Summary
מטרת הפרוטוקול היא למדוד באופן אמין תכונות מכניות של ממברנה של שלפוחיות ענק על ידי שאיפה מיקרופיפטה.
Abstract
שלפוחיות ענק שהתקבלו מפוספוליפידים וסופולימרים יכולים להיות מנוצלים ביישומים שונים: מסירה מבוקרת וממוקדת של תרופות, זיהוי ביולוגי בתוך הביו-חיישנים לאבחון, ממברנות פונקציונליים לתאים מלאכותיים, ופיתוח של ביו-כורים מיקרו/ננו-בהשראת. בכל היישומים הללו, האפיון של תכונות הממברנה שלהם הוא בעל חשיבות בסיסית. בין טכניקות האפיון הקיימות, שאיפה של מיקרופיפטה, חלוץ על ידי ה-אוונס, מאפשר את המדידה של תכונות מכניות של הממברנה כגון מודול האזור, כיפוף מודול הלחץ ומתח. כאן, אנו מציגים את כל המתודולוגיות והליכים מפורטים כדי להשיג שלפוחיות ענק מתוך הסרט הדק של השומנים או קופולימר (או שניהם), הייצור ועל פני השטח של מיקרופיפטות, ואת ההליך שאיפה המוביל למדידה של כל הפרמטרים שהוזכרו קודם לכן.
Introduction
שלפוחיות ענק שהתקבלו מ פוספוליפידים (ליפוזומים) כבר בשימוש נרחב מאז שנות ה-70 כמו קרום התא הבסיסי מודל1. בסוף שנות ה-90, מורפולוגיות ומורסיידים שהתקבלו מהרכבה עצמית של סופולימרים, ששמו פולימזומים בהתייחס לאנלוגיות השומנים שלהם2,3, הופיע במהירות כחלופה מעניינת ליפוזומים בעלי יציבות מכנית חלשה ופונקציונליות כימית מודולרית מודולרי. עם זאת, הדמות התאית שלהם הוא מוגבל למדי לעומת ליפוזומים מאז האחרון מורכב פוספוליפידים, המרכיב העיקרי של קרום התא. יתר על כן, חדירות הממברנה הנמוכות שלהם יכול להיות בעיה בכמה יישומים כמו משלוח סמים שבו הפצת מבוקרת של מינים באמצעות קרום נדרש. לאחרונה, האגודה של פוספוליפידים עם בלוק סופולימרים לעצב היברידית פולימר-ליפיד ושלפוחיות וממברנות כבר הנושא של מספר גדל והולך של לימודים4,5. הרעיון המרכזי הוא לעצב ישויות שלשלב את היתרונות של כל רכיב (ביו-פונקציונליות וחדירות של bilayers השומנים עם היציבות המכנית ורב-תכליתיות כימית של ממברנות פולימר), אשר ניתן לנצל ביישומים שונים: מבוקר וממוקד התרופה מסירה, זיהוי ביולוגי בתוך ביוחיישנים לאבחון, ממברנות פונקציונלי עבור תאים מלאכותיים, פיתוח של ביו בהשראת מיקרו/ננו-soa.
כיום, קהילות מדעיות שונות (ביו-כימאים, כימאים, ביוסיסטים, פיזיקאלית-כימאים, ביולוגים) יש עניין הולך וגובר בפיתוח של מודל קרום התא מתקדם יותר. כאן, המטרה שלנו היא להציג, כפי שניתן מפורט ככל האפשר, הקיימות מתודולוגיות (אלקטרופיטיות, שאיפה מיקרופיפטה) כדי להשיג ולאפיין את התכונות המכאניות של שלפוחיות ענק והאחרונה "מתקדמים" ממברנה קרום התא מודלים היברידי פולימר שומנים ענק שלפוחיות4,5.
המטרה של שיטות אלה היא להשיג מדידה אמינה של האזור בכיפוף וכיפוף מודולים של קרום, כמו גם מתח הפירוק שלהם ואת המתח. אחת הטכניקות הנפוצות ביותר למדוד קשיחות כיפוף של שלפוחית שלפוחית ענק הוא ניתוח תנודות6,7, מבוסס על מיקרוסקופ וידאו ישיר תצפית; אבל זה דורש תנודות גדולות בקרום הממברנה, והוא לא מתקבל באופן שיטתי על קרומים עבים (למשל פלזומים). מודול השטח ניתן לניסויים בשיטת לאנגיור בלופ, אך לרוב על מונאולייר8. טכניקת השאיפה של המיקרופיפטה מאפשרת את המדידה של שני המודולקים על ידי היווצרות unilamellar שלפוחית לפוחית ענק (בוס) בניסוי אחד.
