Een pre-klinische rat model voor de studie van ischemie-reperfusie letsel in reconstructieve microchirurgie

Summary

Hier beschrijven we een pre-klinisch diermodel voor het bestuderen van de pathofysiologie van ischemie-reperfusie letsel in reconstructieve microchirurgie. Dit gratis Skin flap model op basis van de oppervlakkige caudal epigastrische vaten in de rat kan ook de evaluatie van verschillende therapieën en verbindingen mogelijk maken om schade door ischemie-reperfusie letsel te neutraliseren.

Abstract

Ischemie-reperfusie letsel is de belangrijkste oorzaak van klep falen in reconstructieve microchirurgie. De rat is het voorkeur preklinisch diermodel op vele gebieden van biomedisch onderzoek vanwege de kosteneffectiviteit en de vertaling ervan naar de mens. Dit protocol beschrijft een methode om een preklinisch vrij huid flap model te creëren bij ratten met ischemie-reperfusie letsel. Het beschreven 3 cm x 6 cm rat vrije huid flap model is gemakkelijk te verkrijgen na de plaatsing van verschillende vasculaire ligaturen en het gedeelte van de vasculaire pedile. Dan, 8 h na de ischemische belediging en voltooiing van de microchirurgische anastomose, de vrije huid flap ontwikkelt de weefselbeschadiging. Deze letsel-gerelateerde schade aan ischemie-reperfusie kan in dit model worden bestudeerd, waardoor het een geschikt model is voor de evaluatie van therapeutische middelen om dit pathofysiologisch proces aan te pakken. Bovendien worden twee belangrijke bewakingstechnieken beschreven in het protocol voor de beoordeling van dit diermodel: transittijd echografie en laserspikkel contrast analyse.

Introduction

Microchirurgie is uitgegroeid tot een gemeenschappelijke chirurgische techniek voor reconstructie die het mogelijk maakt voor interventies (bv. vrije weefsel overdrachten) om complexe weefsel defecten te herstellen, replantation van geampuleerde ledematen, en zelfs samengestelde weefsel allotransplantaties.

Microchirurgische reconstructies zijn ideaal voor een breed scala aan defecten veroorzaakt door traumatische verwondingen, brandwonden of oncologische resecties. Echter, er is een laag percentage van de vrije flap falen, waaronder ischemie-reperfusie (I/R) letsel is een van de belangrijkste verantwoordelijke factoren. Alle microchirurgisch overgedragen weefsels doorstaan een verplichte periode van ischemie gevolgd door het reperfusie. Deze periode van primaire ischemie wordt meestal goed verdragen; het succespercentage van de microchirurgische ingrepen overschrijdt dus 90%^1,2. Slechts 63,7% van de kleppen die een chirurgische revisie vereisen, kan echter volledig worden opgeslagen³. Bovendien, in gevallen van herplantage van vinger avulsion verwondingen, het succespercentage is 66%⁴; en in gevallen van samengestelde weefsel allotransplantatie lijden I/r letsel, afwijzings percentages worden verhoogd sinds de I/r letsel activeert aangeboren immuniteit^5,6.

Daarom is de studie van dit pathofysiologisch fenomeen van belang. Diermodellen zijn essentieel voor het onderzoeken van fysiologische mechanismen en het beoordelen van nieuwe therapieën voordat het kan worden toegepast op mensen⁷. De anatomie van het vaartuig en de fysiologische gelijkenissen tussen ratten en mensen maken ratten tot een ideaal model voor het onderzoek van biologische processen zoals I/R-letsel.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de creatie van een rat Free Skin flap model met I/R letsel, evenals verschillende mogelijkheden voor intra-en postoperatieve evaluaties. Het algemene doel van deze methode is om een nuttig preklinisch model te beschrijven om I/R-letsel en mogelijke behandelingen te bestuderen om de bijbehorende schade te verminderen.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische commissie van het minimaal invasieve chirurgie centrum van Jesús Usón en de welzijns richtlijnen van de regionale overheid die gebaseerd zijn op Europese wetgeving.

