضرار المحتملة ، والتاكل ، وأجزاء فضفاضة.
ملاحظه: ينبغي إيلاء اهتمام خاص لختم والرصيف حيث يحدث الختم. إذا كانت طوقا الجرافيت المستخدمة سابقا لختم المفاعل ، بقايا منه قد لا تزال في شق وينبغي ازالتها مع دبوس من البلاستيك قبل التجربة القادمة. - تطبيق معجون كبريتيد النحاس علي البراغي الفحوى في راس مفاعل الضغط العالي. تاكد من توزيع الشحوم علي الخيط بأكمله.
- تحقق من ختم ضغط المسمار المناسب لطول التعبئة الجرافيت المتبقية.
- فحص بصريا المفاعل للاضرار المحتملة ، والتاكل ، وأجزاء فضفاضة.
3. تعبئة وتجميع خليه رد فعل الذهب والتيتانيوم في ظل ظروف الاكسده
- تحميل صندوق القفازات.
- اعداد الثقافة المتوسطة في زجاجات المصل وفقا للقسم 1.
- التفاف أجزاء من خليه رد الفعل goldtitanium التي ستكون في وقت لاحق علي اتصال مع العينة في رقائق ألومنيوم للتقليل من اي تلوث محتمل.
- فتح وإطلاق العنان لغرفه انتظار من صندوق القفازات ، وتحميل جميع المواد الواردة إلى صينية المنقولة ، وإغلاق وقفل الغطاء الامامي.
- اخلاء غرفه انتظار 3x والفيضانات مع النيتروجين عاليه النقاء.
- ارتداء زوج من القفازات والحصول علي أقرب ما يمكن إلى الغطاء الداخلي. افتح الغطاء الداخلي وافتحه لأزاله المواد الواردة من الدرج المنقول.
- إغلاق وقفل الغطاء الداخلي.
- أملا الخلية الذهبية
- فك حقيبة الذهب النظيفة والوقوف عليه مع كوب زجاجي ، علي سبيل المثال. فتح زجاجه المصل التي تحتوي علي 100 مل من الثقافة البكتيرية والكبريت العنصري.
- هز زجاجه المصل برفق وانقل الثقافة البكتيرية إلى الحقيبة الذهبية.
- تجميع خليه رد الفعل.
- ادخل راس التيتانيوم مع أنبوب أخذ العينات التيتانيوم المرفقة في طوق التيتانيوم أحاطه الحافة العلوية من الحقيبة الذهبية.
ملاحظه: تاكد من ان سطح الختم من الجزء السفلي المخروطي من راس التيتانيوم يناسب بسلاسة عن طريق تحويله 90 ° ذهابا وإيابا. - حرك الغسالة وحلقه الترباس الضاغطة فوق أنبوب أخذ عينات التيتانيوم علي راس التيتانيوم.
ملاحظه: تحويل حلقه الترباس ضغط في طوق التيتانيوم بواسطة 30 درجه لمحاذاة الشفاه من طوق التيتانيوم وخاتم الترباس التوجه. - ربط مسامير الين سته إلى حد نفسه لضمان توزيع الضغط حتى من راس التيتانيوم علي الحافة العلوية من الحقيبة الذهبية في طوق التيتانيوم (اي سطح الختم من خليه رد الفعل).
ملاحظه: ربط مسامير الين في حلقه ضغط الترباس حتى ضيق اليد بحيث يتم زيادة عزم الدوران لمسامير المعاكس أولا (طولا) قبل الاستمرار في اتجاه عقارب الدقيقة.
- ادخل راس التيتانيوم مع أنبوب أخذ العينات التيتانيوم المرفقة في طوق التيتانيوم أحاطه الحافة العلوية من الحقيبة الذهبية.
- أعاده تثبيت صمام أخذ العينات في الأعلى من أنبوب التيتانيوم. ربط الاتصال اليد--ضيق وتاكد من إغلاق صمام.