השיטה הבאה מתאימה לכל המולקולות האמפיפיטיות או קרו מסוגלות ליצור בילאיירס וכתוצאה מכך, שלפוחיות על ידי מערך אלקטרוריות. זה דורש אופי נוזלי של הביאייר בטמפרטורה של היווצרות החשמל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בדיית מיקרופיפטות
הערה: כאן, מיקרופיפטות עם קוטר פנימי הנע בין 6 ל 12 יקרומטר ואורך להתחדד סביב 3-4 מ"מ נחוצים. שיטה מפורטת של ייצור מיקרופיפטה מתוארת בהמשך.
- מניחים את נימי הזכוכית בורוסיליקט בראש הפולר ומסדרים את אחד הקצוות על ידי הידוק הידית.
- החליקו בזהירות את הזכוכית דרך החורים בצד תא החימום.
- הדקו את כפתור ההידוק בקצה השני.
- שלוט בגודל הקצה ובאורך ההתחדד כדי להשיג את המפרט הרצוי. בשביל זה, למטב את הפרמטרים הטכניים כגון חום חימום, משיכה, מהירות, עיכוב ולחץ. להלן דוגמה של תוכנית הנמצאת בשימוש:
חום: 550 ° c
משיכה: 10 (מגוון המכונה: 0-255 ביחידות שרירותיות)
מהירות: 30 (טווח: 0-255 ביחידות שרירותיות)
עיכוב: 1 (טווח: 0-255 ביחידות שרירותיות)
לחץ: 500 (טווח: 0-999 ביחידות שרירותיות) - לחץ על pull כדי לבצע את האירועים שהוגדרו על-ידי התוכנית. הנימים מופרדים לשני מיקרופיפטות, שמידותיו צריכות להיות מותאמות בעזרת מיקרופורג '.
- הכניסו את המיקרופיפטה למחזיק הצינורות המתכתי של המיקרופורג ' (ראו איור 1). באמצעות המטרה 10x, להתאים את הבמה המיקרוסקופ ואת מניפולטור (תנועה אנכית ואופקית) עד הקצה של הפיפטה קרוב למשטח הזכוכית.
- לחץ על מתג הרגל כדי להמיס את חרוז זכוכית. הורידו את הטיפ והכניסו אותו במגע עם חרוז הזכוכית היצוקה. זכוכית מותכת יזרום לתוך הפיפטה על ידי פעולה קפילר. המתן מספר שניות עד שרמת הזכוכית המותכת תגיע לגובה מסוים כפי שמוצג בהוספה של האיור 1.
- עצור את החימום על ידי הסרת הלחץ על מתג הרגל, ובמהירות למשוך את הקצה באמצעות מניפולט הצינורות האנכי כדי לגרום להפסקה חדה.
- חזור על שלבים 1.7 ו-1.8 עד להשגת הקוטר הרצוי (6 עד 12 μm).
הערה: כדי לשפר את הדיוק של המדידה בקוטר, במהלך השלב האחרון, להשתמש במטרה 32x מצויד reticle.
2. ציפוי מהפיפטה עם BSA (סרום של שור)
- כדי להכין פתרון 0.1 M של גלוקוז המכיל 1% wt. BSA במים טהורים.
- שוקלים 180 מ ג של אבקת גלוקוז, מקום בצינור 15 מ ל פוליפרופילן ולהשלים עם 10 מ ל של מים טהורים.
- הוסף 0.1 g של אבקת BSA ולנענע בעדינות באמצעות מערבל בדיקת צינור הבדיקה עד התפרקות מלאה (כ 4 שעות).
- קח את הפתרון עם מזרק 10 מ ל Luer חד פעמי מצויד מחט. מילא פעם, להסיר את המחט ולהתקין a 0.22 יקרומטר אצטט תאית מסנן. מילוי מספר צינורות פוליפרופילן מיקרו-צנטריפוגה (1.5 mL) אשר ישמש כדי לטבול את הקצה.
- מניחים את הנימים אנכית לתוך מחזיקי. הנמך את המחזיק והישאב את הקצה לתוך פתרון הגלוקוז/BSA בלילה. הפתרון צריך לעלות על 1 ס מ גבוה בפעולה קפילר.
- הסר את עצת הפיפטה מפתרון הגלוקוז/BSA. הכינו 5 מ ל של 0.1 M פתרון גלוקוז (לדלל 90 mg של אבקת גלוקוז ב 5 מ ל מים טהורים) ולסנן דרך 0.22 יקרומטר אצטט תאית מסנן.