1. presurgische en chirurgische voorbereiding

1. Huis Wistar ratten met een gewicht van 290 – 350 g in kooien bij 22 – 25 °C met gratis toegang tot voedsel en water. Acclimate voor 1 week voorafgaand aan de operatie om stress-geïnduceerde problemen te voorkomen.
2. Plaats een rat in een anesthetische inductie kamer, lever 5 minuten zuurstof (0,5-1 L/min) en gebruik een vaporizer om 5% Sevofluraan te leveren om anesthesie te induceren.
3. Neem de rat uit de kamer zodra anesthesie wordt geïnduceerd. Plaats het inhalatie gezichtsmasker op de rat en zorg voor een debiet van 2% Sevofluraan om anesthesie te handhaven. Controleer het gebrek aan reactie op een teen pinch.
4. Gebruik een oogbeschermingzalf om het drogen van het hoornvlies en beschadiging te voorkomen.
5. Bewaak het dier onder algemene verdoving als volgt: plaats een rectale thermometer (35,9 – 37,5 °C), Controleer de kleur van het slijmvlies en plaats een knaagdieren puls-Oximeter om te controleren op de verzadiging van de O₂ (> 95%) en hartslag (250 – 450 BPM).
6. Gebruik een warmte-ondersteuning (elektrische verwarming pads of circulerende water dekens) om hypothermie te voorkomen en verbetering van de post-procedurele anesthesie herstel.
7. Injecteer 5 mL warme subcutane fysiologische zoutoplossing om de juiste hydratatie te behouden.
8. Bieden pijnstillende en ontstekingsremmende geneesmiddelen (Meloxicam 1 mg/kg/dag) en profylactische antibiotica (enrofloxacine 7,5 mg/kg/dag) subcutaan vóór de ingreep en gedurende 5 dagen postoperatief.
9. Scheer de buik-en inguinale gebieden van het dier.
10. Breng actuele Povidon-jodium, gevolgd door 70% ethanol. Bedek het dier met een steriele Drape.

2. gratis huid klep model chirurgie

1. Teken met een chirurgische marker een flap van 3 cm x 6 cm die overeenkomt met een van de 6 cm zijden met de buik middenlijn. Vervolgens, maak een 6 cm huid incisie op de middenlijn van de buik en twee loodrecht 3 cm incisies in het bovenste en onderste deel van de 6 cm middellijn incisie.
2. Om te beginnen met het ontleden van de ontworpen huid flap van 3 cm x 6 cm, gebruikt u een schaar en een Adson-tang om de klep (in plaats van een scalpel) te verhogen vanwege de mobiliteit van de huid.
3. Trek voorzichtig de flap van het schedel gebied naar het caudale gebied om te helpen met de dissectie en Identificeer de epigastrische pedile omringd door het overvloedige losse bindweefsel.
4. Ontleden de klepsteel zonder hem aan te raken of door de adventitia zo weinig mogelijk te grijpen om beschadiging van de wand van het vat te voorkomen.
5. Gebruik 8/0 nylon hechtingen om te occluden door middel van ligaturen de proximale caudal femorale vaten, laterale circumflex femorale vaten en onderhoudende bloedvaten. Daardoor wordt de perfusie van de flap geleverd door de femorale slagader en gaat direct door de oppervlakkige caudal epigastrische slagader, terwijl de veneuze drainage wordt uitgevoerd door de oppervlakkige caudale epigastrische ader naar de femorale ader.
6. Klem de vasculaire pedile en snijd het vervolgens om te beginnen de 8 h ischemie periode. Gebruik tijdens de procedure elektrische dekens om de temperatuur te behouden. Twee injecties van 5 ml warme (25 °C) 0,9% zoutoplossing worden subcutaan toegediend. De eerste toediening wordt uitgevoerd 2 h na het begin van de procedure; en de tweede aan het einde van de procedure om een goed herstel van het dier te verkrijgen.
7. Gebruik gehepariniseerd zoutoplossing (100 U/ml) om de flap te parfuseren en het stagnerende bloed uit de microcirculatie te verwijderen.
8. Gebruik 10/0 nylon hechtingen om de microchirurgische anastomoses uit te voeren.
9. Na 8 h van ischemie, reparfuseer de flap door het verwijderen van de microvasculaire klemmen en controleer de vasculaire doorgankelijkheid zoals hieronder beschreven.