- أزاله جميع أجزاء من صندوق القفازات.
4. تجميع مفاعل الضغط العالي مع خليه رد الفعل
- تجميع خليه رد الفعل في راس المفاعل.
ملاحظه: تركيب مفاعل الضغط العالي ياتي مع التعرض قصيرة جدا من نهاية مفتوحة لأنبوب أخذ العينات إلى الغلاف الجوي المحيط بها ، كما يجب أزاله صمام أخذ العينات لتوجيه الأنبوب من خلال ختم المسمار في راس المفاعل. للتثبيت ، يجب ان يكون راس المفاعل بالفعل وضعت في ملزمه مقاعد البدلاء. زاوية 45 درجه تسمح بسهوله المناولة. تركيب ختم ضغط (تقع في الموقع المركزي للجمعية كتله سبر الراس المفاعل) ، الذي يحمل أنبوب أخذ العينات في مكانها ، يجب ان تكون مفتوحة.- أزاله صمام أخذ العينات التيتانيوم ، والمسمار ، وطوق علي راس أنبوب أخذ العينات.
- توجيه الأنبوب مع خليه رد الفعل المرفقة من خلال ثقب مركزي في راس المفاعل حتى حوالي 5 سم من الأنبوب يمر من خلال. حرك المسمار الكبير فوق الأنبوب واربط الطوق الصغير.
ملاحظه: الآن التجمع خليه رد الفعل لا يمكن الانزلاق مره أخرى من خلال رئيس المفاعل وكلتا اليدين أحرار لأعاده تثبيت صمام أخذ العينات. - أعاده تركيب صمام التيتانيوم.
- تشديد تركيب ختم الضغط.
- قم بازاله راس المفاعل من المقعد الملزم لتثبيته علي وعاء المفاعل.
- استعد لإغلاق المفاعل
- وضع ختم الجرافيت علي الرصيف من سفينة المفاعل.
- ضع بعناية راس المفاعل مع خليه رد الفعل المرفقة علي سفينة المفاعل.
ملاحظه: يجب وضع راس المفاعل ، بما في ذلك الحرارية ، بعناية علي سفينة المفاعل لعدم اتلاف الحقيبة الذهبية أو الحرارية.
- ملء سفينة المفاعل مع خليط من منزوع الأيونات وماء الصنبور (تقريبا في نسبه 1:1).
- اغلق المفاعل
- تحقق من طوق للتاكد من ان الأطراف السفلية من البراغي ضغط لا تخرج من المواضيع الخاصة بهم. والا ، لن يتم تثبيت وعاء الضغط بشكل صحيح.
- رفع طوق ووضعه حول حواف جاحظ من واجهه المفاعل headvessel. نقل بلطف طوق علي انه سيؤدي إلى نوبة مناسبه. إغلاق اقفال المفاجئة عقد طوق في المكان.
- اربط البراغي الضاغطة بعد نمط متقاطع وزد عزم الدوران بخطوات معتدله حتى يتم تحقيق القيمة النهائية الموصي بها من قبل الشركة المصنعة.
ملاحظه: قد يكون لأنظمه مفاعل الضغط العالي المختلفة قيم عزم دوران مختلفه. - وأخيرا ، ربط البراغي ضغط بطريقه في اتجاه عقارب العام.
- تثبيت مفاعل الضغط العالي في جهاز هزاز.
ملاحظه: يتم وصف تركيب مفاعل الضغط العالي في جهاز هزاز لنموذج مخصص صنعت في المعهد الاتحادي لعلوم الجيولوجيا والموارد الطبيعية في هانوفر ، ألمانيا. ولذلك ، فان التثبيت الموصوف هو مبدا توجيهي عام للاجهزه ذات التصميم القابل للمقارنة.- جبل المفاعل بعناية في جهاز هزاز.