- ממלאים את הפיפטה עם פתרון הגלוקוז באמצעות מזרק זכוכית 500 μL מצויד עם התמזגו סיליקה קפילר גמיש. ואז, להסיר את כל הפתרון גלוקוז על ידי יניקה אותו בחזרה ולמחוק אותו (איור 2). חזור על שלב זה מספר פעמים כדי להסיר את ה-BSA שאינו מאוגדות.
3. היווצרות גומול וגימול במערך האלקטרואלי
הערה: אלקטרובמערך הוא טכני נפוץ שפותחה על ידי Angelova9. ההליכים לקבלת חדר אלקטרוליטור, הפקדה של השומנים או הסרט הפולימרי (או שניהם עבור היברידי (היברידית ענקית Unilamellar Vesicles לפוחיות)) ומימה את הסרט תחת שדה חשמלי חלופי מתוארים בהמשך. ההליך לאסוף את הבוס המתקבל מתואר גם.
- הכנת פתרונות אמפיפיליות, סוכרוז ומוצרי גלוקוז
- הכינו פתרון אמפיפיליות בריכוז של 1 מ"ג/mL. שוקל 10 מ ג של אמפיפיליות ומתמוסס 10 מ ל של כלורופורם. לשמור על הפתרון בבקבוקונים אטום כדי למנוע אידוי הממס.
- הכנת פתרון מניות של 1, 2-dioleoyl-sn-גליקו-3-פוספופאואנאמין-N-(lissamine rhodamine B סולוניל) (סמים-רוד) ב 1 מ"ג/mL ב כלורופורם.
- הוסף 10 μL של פתרון השומנים פלורסנט לפתרון האמפיפיליות. שמור את הפתרונות בבקבוקונים אטומים כדי למנוע אידוי הממס.
- הכינו פתרונות של סוכות וגלוקוז בריכוז של 0.1 מ' שוקל 342 מ"ג ו 180 מ"ג של סוכרוז וגלוקוז, בהתאמה, ומפזר אותם ב -10 מ ל של מים טהורים.
- הכנת חדר החשמל
הערה: ניתן להשתמש בחומרים מוליכי שונים כדי ליצור מכשיר ליצירת התקני חשמל (לדוגמה, חוטי פלטינה10, מחטי נירוסטה11). חדר החשמל מורכב משני שקופיות איטו מופרדים על ידי מרווח גומי O-ring שנחתך בצד אחד כדי ליצור מיפתח. השקופיות מחוברות למחולל מתח באמצעות שני חוטים חשמליים (איור 3 ואיור 4א).- נקה את שקופיות ה-ITO עם הממס האורגני (לדוגמה, כלורופורם). זיהוי המשטח המוליך באמצעות מונה.
- חברו את חוטי החשמל בצד המוליך באמצעות דבק סלוטייפ.
- עדות אמפיפיליות
- טובלים נימי בתמיסה עד שהרמה מגדילה את הפעולה קפילר ואוספת כ-5 μL של הפתרון.
- הכניסו את הנימים במגע עם מרכז לוחית הזכוכית של איטו והפיצו את הפתרון בעדינות. המתן 10 שניות כדי להבטיח אידוי הממס המלא (איור 4א).
- חזור על הליך זה 3 פעמים עבור כל צד.
- הוסיפו שכבה של משחה נטולת סיליקון משני צדי החלל הפתוח של ה-O-ring. . שים את זה באזור התצהיר הניחו את הפנים המוליך של צלחת הזכוכית השנייה בראש החלל.
- מניחים את חדר החשמל בואקום במשך 3 שעות כדי להסיר עקבות של ממיסים אורגניים.
- נוהל אלקטרוציאלי
- . חברו את חוטי החשמל לגנרטור
- השתמש בהגדרות הבאות עבור המחולל:
מתח sinusoidal אלטרנטיבי
תדר: 10 הרץ
משרעת: 2 Vשיא לשיא
הערה: יש למצוא את תדר המתח האופטימלי והמשך עבור כל מערכת. - ודא כי המתח מוחל לפני ההזרקה של הפתרון בחדר.
- להזריק 1 מ ל של פתרון באמצעות מזרק עם מחט בקוטר 0.8 מ"מ הפנימי למלא את התא. להסיר בסופו של דבר בועות.
- תנו לחדר תחת מתח/תדר שהוחלו עבור 75 דקות (איור 4ב').
- הקציר של גועומת
- . תכבה את הגנרטור
- באמצעות מזרק 1 מ מ עם המחט בקוטר הפנימי 0.8 מ"מ, למצוץ חלק קטן של הפתרון כדי לייצר בועת אוויר בתוך החדר. להטות מעט את התא כדי להפוך את הבועה הזאת לנוע בתוך החדר. זה יכול לעזור GUVs להתנתק מפני השטח ITO (איור 4ג).
