Protocole facétoien visant à isoler l'ARN des cellules secondaires des glandes accessoires mâles Drosophila

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour dissocier et trier une population cellulaire spécifique des glandes accessoires mâles de Drosophila (cellules secondaires) pour le séquençage d'ARN et RT-qPCR. L'isolement cellulaire est accompli par la purification FACS des cellules secondaires GFP-exprimant après un processus multiétape-dissociation exigeant la dissection, la digestion de protéases et la dispersion mécanique.

Résumé

Pour comprendre la fonction d'un organe, il est souvent utile de comprendre le rôle de ses populations cellulaires constituantes. Malheureusement, la rareté des populations cellulaires individuelles rend souvent difficile l'obtention de suffisamment de matériel pour les études moléculaires. Par exemple, la glande accessoire du système reproducteur mâle Drosophila contient deux types distincts de cellules sécrétrices. Les cellules principales représentent 96% des cellules sécrétrices de la glande, tandis que les cellules secondaires (SC) constituent les 4% restants des cellules (environ 80 cellules par mâle). Bien que les deux types de cellules produisent des composants importants du liquide séminal, seuls quelques gènes sont connus pour être spécifiques aux SCs. La rareté des SC a, jusqu'ici, entravé l'étude transcriptomic d'analyse de ce type important de cellules. Ici, une méthode est présentée qui permet la purification des SC pour l'extraction et le séquençage de l'ARN. Le protocole consiste d'abord à disséquer les glandes de mouches exprimant un journaliste SC-spécifique GFP, puis soumettre ces glandes à la digestion de la protéase et la dissociation mécanique pour obtenir des cellules individuelles. Après ces étapes, les cellules individuelles, vivantes, marquées gFP sont triées à l'aide d'un trieur de cellules activés fluorescentes (FACS) pour la purification de l'ARN. Cette procédure donne des ARN spécifiques à SC à partir de 40 mâles par condition pour le séquençage EN aval de RT-qPCR et/ou d'ARN au cours d'une journée. La rapidité et la simplicité de la procédure permet de déterminer les transcriptomes de nombreuses mouches différentes, de différents génotypes ou conditions environnementales, dans un court laps de temps.

Introduction

Les organes sont constitués de plusieurs types de cellules, chacun e avec des fonctions discrètes et exprimant parfois des ensembles très différents de gènes. Pour obtenir une compréhension précise du fonctionnement d'un organe, il est souvent essentiel d'étudier chaque type de cellule distinct qui constitue cet organe. L'une des principales méthodes utilisées pour explorer la fonction possible est l'analyse de transcriptome. Cette méthode puissante fournit un instantané de l'expression du gène dans une cellule, pour révéler les processus actifs et les voies. Cependant, ce type d'analyse est souvent difficile pour les populations de cellules rares qui doivent être pur....

Protocole

1. Lignes drosophila utilisées et collection d'hommes

1. Pour ce protocole, utilisez des mâles exprimant le GFP dans les SC et non dans les cellules principales. Ici, un pilote AbdB-GAL4 (décrit en référence¹⁸), recombiné avec UAS-GFP (sur le chromosome 2) est utilisé. D'autres pilotes appropriés peuvent également être utilisés. Pour l'isolement des SC dans différentes conditions mutantes, traversez la mutation en lignes contenant la ligne GFP spécifique au SC.
2. Recueillir deux lots d'environ 25 mâles vierges sains pour chaque génotype et les vieillir à 25 oC pendant 3-4 jours en flacons avec des alime....

Résultats

Le protocole présenté ici permet à un expérimentateur d'isoler les cellules secondaires des glandes accessoires mâles Drosophila et d'extraire leur ARN au cours d'une seule journée (Figure 1).

Nous utilisons la construction Abd-B-GAL4 ¹⁸ pour étiqueter les cellules secondaires (SC) mais pas les cellules principales (MC) avec GFP (Figure .......

Discussion

Les méthodes de dissociation cellulaire du tissu Drosophila comme les disques imaginaires sont déjà décrites²³. Nos tentatives d'utiliser simplement ces procédures sur les glandes accessoires ont échoué, nous encourageant à développer ce nouveau protocole. La digestion de la protéase et la trituration mécanique ont été des étapes critiques que nous avons dépannées pour le succès de la procédure, et nous avons donc placé de nombreuses notes dans les sections 2 à 5 pour aider les expériment.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque de culture tissulaire à 24 puits	VWR	734-2325
Microscope binoculaire pour la dissection
Jumelles avec source lumineuse pour GFP
Bunsen
Draq7 0,3 mM	BioStatus	DR71000
Microtubes en plastique 1,5 mL	Eppendorf
FACS	Beckman Coulter	MoFlo Astrios
			dissection fine
Sérum fœtal bovin	Gibco	10270-106	inactivé par la chaleur avant utilisation
Boîtes en verre pour la dissection
Seau
ImProm-II Système de transcription inverse	Promega	A3800
Kit de purification d’ARN MasterPure	Epicentre	MCR85102
Nextera XT kit	illumina		https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			fait maison
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15070-063
Amorces
Amorces hexamères aléatoires
ARN 6000 Pico kit	Agilent
Schneider' s Drosophila medium	Gibco	21720-001
SMARTer kit de synthèse d’ADNc	Takara		https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
SYBR select Master mix for CFX	appliqué biosystèmes	4472942
Thermo Shaker	Hangzhou Allsheng intruments	MS-100
Tipone 1250 &mu ; Pointe graduée en L	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 &mu ; L pointe biseautée	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013
Vortex

Pince àà glacePolydT