ملاحظه: فمن الأفضل لعقد مفاعل الضغط العالي من قبل أجزاء الجمعية كتله سبر (علي سبيل المثال ، المقياس أو مسامير أنبوب أخذ العينات) في حين خفضه في جهاز هزاز. - Fixate المفاعل مع اثنين من المشابك علي زوج من مسامير طويلة.
- وضع غسالات علي كل برغي وتشديد المشابك مع المكسرات المسمار.
- ربط وحدات التحكم عن الحرارية ، ومحول الضغط ، وعنصر التسخين.
ملاحظه: من المهم التاكد من ان جميع الأسلاك هي من طول كاف للحركة هزاز ومنع الاتصال إلى الأسطح الساخنة. - حرك عنصر التسخين فوق وعاء المفاعل واحكم قفل المسمار.
ملاحظه: يتم أخذ الماء للضغط علي النظام من خزان مع مضخة الضغط العالي. يتم نقله من خلال الشعيرات الدموية الفولاذ المقاوم للصدا في مفاعل الضغط العالي.
ملاحظه: الهزاز من مفاعل الضغط العالي يضمن خلط شامل لمحتويات خليه رد الفعل (اي الغاز والسوائل ، وجميع المراحل الصلبة في ذلك). ومن المهم سرعه هزاز بطيئه لمنع الاضرار التي لحقت كيس الذهب عن طريق المواد الصلبة تتحرك بسرعة أو تشوه بسبب اثار الجاذبية علي الذهب المرن في درجات حرارة مرتفعه. يمكن للنظام هزاز تدوير بالقرب من 180 درجه مئوية.
- جبل المفاعل بعناية في جهاز هزاز.
5. بدء التجربة
- تحقق مما إذا تم تعيين حدود درجه الحرارة والضغط في برنامج الرصد إلى القيم المطلوبة.
ملاحظه: في هذه التجربة تم تعيينها إلى 70 درجه مئوية و 25 ميجا باسكال. - اجراء فحص تسرب.
- ربط أنبوب الضغط ، والفولاذ المقاوم للصدا الشعرية ، إلى راس المفاعل.
- رفع الضغط إلى الضغط المستهدف في فترات مختلفه مع التحقق باستمرار من التسرب.
- عقد ثابت الضغط حتى معدل تدفق المضخة هو الصفر تقريبا.
ملاحظه: حذار ان قابل للضغط ، والهواء المذاب في الماء مرئية لفتره طويلة في قراءات تدفق خفيه.
- بدء التسخين بعد التحقق من تسرب ناجحه.
- بدء تسجيل مضخات الضغط.
- ضبط نقطه مجموعه للتدفئة إلى القيمة المطلوبة وبدء التدفئة مع البرنامج.
- تحقق بانتظام من كافة المعلمات وحاله النظام.
- ترخي أنبوب الضغط بعد الوصول إلى درجه الحرارة المستهدفة.
- بدء تشغيل جهاز هزاز.
6. أخذ العينات مفاعل الضغط العالي في الوضع التشغيلي
- لأخذ عينه ، ارفق حقنه 5 مل إلى موصل Luer Lock من صمام أخذ العينات في الأعلى من مفاعل الضغط العالي.
- بعناية فتح صمام والسماح للعينه السائل دفع في حقنه بالضغط داخل مفاعل الضغط العالي. اغلق الصمام بعد ان يصل حجم العينة إلى 1 مل. افصل الحقنه
- نقل العينات في حقنه فورا إلى أنبوب 2 مل في غطاء الدخان للمعالجة.
7. تحليل عينه السوائل
ملاحظه: فقط الخطوات الخاصة بالفحص الفوتومتري الضوئي الأقل شيوعا (اي القسم 7.1) موصوفه هنا بالتفصيل والمذكورة في الفيديو ، لان الخطوات الأخرى هي إجراءات التشغيل القياسية في علم الاحياء المجهرية.
- استخدام فحص فيروزين لقياس التغيريه تحديد تركيز الحديد الحديدي المذاب (Fe2 +(aq)) والحديد الكلي (fetot)15.