- למצוץ את כל הפתרון ולהעביר אותו צינור פלסטיק 1 mL.
- להסיר את החוטים ולנקות את שקופיות ITO עם ממיסים אורגניים (toluene אז כלורופורם).
4. הגדרת מיקרומניפולציה
הערה: עקרון השאיפה של המיקרופיפטה הוא למצוץ שלפוחית בודדת דרך מיקרופיפטה מזכוכית על ידי החלת דיכאון. אורך הלשון בתוך הפיפטה נמדד כפונקציה של לחץ היניקה. ציפוי הפיפטה עם BSA, המתואר קודם לכן, חיוני למנוע או למזער את כל הדבקות בין הממברנות והפיפטה.
הפרוטוקול מומחש למטה.
- פיפטה והתחברות למאגר מלא מים
הערה: המיכל המלא מים והמיקרומטר מקובעים לצלחת הזזה. מונה דיגיטלי עם ראש מיקרומטר מאפשר הזחה אנכית של המכשיר בטווח של 0 כדי 2.5 ס מ ודיוק של 1 μm. הזחה במעקה אופטי אלומיניום אפשרית עד 1 מטר באורך. אבובים סיליקון מחבר את המאגר ואת מחזיק נימי (איור 5א).- . תמלא את המיכל במים טהורים חבר מזרק חד פעמי 5 מ ל למחזיק מתכת נימי באמצעות אבובים סיליקון ומלא כדי ליצור זרימת מים מן הטנק אל המחזיק.
- גע בצינורית מעט כדי לסלק בועות אוויר. במקביל, הרימו את מיכל המים כדי ליצור לחץ חיובי. מזרק 5 מ ל עדיין מחובר למחזיק.
- לאחר שלבי הציפוי והניקוי שתוארו בעבר (ראה שלב 2), מלאו נימי עם תמיסת גלוקוז עד לצורת הירידה בסוף. הסירו את צינורות המזרק ממחזיק המתכת כדי ליצור זרימת מים קלה בסופה.
- הפוך את הקפילר למטה וחבר את טיפת הגלוקוז עם זרימת המים מבעל. לתקן את הנימים ואת המחזיק על ידי לשגע אותם יחד.
- מיקום פיפטה
הערה: במהלך פעולה זו, מיכל המים עדיין ממוקם על מעקה האלומיניום כדי לשמור על לחץ חיובי.- קח את הבמה אלומיניום תוצרת בית מצויד עם שתי שקופיות זכוכית (ניקה בעבר עם אתנול) ולהדביק אותם עם שומן ואקום בכל צד. התקן אותו על הבמה מיקרוסקופ וליצור מניסקוס בין שתי שקופיות באמצעות מזרק 1 מ ל המכיל 0.1 M של גלוקוז כפי שמוצג באיור 5B, C.
- מניחים את הפיפטה ואת המחזיק בו על המכשיר המוטורי של המיקרומניפולציה ומהדקים את כפתור ההידוק.
- השתמש במוט ההיגוי של לוח הבקרה במצב גס כדי להוריד את המיקרופיפטה ליד מנסקוס הגלוקוז. התאימו את מיקום העצה למרכז מניסקוס במצב בסדר.
- להחזיק את הקצה שקוע גלוקוז במשך כמה דקות כדי לנקות את המשטח החיצוני והפנימי שלה (כמו לחץ חיובי נשמרת, זרימת המים יהיה לשטוף את המשטח הפנימי של הפיפטה כדי להסיר BSA מצופה.
- אחסן את מיקום העצה על מקלדת המיקרומניפולציה והחלק אותו ממניסקוס.
- הסירו את ממנקוס הגלוקוז. והחליפו אותו באחד חדש למצוץ 2 μL של GUVs ב 0.1 M סוכרוז באמצעות 20 μL מיקרופיפטה ולשים אותו בתוך מניסקוס טרי. התבונן במצב DIC (ניגוד הפרעות דיפרנציאלי) ה-GUVs הממוקם בתחתית בשל הבדל הצפיפות בין סוכות (בעיקר בתוך הגומול) והגלוקוז (בעיקר מחוץ ל-GUVs).
- כאשר השלפוחיות מצטמקות מעט, הכנס את מתקן היניקה והתמקד בקצה. הגדר את גובה H0 של מיכל המים שלחץ כמעט 0. בשביל זה, לנצל את היתרונות של שלפוחיות קטנות או חלקיקים אשר נמצאים באופן טבעי בפתרון ולהתאים את גובה מיכל המים עד התנועה של חלקיקים אלה נפסק.