3. intraoperatieve beoordeling

1. Voer een handmatige test van de testen uit (lege en navul test) voor de ader en slagader. Om dit te doen, gebruik twee microchirurgische Tang, plaats ze distale aan de anastomose en voer het melken. Laat eerst de dichtstbijzijnde Tang naar de anastomose-site. Als de bloedstroom voortduurt nadat een vasculaire sectie is geleegd, dan is de anastomose patent.
2. Beoordeel de bloedstroom met behulp van een transit-time ultrasone flowmeter en microchirurgische sondes.
   1. Meet de diameter van de stekel vaten om de juiste maat voor de stromings voelers te kiezen.
      Opmerking: Een 0,7 mm stroom sonde kan schepen van 0,4 mm tot 0,7 mm meten; een 1,0 mm stroom sonde kan schepen van 0,7 mm tot 1,0 mm meten; een 1,5 mm stroom sonde kan schepen van 1,0 mm tot 1,5 mm meten.
   2. Plaats het doelvat in het Ultrasone detectie venster (tussen de reflector en de transducers) van de stromings sonde om het debiet volume te kwantificeren.
      Opmerking: Houd de sonde neutraal op het vlak van het vat, om elke spanning of trekken te voorkomen.
   3. Controleer de kwaliteit van de akoestische koppeling door te observeren dat alle staven groen op het display zijn.
      Opmerking: Als het moeilijk is om een goede akoestische koppeling te krijgen, gebruik dan topisch ultrasone gel of fysiologische zoutoplossing.
   4. Wanneer een goede koppeling wordt bereikt en het vat zonder spanning in het akoestische venster wordt geplaatst, klikt u op de opname knop op het display om de gegevens op te slaan.
      Opmerking: Om een betrouwbare en correcte meting te verkrijgen, moet u ervoor zorgen dat het golfvorm patroon voortdurend herhaalbaar is.
3. Eenmaal gedaan, gebruik Polyglycolic acid (PGA) 4-0 absorbabele gevlochten hechtingen (16mm 3/8 driehoekige naald) om de huid te sluiten. Gebruik een eenvoudig onderbroken patroon om de sterkte en weefsel positie te behouden als een deel van de hecht wordt gebeten door de rat postoperatief.
4. Evalueer de microcirculatie van de flap met behulp van laser spikkel contrast analyse (Lasca).
   1. Maak een nieuwe opname voor elk dier en voor elke follow-up van de studie. Klik hiervoor op bestand/nieuwe opname. Er wordt een nieuw venster geopend en het deelvenster Setup wordt weergegeven. Bewerk vervolgens de informatie van de projectnaam, het onderwerp, de operator en de opname naam.
   2. Voor maximale reproduceerbaarheid Standaardiseer de volgende parameters: werkafstand, meetgebied, puntdichtheid, framesnelheid en omgevingslicht.
      1. Pas de werkafstand aan door de laser in relatie tot het weefsel te verplaatsen. Zoom in of uit de laserkop naar het weefsel van belang. Klik op installatiekopie instellenom de gemeten waarde te controleren. Hier, ingesteld op 12,0 cm.
      2. Standaardiseer het meetgebied door de gewenste breedte en hoogte in te voeren bij het instellen van de afbeelding. De ontworpen flap meet 3 cm x 6 cm. Selecteer voor deze meting een breedte van 4,0 cm en een hoogte van 7,0 cm om wat extra ruimte te hebben.
      3. Stel de puntdichtheid zo hoog in de installatiekopiein. Hoog, gemiddeld en laag zijn de drie opties.
   3. Selecteer bij de installatie kopie vastleggen de frame snelheid (10 afbeeldingen/s) voor de opname en de duur (1 min) van de opname.
      Opmerking: Dezelfde omgevingslicht conditie hebben in de operatiekamer tijdens het werken of uitvoeren van de Beoordelingen.
   4. Klik op de knop opnemen om de opname te starten. Het configuratie scherm wordt vervangen door het Opnamepaneel. Gegevens worden automatisch opgeslagen. Maak momentopnamen tijdens de procedure om verdere vergelijking mogelijk te maken.
      Opmerking: De perfusie schaal kan worden gewijzigd om visualisatie te verbeteren (Klik op extra | Filters en Kleurschalen | Perfusie schaal | Handmatig 0-150), maar de gemeten perfusie waarden zullen niet worden beïnvloed. Voor en na de opname kunnen verschillende interessegebieden (ROIs) worden gecreëerd om de perfusie binnen hen te meten. Hier hebben we alleen het gebied van de geoefende flap (3 cm x 6 cm) geëvalueerd.
5. Gebruik ImageJ-software om de overlevings-en necrose-gebieden te meten.
   1. Zoek een liniaal aan de zijkant van de flap en neem de controle Foto's voor macroscopische metingen van het overlevings gebied van de flap.
   2. Open de gebruikersinterface van ImageJ om Foto's te evalueren. Klik op bestand en Open de te meten afbeelding.
   3. Selecteer rechte lijn in de gereedschapsset en teken een rechte lijn over 1 cm van de liniaal. Klik op analyseren | Stel schaal in en introduceer in het tekstvak voor bekende afstand de waarde van 1 cm.
   4. Klik op het gereedschap Veelhoek selecteren en teken de veelhoek lijnen over de flap om het levensvatbare gebied te berekenen. Uiteindelijk, klik op analyseren | Maatregel om de waarde van het gebied te verkrijgen.
6. Plaats een postoperatieve dressing op het dier vóór huisvesting om zelfverminking van het chirurgische gebied te voorkomen. Na de procedures worden dieren individueel ondergebracht in kooien, in een ruimte met temperatuurregeling (22 °C tot 25 °C).