- اعداد سلسله من الحديد الحديدية الحلول القياسية عن طريق تذويب كميات معروفه من فيسو4· 7 ح2س في الماء.
- مزيج 50 μL من هذه المستويات القياسية مع 1 مل من محلول فيروزين 1 م.
ملاحظه: يشكل رد فعل فيروزين مع الحديد الحديدي المذاب مجمعا أرجوانيا. كثافة اللون يرتبط بتركيز الحديد الحديدية. - إنشاء منحني معايره بين تركيز الحديد الحديدي والامتصاص للمجمع الحديدي-فيروزين.
- يحسب تركيز الحديد الحديدي للعينه من قياسين متوازيين وفقا للمنحني المعياري المعمول به.
- تحليل قيمه الأس الهيدروجيني والاكسده/الحد المحتملة (ORP) مع الرقمية pH/الاكسده متر مع أقطاب semimicro pH ، والكهربائي كلوريد الفضة ، علي التوالي.
- عد الخلايا المسوية مباشره باستخدام المجهر الضوئي مع غرفه Thoma.
- التحقيق في المورفولوجية الخلية عن طريق المسح المجهري الكترون (SEM).
- تصفيه الخلايا المسوية المزروعة في ظروف مختلفه من خلال فلتر حجم المسام 0.1 − 0.2 μm.
- عينات ديهيدرات مع الأسيتون وتخزينها بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية في 90 ٪ الأسيتون.
- جفف العينات بتجفيف النقطة الحرجة وادهنها بالجرافيت أو الذهب.
- دراسة العينات مع حقل المسح الضوئي المجهر الكترون (FE-SEM) في 10 kV.
Representative Results
تظهر نتائج تجربه مفاعل الضغط العالي مع خليه رد الفعل الخاصة بالذهب والتيتانيوم ان الثقافة الميكروبية المختلطة لمحبه الكبريت المؤكسد وانخفاض الحديد الحديديك إلى الحديد الحديدي (الشكل 3).
في كل من 1 بار أو 100 الضغط بار الظروف ، وكانت الثقافات مرحله متخلفه عندما تزرع في خليه رد فعل الذهب والتيتانيوم. بعد تلك الفترة ، حدثت زيادة سريعة في تركيز الحديد الحديدي من حوالي 9 ملم إلى 31 ملم في الثقافة المزروعة في 1 بار. علي مدي فتره الحضانة من 22 يوما ، ~ 31 مم و 13 مم من الحديد الحديدي تم الكشف عنها في اختبارات في 1 بار و 100 بار ، علي التوالي. وهذا يدل بوضوح علي ان الخلايا الميكروبية كانت نشطه في 100 بار ، ولكن نشاطها الحديدي الذي يقلل من الحديد كان اقل بكثير في الضغط المرتفع. لم تظهر تجارب التحكم اللااحيائيه التي أجريت في أنابيب Hungate وزجاجات المصل انخفاض الحديد الحديديك في 1 بار و 100 بار.
تظهر الصور المجهرية الكترون المسح الضوئي (الشكل 4) خلايا علي شكل قضيب نمت في التجارب في الضغط المنخفض والعالي. لم يلاحظ اي تغير كبير في شكل الخلية في شريط 1 مقابل 100 بار. ومع ذلك ، كان من الواضح تثبيط نمو الخلايا بالضغط مرتفعه ، كما كان رقم الخلية 1.3 x 108 خلايا/مل في 1 بار بالمقارنة مع 4.5 x 107 خلايا/مل في شريط 1007. هذه البيانات قابله للمقارنة مع الاختبارات التي أجريت في أنابيب Hungate7. التالي ، فان الخلية المرنة للتفاعل بين الذهب والتيتانيوم نفسها لم يكن لها اي تاثير علي نمو الخلايا وكانت مناسبه لاختبارات النمو الميكروبي.