- בשלב זה, הקף את מניסקוס עם שמן מינרלי כדי למנוע אידוי מים, ראה איור 5ד.
הערה: יש לשלוט בטמפרטורת החדר בין 20-22 ° c באמצעות מיזוג אוויר.
- ניסוי שאיפה מיקרופיפטה
- הנמך את קצה הפיפטה (6-12 יקרומטר בקוטר) וצור שאיבה קטנה (1 ס מ) כדי לשאוב שלפוחית (15-30 יקרומטר בקוטר). קרום השלפוחית שנבחרה צריך להשתנות במקצת, ואסור להציג פגמים גלויים (אין ניצן או פילמנט) (איור 6).
- הרימו את הפיפטה לרמה גבוהה יותר כדי לבודד את השועית האספירין משאר השולפוחיות, באמצעות המיקרומניפולציה ושמרו על תנוחה זו במהלך הניסוי כולו.
- מראש להדגיש את שלפוחית המים על ידי הנמכת הטנק ממולא על פני כ -10 ס"מ, ולאחר מכן להקטין את הלחץ כדי לחזור לערך ההתחלתי שלה (-1 ס מ). חזור על שלב זה מספר פעמים כדי להסיר עודפי קרום ופגמים קטנים מהקרום.
- מגובה של-0.5 ס מ המוגדר על-ידי מיקום מיכל המים, להקטין באיטיות את לחץ היניקה עם המיקרומטר כדי להגיע למשטר שבו הקרום משתנה. ואז להגביר את הלחץ כדי להמחיש בבהירות לשון בקצה עם אורך הקרנה משמעותית (כמה מיקרון).
הערה: הלחץ המופעל הנמוך ביותר (P0) המאפשר לשאוב את אורך ההטלה הקטן ביותר של הממברנה (L0) יגדיר את נקודת ההתייחסות α0 (איור 7א). כל הנקודות של העקומה נמדדות לפי התייחסות זו (ΔL = L-L0 ו-ΔP = P-p0). - הגבר את לחץ היניקה באמצעות המיקרומטר באופן החורג עד 0.5-0.8 mN/m. בכל שלב, לחכות 5 s ולצלם תמונה של הלשון. הליך זה במתח נמוך מאפשר נחישות של מודול כיפוף.
- המשיכו להגדיל את לחץ היניקה מ 0.5 mN/מ' למתח הקרע באמצעות התאמת גובה המים המלאים במעקה (החל מ -2 עד 50 ס"מ) (איור 7ב-ד). מתוך ניסוי זה במשטר מתח גבוה, מודול האזור המדידה, מתח הליזה ומתח הפירוק יימדדו.
- מתחו כ-15-20 ושלפוחיות כדי לרכוש סטטיסטיקות משמעותיות. כל ניסוי של מיקרופיפטה. נמשך בין 7 ל -10 דקות בצעו ניתוח תמונה באמצעות תוכנת LASAF למדידת אורך ההקרנה של הלשון, קוטר השלפוחיות ורדיוס הנימים.
- מודולוס כיפוף, מודול השטח באזור, מתח לפירוק ומאמץ לפירוק
- כדי לגשת לפרמטרים אלה, השתמש בפורמליזם שהוקם על ידי ה-E. אוונס12. לחשב את לחץ היניקה להחיל על הקרום מהמשוואה 1:
Δ P = ρwg (h-h0) (1)
כאשר g היא האצת כבידה (9.8 m ∙ s-2), ρw היא צפיפות המים (ρ = 1 g ∙ ס מ3), h היא המיקום של מיכל המים ו-h0 הוא המיקום הראשוני שבו הלחץ הוא שווה לאפס. - לחשב את המתח ממברנה מהמשוואה לפלס:
2
כאשר ΔP הוא לחץ היניקה על המיקרופיפטה, Rp ו-rv הם מיקרופיפטה ושלפוחית גלי (מחוץ למיקרופיפטה) בהתאמה. העומס באזור פני השטח (α) של הקרום מוגדר כ:
3
להיות אזור הקרום של הועית בלחץ היניקה התחתון. - חישוב α מן העלייה באורך ההקרנה ΔL של שלפוחית בתוך העצה נימי לפי משוואה 412:
4 - תחת משטר מתח נמוך מאוד, החלקה של מעטה כיפוף תרמי שולטת על ההתרחבות הנראית לעין. מגרש ב (σ) vs α. בערכים נמוכים-σ (בדרך כלל 0.001 – 0.5 mN. m-13), זה נותן קו ישר אשר השיפוע שלו מקושר מודול כיפוף, Kb (המונח הראשון של המשוואה 5)14:
(5)
הערה: תחת מתחים גבוהים (> 0.5 mN. m-1), הסרת ממברנה מודחקים לחלוטין ואזור הממברנה מגדיל כתוצאה של ריווח מוגבר בין מולקולות. במשטר זה, הקדנציה השנייה של המשוואה 5 שולטת ומעניקים גישה למרכז השטח של האזורמודול K (איור 8 ואיור 9).