4. postoperatieve beoordeling en weefsel bemonstering

1. Anesthetiseer de rat op 7 postoperatieve dagen voor de flap beoordeling en weefsel bemonstering door het volgen van dezelfde stappen eerder beschreven in dit Protocol (stappen 1,2 en 1,3). Controleer op de diepte van de anesthesie door het gebrek aan reactie op de teen pinch.
2. Fotografeer het chirurgische gebied om macroscopische metingen van de overlevings-en necrose gebieden van flap mogelijk te maken. Maak de postoperatieve macroscopische metingen volgens dezelfde stappen van de intraoperatieve beoordeling die eerder in het protocol zijn toegelicht (stap 3,5).
   Opmerking: Let op het gebruik van het gereedschap Veelhoek selecteren door de lijnen op de klep te tekenen die het levensvatbare gebied afbakent (gemeten in cm²). Het percentage van het levensvatbare gebied kan worden berekend als (cm² van levensvatbare oppervlakte/cm² van het totale flap gebied) × 100.
3. Evalueer de microcirculatie van de flap met behulp van de LASCA-techniek (stap 3,4) om perfusie verschillen te visualiseren en te kwantificeren
4. Na de macroscopische analyse, verwijder de 4/0 hechtingen en stijg de flap om de vasculaire pedile bloedstroom opnieuw te beoordelen met behulp van de transit-time echografie.
5. Voer weefsel bemonstering uit door de flap in de lengterichting te verdelen in twee delen van 1,5 cm x 6 cm.
   1. Dompel één deel in een biopsie container met 4% Paraformaldehyde bij kamertemperatuur voor verdere histologische analyses.
   2. Introduceer het andere deel van het weefsel in een cryopreservatie Tube, dompel het in vloeibare stikstof en invriezen de buis door het op-80 °c voor toekomstige moleculaire analyses op te slaan.
6. Euthanreren de rat onder algemene inhalatie anesthesie met behulp van een snelle intracardiale injectie van 2 M KCl/kg volgens de aanbevelingen van het ethisch comité.

Results

Onmiddellijk na de oprichting van de microchirurgische anastomoses, we verkregen hogere bloedstroom volumes dan de minimale stromen aanbevolen in de literatuur⁸; alle microchirurgische anastomosen waren dus patent 1 week na de operatie (Figuur 1).

Figuur 1: Transit-tijd echografie bloedstroom beoordeling. A) positie van de microchirurgische stromings sonde om de doorbloeding te beoordelen. B) het patroon en de kwantificering van de bloedstroom die zijn verkregen van de anastomoseerde vaten van de klepsteel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Observatie van de micro circulatoire deprivatie van bloedtoevoer tijdens de ischemische belediging was mogelijk met de Lasca-techniek, inclusief de onmiddellijke Hyper perfusie tijdens de flap reperfusie, en, perioperatief, de verschillende gebieden met minder perfusie en een hoger risico op postoperatieve flap necrose die inderdaad necrotische 7 dagen na het einde van de studie (Figuur 2).

Figuur 2: Laser spikkel contrast analysetechnologie. (A) visualisatie van micro circulatoire weefsel bloed perfusie in de fysiologische toestand. (B) visualisatie van micro circulatoire weefsel bloed perfusie tijdens ischemie. (C) visualisatie van micro circulatoire weefsel bloed perfusie onmiddellijk na reperfusie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

De klep overlevings gebied na 8 h van ischemie en de daaropvolgende reperfusie was rond 40%. Eerder gepubliceerde resultaten⁹ toonde statistisch significante verschillen wanneer dit model werd vergeleken met kleppen waar geen ischemische belediging werd toegebracht.

Discussion

Microchirurgische vrije weefsel overdrachten zijn uitgegroeid tot de methode van keuze voor het reconstrueren van grote gebreken. Een periode van ischemie optreedt tijdens dergelijke vrije weefsel overdrachten. Wanneer deze periode de tolerantie van het weefsel overschrijdt, kan I/R-letsel falen van de geoefende vrije flap⁹veroorzaken. De beschrijving van de methodologie om een kostenbesparend en translationeel preklinisch model te ontwikkelen om I/R-letsel in reconstructieve microchirurgie te bestuderen, kan bijdragen aan de studie van verschillende verbindingen om dit pathofysiologisch proces tegen te gaan.