وتبين النتائج ان الكائنات المجهرية الحيوية نشطه حتى في ضغط عال من 100 بار ، وهو أمر ذو صله عاليه بالنسبة البيولوجية في الموقع لان مثل هذه الظروف تحدث في رواسب الخام العميقة بعمق اقل من 1,000 م7.
الشكل 1: نظره عامه علي أجزاء خلايا التفاعل. من أسفل إلى اعلي: حقيبة الذهب ، طوق التيتانيوم ، رئيس التيتانيوم ، غسالة ، التيتانيوم حلقه ضغط الترباس ، أنبوب أخذ العينات التيتانيوم مع الغدد المقاوم للصدا والياقات للاتصالات الضغط العالي ومترابطة علي كلا الجانبين ، وصمام التيتانيوم مع محول لتوصيل حقنه قفل Luer. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الرسومات الابعاد من أجزاء التيتانيوم تشكيله من قضبان من التيتانيوم الصف 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التغيرات في تركيزات الحديد الحديدي في خليه التفاعل بين الذهب والتيتانيوم والثقافة المؤكسدة للحديد الحديدي. زرعت خلايا كان [انهوائي] في 30 [ك.]. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مورفولوجية الثقافة الحديدية المؤكسدة التي تزرع في بار واحد وشريط 100. زرعت خلايا كان [انهوائي] في 30 [ك.]. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وكانت الطريقة المعروضة لتجارب الضغط العالي للتفاعلات الميكروبية داخل المحاليل الحمضية أداه قويه لمحاكاة العمليات الجيولوجية الجوفية العميقة في بيئة مختبريه.
وهناك العديد من الخطوات اليدوية التي ينطوي عليها العمل ، وبعضها يتطلب اهتماما خاصا. وكملاحظه عامه ، لا يجب استخدام القوه المفرطة عند تجميع الأجزاء الفردية من الخلية المرنة للذهب والتيتانيوم وراس المفاعل (القسمان 3 و 4). إذا تم تجاهل مواصفات الشركة المصنعة (علي سبيل المثال ، لاقصي قدر من الضغط ، ودرجه الحرارة ، وعزم الدوران) ، قد يؤدي التسرب و/أو الفشل المادي.
تنظيف أجزاء الذهب والتيتانيوم (القسم 2.2) هو خطوه عمل لا غني عنها ، ليس فقط لهذه التجربة ، ولكن خاصه بالنسبة للتجارب التي تنطوي علي (في-) ردود الفعل العضوية. بقايا من التجارب السابقة في الخلية الذهبية قد يسبب ردود فعل غير مرغوب فيها ، التالي التجعيد من النتائج. عندما يتم تركيب خليه الذهب التيتانيوم تجميعها في راس المفاعل ، فمن الأفضل للعمل بسرعة وعلي وجه التحديد ، لأنه في هذا الوقت كميات صغيره من الأكسجين يمكن ان تدخل الخلية الذهبية. إغلاق صمام أخذ العينات قبل مغادره قفازات هو التدبير الأول الجيد للتقليل من التبادل بين الغلاف الجوي المحيط مع الداخل من الخلية الذهبية.
بمجرد وضع المفاعل في جهاز هزاز ، من المهم تعيين سرعه الحركة الهزازة إلى ~ 170 °/min. إذا كان مفاعل الضغط العالي يتحرك بسرعة كبيره ، قد يحدث تمزق في الخلية الذهبية بسبب تاثيرات الجاذبية أو الحواف الحاده لرواسب أو عينات الصخور عند استخدامها.
يمكن استخدام هذه الطريقة في حقول بحث اضافيه. ان الخلية المرنة للتفاعل بين الذهب والتيتانيوم لديها القدرة علي استخدامها في مجموعه متنوعة من التحقيقات العلمية9 دراسة ردود الفعل في الضغط المرتفع ودرجه الحرارة وفي السوائل أو الغازات عاليه التاكل.