- כדי לגשת לפרמטרים אלה, השתמש בפורמליזם שהוקם על ידי ה-E. אוונס12. לחשב את לחץ היניקה להחיל על הקרום מהמשוואה 1:
2
3
להיות אזור הקרום של הועית בלחץ היניקה התחתון.
4
(5)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עם הפרוטוקול הנ ל, למדנו שונים unilamellar שלפוחית לפוחית סינתטי (בוס), שהתקבל מ פוספוליפיד: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-גלידו-3-פוספהולין (popc), משולש קופולימר: פולי (ethyleneoxide)-b-פולי (diמתיל siloxane)-b-פולי (ethyleneoxide) (peo12-b-pdms43-b-peo12) מסונתז במחקר הקודם13, ו diblock קוולר פולי (diמתיל siloxane)-ב-פולי ( ethyleneoxide) (PDMS27-ב-peo17). זה כבר הוצג בעבר על ידי הקבוצה שלנו כי האגודה של משולש משולב PEO של8-b-pdms22-b-PEO8 עם פוספוליפיד popc מוביל ירידה עצומה של קשיחות ממברנה של הUnilamellar וכתוצאה (ענק היברידי היברידית)15. המדידה כבר חזר עבור מחקר זה והרחיב GUVs שהושג מתוך diblock קוולר ו GHUV שהתקבלו מן האגודה של הקשר הזה diblock ו POPC.
התוצאות מומחשות באיור 10 ובטבלה 1. האזור הדוק מודולוס ומאמץ הפירוק עבור POPC הם בהסכמה מושלמת עם ספרות16. המדידה של כיפוף מודולים של שלפוחית לפוחית היברידית עדיין לא בוצעה במעבדה. ערכים טיפוסיים ניתנים עבור הפלזומים שהושגו. כדאי לציין כי הקשיחות של קרום (Ec) שהתקבל מ diblock סופולימרים הוא הרבה מעבר לאלה המתקבלים עם מטריסופולימר triblock. מעניין יותר, עם diblock סורר ניתן להשיג היברידית ענקית unilamellar השומנים/פולימר שלפוחיות כי נוכח קשיחות גבוהה יותר ליפוזומים, אשר הוא האינטרס העיקרי של האגודה כגון.
איור 1: מיקרופורג עבור טיפים ליטוש צינורות. התמונה מציגה את החלקים השונים של המכשיר: את מחזיק הצינורות מתכת (א), נימי הזכוכית (ב), אזור החימום המיקרומניפולציה (c), מקור האור (d), 10x, 32x, 40 x יעדים (e), ואת המיקרוסקופ oculars (f). בתוך הכנס, קצה הפיפטה, שקוע בחרוז זכוכית, נצפה דרך מטרה 32x עם reticle. רמת הזכוכית המותכת לתוך הקצה תוקנה בגובה ביניים (H) לאחר הקירור. משיכת הקצה גורמת להפסקה חדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניסיוני להגדיר לציפוי ומילוי טיפים צינורות. (A) מזרק זכוכית 500 μl מצויד בקפילר גמיש מותקן כדי למלא את המיקרופיפטה עם פתרון גלוקוז. (ב) הגדלה של החלק התחתון של הקפילר. במהלך טבילה לילה, רמת הפתרון BSA עולה על ידי בפעולה קפילר עד 1 ס מ אורך. הפיפטה מתמלא לאחר מכן בגלוקוז על-ידי החדרת נימי גמיש להסרת BSA בלתי מבוקר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: חומרים לבניית מכשיר חשמלי מבוסס איטו. המכשיר מורכב משתי שקופיות זכוכית מצופה בצד אחד עםהאינדנוםבדיל תחמוצת (א). O-טבעת גומי נחתך בצד אחד כדי לאפשר טעינת הפתרון בתוך החדר והקציר של ההשעיה GUVs (ב). O-טבעת גומי משמש מרווח כדי להפריד בין שתי שקופיות. השקופיות מחוברות למחולל המתח באמצעות חוטי חשמל (c) ומחוברים למשטח באמצעות דבק סלוטייפ (d). משחה נטולת סיליקון משמשת לסגירת הרווח עם השקופיות (e). הומטר משמש כדי לזהות את הצדדים מצופים איטו ולבדוק את המוליכות (f). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מערך החשמל הוגדר. (א) המופקד על התמיסה האמפיפיליות באמצעות נימי זכוכית על דפנות הזכוכית המצופה ב-ITO. (ב) לאחר ההרכבה והייבוש, החדר מחובר למחולל המתח (10 הרץ, 2 ו) ולאחר מכן מתמלא בתמיסה של סוכרוז. (ג) לאחר אלקטרוונטור, נוצר בועת אוויר בתוך התא כדי לסייע guvs להתנתק מן המשטח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מיקרופיפטה שאיפה הגדרת. (א) תיאור הרכיבים: מיקרוסקופ פלואורסצנטית (1), מים ממולאים טנקים ו מיקרומטר הזזה על מעקה אלומיניום אופטי (2), צינורות סיליקון המבצע זרימת מים מן המאגר למיקרו פיפטה (3), לוח הבקרה של מיקרומניפולציה (4), יחידת מנוע של המיקרומניפולציה המאפשרת X, Y ו-Z הזחה (5), בידוד הלוח ה (ב) ההגדלה המציגה את שלב האלומיניום הביתי המצויד בשתי שקופיות זכוכית (7), פיפטה (8) ומחזיק פיפטה (9) הרכוב על היחידה המוטורית של המיקרומניפולציה ותוקן על ידי כפתור הידית (10). שימו לב כי קצה הפיפטה שקוע במרכז הגלוקוז מניסקוס. (ג) זכוכית שקופיות מודבק עם שומן ואקום על כל צד ומאפשר היווצרות של מניסקוס גלוקוז (נוף צדדי). (ד) גלוקוז מניסקוס מוקף בשמן מינרלי כדי למנוע אידוי מים (למעלה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תמונה של בוס תחת מתח באמצעות שאיפה מיקרופיפטה. הערוץ האדום אוסף את הקרינה הפלואורסצנטית מתוך מתויג rhodamine ואת ערוץ השידור (DIC) מוזגו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תמונות של הבוס בלחץ יניקה שונים. (א) המתח המוחל הנמוך ביותר הגורם להיווצרות לשון משמש כהתייחסות כדי לקבוע את אורך הלשון הראשונית (L0) ואת הרדיוס הוועית (Rv). (ב) ערך מתח שיושם בתווך עם אורך הלשון המשויך (L). (ג) מאוד גבוהה להחיל מתח. (ד) תמונה בדיוק לאחר הקרע בקרום שבו רדיוס הפיפטה נמדד (Rp). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: מתח הנציג-מזימה מאמץ של GUVs שהושג על ידי שאיפה מיקרופיפטה. אותה ערכת נתונים שימשו כדי להתוות in (σ) = f (α) ו σ = f (α). במשטר המתח הנמוך, In (σ) משתנה בצורה קווית עם α (התאמה ליניארית ירוקה) ומעניקה גישה מודול כיפוף (Kc); ואילו במשטר המתח הגבוה, σ משתנה בצורה לינארית עם α (התאמה ליניארית אדומה) ומעניקה גישה למודולארית האזור (Ka). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: מתח הנציג-העלילה מאמץ של בוס השיגה על ידי שאיפה מיקרופיפטה במשטר מתיחה. מן העקומה ניסיוני כמה פרמטרים מכניים של GUVs ניתן לקבוע. מודול השטח של האזור (Ka) מתאים לשיפוע הראשוני ונמדד על ידי התאמת העקומה בצורה לינארית. הנקודה נמדד האחרון נותן את זן הליזה (αl) ואת מתח הליזה (σL) ערכים. לבסוף, האנרגיה צפיפות מלוכדת (Ec) ניתן להעריך על ידי שילוב האזור תחת עקומת (אזור כתום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: מאמץ מייצג-מגרשים מסננים שהתקבלו עבור ליפוכמה, פולימריות ו פולימר היברידי/vesicle לפוחית השומנים. GUVs מורכב POPC (משולשים אדומים), טרילוק סופולימר (עיגולים ירוקים), diblock סופולימר (ריבועים כחולים), triblock מבוסס היברידית (עיגולים ירוקים בהירים) ו diblock מבוסס היברידית (ריבועים כחול בהיר). העיקולים הושגו על ידי ממוצע המידות על לפחות 15 GUVs עבור כל מערכת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| קה | αL | σL | Ec | Kb | |
| (mN. m-1) | (%) | (mN. m-1) | (mN. m-1) | כיוון | |
| פופ מג | 194 ± 15 | 4 ± 1 | 8 ± 2 | 0.17 ± 0.09 | מיכל ב, 21.1 ± 0.7 |
| מיכל החמצן27-ב-peo17 | 121 ± 8 | 16 ± 4 | 15 ± 3 | 1.37 ± 0.67 | 10.6 ± 3.5 |
| מיכל החמצן27-ב-peo17 | 132 ± 13 | 9 ± 4 | 10 ± 3 | 0.50 ± 0.38 | - |
| + 5 wt .% POPC | |||||
| PEO12-ב-pdms43-b-peo12 | 84 ± 13 | 7 ± 1 | 6 ± 2 | 0.50 ± 0.38 | - |
| PEO12-ב-pdms43-b-peo12 | 91 ± 11 | 3 ± 1 | 2 ± 1 | 0.03 ± 0.01 | - |
| + 5 wt .% POPC |