In het diermodel beschreven, nadat de vasculaire ligaturen werden geplaatst en de vrije flap werd verhoogd, geen hindledemaat bloedstroom compromissen werden opgemerkt, noch pijn of slap. Zoals Kochi et al.¹⁰ beschreef, liet ons model ook drie neven routes door intramusculaire netwerken.

Bewaking van vrije kleppen is van groot belang¹¹, als berging is omgekeerd gerelateerd aan de duur tussen ischemie begin en de klinische herkenning. Voor dit doel moeten vrije kleppen intra-en postoperatief worden bestudeerd.

Intra-operatief, de veelgebruikte lege en navul test of de akoestische Doppler maken identificatie mogelijk, maar niet kwantificering van stroom aanwezigheid of afwezigheid via een anastomose¹². Om deze reden gebruikten we de transit-time echografie-technologie, een nieuwe methode waarmee chirurgen de bloedtoevoer van microchirurgische anastomosen¹³kunnen kwantificeren. In onze studie, alle microchirurgische anastomosen waren patent na 8 h van ischemische belediging en aan het einde van de studie. Onmiddellijk na de oprichting van de microchirurgische anastomoses, merkten we hogere bloedstroom volumes dan de minima aanbevolen in de literatuur⁸. Dit voorspelde goede pedile perfusie aan het einde van de studie, waaruit blijkt dat de resultaten niet werden beïnvloed door de micro-chirurgische techniek, maar eerder door de I/R blessure cascade van gebeurtenissen. Deze techniek is echter niet vrij van beperkingen. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen, moeten de microchirurgische voelers neutraal worden gehouden voor het vlak van het vat, niet trekken of spanning creëren. Een goede akoestische koppeling is nodig om een goed signaal te verkrijgen, dat kan worden bereikt met behulp van ultrasone gel of zoutoplossing. Een kwalitatief hoogwaardig koppelings signaal, dat door de apparatuur wordt geleverd, is een belangrijke parameter die tijdens de metingen moet worden overwogen.

We hebben LASCA gebruikt, ook wel bekend als laser spikkel contrast Imaging of laser spikkel Imaging, postoperatief¹⁴. Deze technologie vertegenwoordigt een waardevolle techniek voor semi-kwantitatieve real-time mapping van Flow binnen vrije kleppen zoals hier geverifieerd. Een van de beperkingen is dat de resultaten worden geleverd in willekeurige eenheden en niet direct gerelateerd aan de werkelijke stroomwaarden. In deze zin, verder onderzoek is nodig om te valideren van deze correlatie. Laser doppler-flowmetrie wordt vaker gebruikt, maar beperkt door het feit dat het alleen perfusie meet in een enkel punt in de flap, terwijl LASCA de detectie van regionale veranderingen in huidperfusie in de flap¹⁵mogelijk maakt. Bovendien werd in een recente studie¹⁶ aangegeven dat Lasca de regio's met een hoog risico op postoperatieve flap necrose kan vervoors pellen. Onze resultaten suggereren dat LASCA een veelbelovende techniek is voor de peri-en postoperatieve bewaking van vrije kleppen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AureFlo Unit	Transonic (Ithaca, USA)	N/A	Transit-time ultrasound flowmeter equipment
Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle)	S&T AG (Neuhausen, Switzerland)	RHR-SET. Art.No.00795	Set of microsurgical instruments
FLOW-i	Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden)	N/A	Anesthesia Delivery System
Micro clamps ABB-1	S&T AG (Neuhausen, Switzerland)	00408V	Double microvascular clamp with frame
Micro clamps ABB-11	S&T AG (Neuhausen, Switzerland)	00414V	Double microvascular clamp without frame
Micro clamps B-1	S&T AG (Neuhausen, Switzerland)	00396V	Sigle microvascular clamp
Nylon suture 10/0	Laboratorio Aragó (Barcelona, Spain)	19921	Microsurgical suture
OPMI Pentero 800	Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)	N/A	Surgical microscope
PeriCam PSI System	Perimed AB (Järfälla, Sweden)	N/A	Laser speckle contrast analysis equipment
Philips Intellivue MX450	Philips Medizin Systeme (Böblingen, Germany)	N/A	Monitoring system
Protector posoperatorio para roedores	Fundación Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón (Cáceres, Spain)	P201400272	Postoperative protector for rodents