الكائنات المجهرية في أعماق السطح في درجات حرارة فوق 70 درجه مئوية في وجود الأسطح المعدنية قد تحفز إنتاج الهيدروجين الجزيئي أو الأحماض العضوية مثل خلات حتى تحت ضغط مرتفع16. هذه المنتجات ، وغيرها من المركبات ، قد تحفز النشاط الميكروبي المرتفع اثناء عمليات المعالجة البيولوجية في الموقع ، بالاضافه إلى مركبات الكبريت التي تم التحقيق فيها في هذه الدراسة.
وتشمل التطبيقات تحديد قابليه ذوبان الغازات والأيونات في السوائل المائية ، والتفاعلات الكيميائية الجيولوجية في ظروف أنظمه التنفيس الحرارية17، والكمية من تجزئه النظائر18، والتفاعلات الكيميائية الجيولوجية خلال CO 2 تنحيه19، العمليات اللااحيائيه اثناء تشكيل النفط والغاز في الصخور المصدر20، وردود الفعل الميكروبية في الضغوط المرتفعة في تحت السطح21 كما في هذه الدراسة.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
نشكر روبرت روزنباور (USGS, Menlo Park) في تقاسم خبرته في خلايا التفاعل الذهب التيتانيوم مرنه, وجورج Scheeder (المعهد الفيدرالي) لمساهمته خلال المرحلة الاوليه من اعداد النظام المعدل في هانوفر. ونود ان نشكر العديد من العلماء (بما في ذلك كاتيا Heeschen ، اندرياس ريس ، ينس غروغر-Trampe ، ثيودور الدائم) باستخدام الاعداد في هانوفر في العديد من المشاريع التي ساهمت في التحسينات قليلا علي طول الطريق والمسيحي Seeger لتطوير جهاز هزاز لمفاعلات الضغط العالي. نشكر لورا كاسترو (جامعه كومبلوتنسي في مدريد) علي ملاحظات SEM. وأخيرا ، نود ان نعرب عن امتناننا ل Nils Wölki لإنتاج هذا الفيديو عاليه الجودة لهذه المادة. وقد دعم هذا العمل الاتحاد الأوروبي الأفق 2020 المشروع البيولوجية (المنح الاتفاق # 642456).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Merck | 100013 | |
| CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
| Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
| Copper paste | Caramba | 691301 | |
| Copper paste | CRC | 41520 | |
| CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
| CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
| CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
| Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
| Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
| FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
| Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
| Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
| FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
| Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
| High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
| High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
| HCl | Roth | 6331.3 | |
| HNO3 | Fluka | 7006 | |
| H3BO3 | Sigma | B6768 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
| Light microscope | Leica DM3000 | ||
| MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
| NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
| NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
| NaO3V | Sigma | 590088 | |
| Na2SO4 | Merck | 106649 | |
| Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
| NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
| Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
| pH meter | Mettler Toledo | ||
| Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
| Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
| Stoppers | Sigma | 27234 | |
| Sulfur powder | Roth | 9304 | |
| Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
| Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
| Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
| Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
| ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |
References
- Johnson, D. B. Biomining goes underground. Nature Geoscience. 8 (3), 165-166 (2015).
- Bellenberg, S., et al. Manipulation of pyrite colonization and leaching by iron-oxidizing Acidithiobacillus species. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (3), 1435-1449 (2014).
- Christel, S., Fridlund, J., Watkin, E. L., Dopson, M. Acidithiobacillus ferrivorans SS3 presents little RNA transcript response related to cold stress during growth at 8 °C suggesting it is a eurypsychrophile. Extremophiles. 20 (6), 903-913 (2016).
- Dopson, M., Ossandon, F. J., Lovgren, L., Holmes, D. S. Metal resistance or tolerance? Acidophiles confront high metal loads via both abiotic and biotic mechanisms. Frontiers in Microbiology. 5, 157 (2014).
