מטרת הפרוטוקול היא למדוד באופן אמין תכונות מכניות של ממברנה של שלפוחיות ענק על ידי שאיפה מיקרופיפטה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Obtention של ענק Unilamellar היברידית ושלפוחיות על ידי אלקטרוונטור ומדידה של תכונות מכניות שלהם על ידי שאיפה מיקרופיפטה
במאמר זה
סיכום
תקציר
שלפוחיות ענק שהתקבלו מפוספוליפידים וסופולימרים יכולים להיות מנוצלים ביישומים שונים: מסירה מבוקרת וממוקדת של תרופות, זיהוי ביולוגי בתוך הביו-חיישנים לאבחון, ממברנות פונקציונליים לתאים מלאכותיים, ופיתוח של ביו-כורים מיקרו/ננו-בהשראת. בכל היישומים הללו, האפיון של תכונות הממברנה שלהם הוא בעל חשיבות בסיסית. בין טכניקות האפיון הקיימות, שאיפה של מיקרופיפטה, חלוץ על ידי ה-אוונס, מאפשר את המדידה של תכונות מכניות של הממברנה כגון מודול האזור, כיפוף מודול הלחץ ומתח. כאן, אנו מציגים את כל המתודולוגיות והליכים מפורטים כדי להשיג שלפוחיות ענק מתוך הסרט הדק של השומנים או קופולימר (או שניהם), הייצור ועל פני השטח של מיקרופיפטות, ואת ההליך שאיפה המוביל למדידה של כל הפרמטרים שהוזכרו קודם לכן.
מבוא
שלפוחיות ענק שהתקבלו מ פוספוליפידים (ליפוזומים) כבר בשימוש נרחב מאז שנות ה-70 כמו קרום התא הבסיסי מודל1. בסוף שנות ה-90, מורפולוגיות ומורסיידים שהתקבלו מהרכבה עצמית של סופולימרים, ששמו פולימזומים בהתייחס לאנלוגיות השומנים שלהם2,3, הופיע במהירות כחלופה מעניינת ליפוזומים בעלי יציבות מכנית חלשה ופונקציונליות כימית מודולרית מודולרי. עם זאת, הדמות התאית שלהם הוא מוגבל למדי לעומת ליפוזומים מאז האחרון מורכב פוספוליפידים, המרכיב העיקרי של קרום התא. יתר על כן, חדירות הממברנה הנמוכות שלהם יכול להיות בעיה בכמה יישומים כמו משלוח סמים שבו הפצת מבוקרת של מינים באמצעות קרום נדרש. לאחרונה, האגודה של פו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בדיית מיקרופיפטות
הערה: כאן, מיקרופיפטות עם קוטר פנימי הנע בין 6 ל 12 יקרומטר ואורך להתחדד סביב 3-4 מ"מ נחוצים. שיטה מפורטת של ייצור מיקרופיפטה מתוארת בהמשך.
- מניחים את נימי הזכוכית בורוסיליקט בראש הפולר ומסדרים את אחד הקצוות על ידי הידוק הידית.
- החליקו בזהירות את הזכוכית דרך החורים בצד תא החימום.
- הדקו את כפתור ההידוק בקצה השני.
- שלוט בגודל הקצה ובאורך ההתחדד כדי להשיג את המפרט הרצוי. בשביל זה, למטב את הפרמטרים הטכניים כגון חום חימום, משיכה, מהירות, עיכוב ולחץ. להלן דוגמה של תוכנית הנמצאת בשימוש:
חום: 550 ° c
משיכה: 10 (מגוון המכונה: 0-255 ביחידות שרירותיות)
מהירות: 30 (טווח: 0-255 ביחידות שר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עם הפרוטוקול הנ ל, למדנו שונים unilamellar שלפוחית לפוחית סינתטי (בוס), שהתקבל מ פוספוליפיד: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-גלידו-3-פוספהולין (popc), משולש קופולימר: פולי (ethyleneoxide)-b-פולי (diמתיל siloxane)-b-פולי (ethyleneoxide) (peo12-b-pdms43-b-peo12) מסונתז במחקר הקודם13, ו diblock קוולר פולי (diמתיל siloxane)-ב-פולי ( ethyleneoxide) (PDMS27-ב-peo17
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ציפוי המיקרופיפטה הוא אחת הנקודות המרכזיות להשגת מדידות אמינות. יש למנוע הדבקה של שלפוחית המנוע למיקרו-פיפטה, וציפוי משמש לרוב בספרות17,18,19,20,21, עם bsa, β-קזאין או סורפסיל. פרטים על תהליך הציפוי מוזכרים לעתים נדירות.