טבלה 1: פרמטרים מכניים נקבע באמצעות מיקרופיפטה טכניקות השאיפה על GUVs מורכב פוספוליפיד, סופולימרים או שניהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ציפוי המיקרופיפטה הוא אחת הנקודות המרכזיות להשגת מדידות אמינות. יש למנוע הדבקה של שלפוחית המנוע למיקרו-פיפטה, וציפוי משמש לרוב בספרות17,18,19,20,21, עם bsa, β-קזאין או סורפסיל. פרטים על תהליך הציפוי מוזכרים לעתים נדירות.
התפרקות BSA צריך להתבצע לפחות 4 שעות תחת עצבנות על מנת להשיג פתרון טוב. עם זאת, השלב הסינון עדיין נדרש כדי להסיר את כל האגרגטים העלולים לשבש את הקצה המיקרו-פיפטה. אם BSA לא מומס היטב, רובו יוסר על ידי סינון, וציפוי יהיה לא יעיל. הריכוז האידיאלי וזמן הפירוק הם בהתאמה 0.8-1 wt .% ו-4 h.
נקודה קריטית נוספת היא להבטיח לחץ אוסמוטי קבוע בתוך ומחוץ השלפוחית במהלך המדידה. גידול של ריכוז גלוקוז בשל אידוי מים במהלך הניסוי יכול להוביל להשחית של שלפוחית ו perturb את המדידה (הערכה של Ka, וכו '). התצהיר של שכבת שמן הוא חובה כדי למנוע תופעה זו (איור 3ד). כדי לבדוק את היעילות של שכבת הנפט, השאיפה קבוע לחץ של מעטים mN ∙ m-1 ניתן להחיל על שלפוחית לפוחית עבור 5 דקות, ואת אורך L של הלשון בתוך נימי צריך להיות קבוע.
הנקודה הקריטית האחרונה היא צעד לפני הדחק (סעיף 3.3), המוזכר לעתים נדירות בספרות20. שלב זה הוא הכרחי כדי להסיר את ניצנים, את הצינורות ואת השטח העודף של שלפוחית המים ולקבל תוצאות הנוזבות מתוך שלפוחית למשנהו.
שיטת השאיפה מיקרופיפטה ניתן להחיל על כל GUVs, כל עוד הם מציגים קרום נוזל (למשל, Telectroformation יווצרות > Tm של שומנים) ובעלי מודול כיפוף מתחת 100 kT. במקרה של קרום עבה וצמיגי, אפילו במצב נוזלי, ניתן להשתמש בשתי פיפטות כדי למדוד את המודוללי22. טכניקת השאיפה של המיקרופיפטה מציגה יתרון גדול להעניק גישה למספר פרמטרים (כיפוף ובקרה של מודולים באזור) וזוהי הטכניקה היחידה הזמינה לגישה ישירה לאזור המיודול של ממברנה של הבוס.
למרות שטכניקה זו הייתה ידועה כבר זמן רב, הוא עדיין משמש בדרך כלל על ידי קהילות מדעיות רבות (ביוסיציליאנים, פיזיקאלית-כימאים, כימאים וכו '). שיטת השאיפה של המיקרופיפטה תמשיך להיות טכניקה משמעותית בעתיד, במיוחד לחקור את תכונות הממברנה הנוספות של תא סינתטי מתקדם (כגון פולימר היברידי/שלפוחית השומנים ושלפוחיות ופרוטומות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מכירים בהכרת תודה את ה-ANR לקבלת תמיכה כספית (ANR Sysa).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
References
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
- Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
- Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
- Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
- Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
- Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
- Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate'' membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
- Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
- Longo, M. L., Ly, H. V. Methods in Membrane Lipids. Dopico, A. M. , Humana Press. 421-437 (2007).
- Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
- Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
- Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
- Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule: A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
- Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).