- Schippers, A., et al. Biomining: metal recovery from ores with microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 141, 1-47 (2014).
- Shiers, D., Ralph, D., Bryan, C., Watling, H. Substrate utilisation by Acidianus brierleyi, Metallosphaera hakonensis and Sulfolobus metallicus in mixed ferrous ion and tetrathionate growth media. Minerals Engineering. 48, 86-93 (2013).
- Zhang, R., Hedrich, S., Ostertag-Henning, C., Schippers, A. Effect of elevated pressure on ferric iron reduction coupled to sulfur oxidation by biomining microorganisms. Hydrometallurgy. 178, 215-223 (2018).
- Dickson, F., Blount, C. W., Tunell, G. Use of hydrothermal solution equipment to determine the solubility of anhydrite in water from 100 degrees C to 275 degrees C and from 1 bar to 1000 bars pressure. American Journal of Science. 261 (1), 61-78 (1963).
- Seyfried, W., Gordon, P., Dickson, F. A new reaction cell for hydrothermal solution equipment. American Mineralogist. 64 (5-6), 646-649 (1979).
- Cross, M. M., Manning, D. A., Bottrell, S. H., Worden, R. H. Thermochemical sulphate reduction (TSR): experimental determination of reaction kinetics and implications of the observed reaction rates for petroleum reservoirs. Organic Geochemistry. 35 (4), 393-404 (2004).
- Frerichs, J., Rakoczy, J., Ostertag-Henning, C., Krüger, M. Viability and adaptation potential of indigenous microorganisms from natural gas field fluids in high pressure incubations with supercritical CO2. Environmental Science & Technology. 48 (2), 1306-1314 (2014).
- Heeschen, K., Risse, A., Ostertag-Henning, C., Stadler, S. Importance of co-captured gases in the underground storage of CO2: Quantification of mineral alterations in chemical experiments. Energy Procedia. 4, 4480-4486 (2011).
- Wakeman, K., Auvinen, H., Johnson, D. B. Microbiological and geochemical dynamics in simulated-heap leaching of a polymetallic sulfide ore. Biotechnology and Bioengineering. 101 (4), 739-750 (2008).
- Pakostova, E., Grail, B. M., Johnson, D. B. Indirect oxidative bioleaching of a polymetallic black schist sulfide ore. Minerals Engineering. 106, 102-107 (2017).
- Lovley, D. R., Phillips, E. J. Rapid assay for microbially reducible ferric iron in aquatic sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (7), 1536-1540 (1987).
- Parkes, R. J., et al. Prokaryotes stimulate mineral H2 formation for the deep biosphere and subsequent thermogenic activity. Geology. 39 (3), 219-222 (2011).
- McCollom, T. M. Abiotic methane formation during experimental serpentinization of olivine. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 113 (49), 13965-13970 (2016).
- Pester, N. J., Conrad, M. E., Knauss, K. G., DePaolo, D. J. Kinetics of D/H isotope fractionation between molecular hydrogen and water. Geochimica et Cosmochimica Acta. 242, 191-212 (2018).
- Rosenbauer, R. J., Thomas, B., Bischoff, J. L., Palandri, J. Carbon sequestration via reaction with basaltic rocks: Geochemical modeling and experimental results. Geochimica et Cosmochimica Acta. 89, 116-133 (2012).
- Knauss, K. G., Copenhaver, S. A., Braun, R. L., Burnham, A. K. Hydrous pyrolysis of New Albany and Phosphoria Shales: production kinetics of carboxylic acids and light hydrocarbons and interactions between the inorganic and organic chemical systems. Organic Geochemistry. 27 (7-8), 477-496 (1997).
- Parkes, R. J., et al. Culturable prokaryotic diversity of deep, gas hydrate sediments: first use of a continuous high-pressure, anaerobic, enrichment and isolation system for subseafloor sediments (DeepIsoBUG). Environmental Microbiology. 11 (12), 3140-3153 (2009).