התפרקות BSA צריך להתבצע לפחות 4 שעות תחת עצבנות על מנת להשיג פתרון טוב. עם זאת, השלב הסינון עדיין נדרש כדי להסיר .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים מכירים בהכרת תודה את ה-ANR לקבלת תמיכה כספית (ANR Sysa).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ציוד וחומרים נדרשים לתכנון מיקרופיפטה | |||
| בורוסיליקט נימי זכוכית | World Precision Instruments | 1B100-4 | קוטר חיצוני ופנימי של 1 מ"מ ו-0.58 מ"מ בהתאמה. |
| נימה התקינה | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5 מ"מ * 2.5 מ"מ קופסה נימה |
| בוערת / חום Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | דגם P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | מצויד בשתי מטרות (10x ו-32x) |
| חומרים לציפוי קצות פיפטה עם BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| מזרק חד פעמי 1 מ"ל Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| מזרק חד פעמי 10 מ"ל Luer Tip | Codan | 626616 | |
| מזרק חד פעמי 5 מ"ל Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| מסנן תאית אצטט חד פעמי | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | גודל נקבוביות: 0.22µ מ', קוטר: 25 מ"מ |
| צינורות נימי סיליקה התמזגו גמישים | Polymicro Technologies. | TSP530660 | קוטר פנימי 536µ m, קוטר חיצוני 660µ m, |
| גלוקוז | סיגמא-אולדריץ' | G5767 | |
| מזרק 500 ומיקרו; L luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| מערבל סיבובי מבחנה | Labinco | 28210109 | |
| מיקרומניפולציה הגדרה | |||
| מסילה אופטית אלומיניום, אורך 1000 מ"מ, חוטי M4, סדרת X48 | Newport | ||
| שולחן אופטי משוכך | ניופורט | משמש כתמיכה במיקרוסקופ למניעת רעידות חיצוניות. | |
| מיקרומניפולטור | Eppendorf | Patchman NP 2 | יחידת המודול (יחידת מנוע לתנועת X, Y ו-Z) מותקנת על המיקרוסקופ ההפוך באמצעות מתאם. |
| מיקרומטר | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | ראש מיקרומטר LCD דיגימטי 25,4 מ"מ טווח 0,001 מ"מ |
| מאגר מים פרספקס (100 מ"ל) | הפוך TCS SP5 תוצרת | ||
| (DMI6000) מצויד בסורק תהודה ומטרת טבילה במים (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 80 מ"מ אורך, עם חוט 1/4-20, 8-32 ו-4-40 ניופורט | |||
| חומרים להכנת תמיסת סוכרוז ואמפיפיל< | |||
| a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank"> 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine מתויג ליפיד |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation הגדרה | |||
| 10 ומיקרו; L זכוכית נימי טבעות | Hirschmann | 9600110 | |
| חד פעמי 1 מ"ל מזרק Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H גריז | Apiezon | Apiezon H גריז | ללא סיליקון |
| אינדיום תחמוצת פח מצופה זכוכית שקופיות | סיגמא-אולדריץ | ' 703184 | |
| מחט | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 מ"מ |
| אוהם מטר (מולטימטר) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| מחולל מתח | Keysight | 33210A |
מקורות
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
