ヒト化免疫不全マウスモデルにおける慢性、急性、再活性化HIV感染

Summary

ここでは、ヒト化マウスにおけるHIV感染のダイナミクスを研究するための3つの実験的アプローチについて説明する。最初は慢性感染イベントの研究を許可し、後者の2つは一次感染またはウイルス再活性化後の急性イベントの研究を可能にする。

Abstract

ヒト化NOD/SCID/IL-2受容体γ鎖^ヌルマウスは、感染症に関する基礎および前臨床研究で利用することができるヒト免疫のいくつかの特徴を再現する。ここでは、HIV感染のダイナミクスを研究するためのヒト化免疫不全マウスの3つのモデルについて説明する。1つ目は、新生児マウスにおけるCD34+造血幹細胞の肝内注射に基づいており、複数の血液およびリンパ組織閉じ込め細胞の再構成を可能にし、続いて参照HIV株による感染を可能にする。このモデルは感染後36週間まで監視することを可能にし、従って慢性モデルと呼ばれる。第2および第3のモデルは、末梢血単核細胞が成体マウスに腹腔内注射される急性および再活性化モデルと呼ばれる。急性モデルでは、健康なドナーからの細胞は腹腔内経路を介して生着し、続いて参照HIV株による感染である。最後に、再活性化モデルでは、抗レトロウイルス療法下でHIV感染ドナーからの細胞が腹腔内経路を介して生着する。この場合、マウスの薬物のない環境は、ウイルスの再活性化とウイルス負荷の増加を可能にする。ここで提供されるプロトコルは、HIV感染のヒト化免疫不全マウスモデルに対する従来の実験的アプローチを記述する。

Introduction

ヒト化NOD/SCID/インターロイキン(IL)-2受容体γ鎖ヌル(以下、huNS γ鎖^ヌル)マウスモデルは、感染症、自己免疫、癌の病因の研究、ならびに薬物およびヒト細胞ベース療法^の前臨床試験のために広く使用^{されている。}これらのマウスは、非肥満糖尿病(NOD)バックグラウンドに基づいており、IL-2受容体γ鎖軌跡(IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、およびIL-21の一般的なγ鎖)における細胞変異および標的突然変異を有し、マウスT、B、およびナチュラルキラー(NK)^細胞1の発達において重篤な障害を誘発する。従って、それらは、ヒト組織、ヒトCD34+造血幹細胞(HSC)、およびヒト末梢血単核細胞(PBMC)3、4、5の生着を支持する。加えて、幹細胞因子(SCF)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、およびIL-3などのヒト造血因子のトランスジェニック発現は、ヒト骨髄ロイド^{集団6、7、8}

Protocol

この研究では、メリーランド大学医学部の動物ケア・利用委員会(IACUC)によって審査され、承認されたプロトコルに従って、すべての動物のケアと手順が行われました(プロトコル番号1018017、1018018、および0318009)。

1. ヒトCD34⁺新生児マウスのHSC生着

1. 滅菌スクラブ、手袋、専用シューズ、靴カバー、マスク、ゴーグル、ヘア/ビアードボンネット、無菌ラボコートなど、使い捨て可能な個人用保護具(PPE)を常に使用してください。
2. 冷凍CD34^+HSCの1 x 10⁶を、認定バイオセーフティキャビネットの下でRPMI 1640メディア10%FBSの10 mLで再サスペンドし、滅菌状態を維持します。
3. 懸濁液の10°Lを使用してカウントし(予想される細胞数の存在を保証するために)、血球計におけるトリパンブルー除外染色によって細胞の生存率を確認する。
4. 室温(RT)で15分間400 x gで遠心分離機。上清を廃棄し、冷たい1x PBSで必要な濃度(50μLでCD34+HSCの1.4 x 10⁵⁾に再サスペンドします。注射するまで細胞を氷の上に置く。
5. 子犬(生後1~4日の性別のNS γ鎖^ヌル子....

Results

上述したように、14週後のHSC注射(慢性モデル)または3週間後のPBMC注射(急性および再活性化モデル)において、マウスはフローサイトメトリーによって生着したヒト細胞のレベルをスクリーニングするために血を流す。1)ヒトCD45+細胞再構成および2)CD4+およびCD8+T細胞の割合の評価のための代表的なゲーティング戦略を図1Aに示す。典型的には、生着のレベル(ヒトCD45+細胞のパーセンテージ)は、CD34+HSC注入後の10%〜80%の範囲であり、注射およびマウス株の経路に依存する(図1B)。PBMC注射後、生着量のレベル(ヒトCD45+またはCD3+細胞のパーセンテージ)は5%〜65%の範囲であり、マウス株間の差異も含まれる(図1B)。

Discussion

ヒト化のための免疫不全マウス株の開発において重要な進歩が達成されており、研究^目的1に応じて使用できる多くの異なる選択肢がある。ここで提供されるNS γ鎖^ヌルマウスおよび遺伝的に類似した株のヒト化のための一般的なプロトコルは、HIV感染を研究するための3つの異なるモデルで採用される。第1の実験アプローチでは、照射された新生児マウスは、臍帯血、胎児肝臓、または動員末梢^血3、21に由来し得るヒトCD34+HSCを注入する。NS γ鎖^ヌルマウスの適切な照射は、マウス骨髄および他の前駆細胞を排除し、ヒト細胞集団の効率的な再構成を可能にするので、重要なステップである。しかしながら、いくつかの報告は、^照射27なしで、異なるマウス株におけるヒト細胞の再構成を証拠としている。この点に関しては、NS γ鎖^ヌルマウスは放射線感受性であり、高γ照射は胸腺リンパ虫<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0. 5 ml 微量遠心チューブ	ネプチューン	3735.S.X
1. 5 ml 微量遠心チューブ	ネプチューン	3745.S.X
10 ml 血清ピペット	ステラ sceintific	VL-4090-0010
15 ml コニカルチューブ	ステラ scientific	T15-600
25 ml 血清ピペット	stellar sceintific	VL-4090-0025
5 ml 血清学ピペット	ステラ sceintific	VL-4090-0005
50 ml 円錐管	ステラ科学	T50-600
ACK 溶解バッファー	品質生物学的	118-156-101
アルコール準備パッド	フィッシャー科学	06-669-62	滅菌
抗ヒト CD3 クローン UCHT1	バイオレジェンド	300439	APC抱合
反ヒトCD4クローンOKT4	Biolegend	317420	AF488抱合型
抗ヒトCD45クローン 2D1	Biolegend	368522	BV421
VC1	Biolegend	344710	PerCP-Cy5.5抱合型
Biosafatyキャビネットレベル2			可能であれば、イソフルラン
を取り扱う際にexausteチメニーに接続ボンネット	フィッシャー科学	17-100-900	基本的な保護のための使い捨てキャップ
Cavicide	Metrex	13-1000	消毒剤
CD34+細胞	ロンザ	2C-101	単一のドナーから入手可能な多くのバイアル
遠心分離	ベックマン	65-6KR
クリアジャー	アマゾン	77977
綿ガーゼパッド	フィッシャーサイエンティフィ	22-415-468
使い捨てラボコートフィ	ッシャーサイエンティフィック	19-472-422
EDTAマイクロチューブグ	ライナーバイオワン	450480
フェイスマスクフィ	ッシャーサイエンティフィック	17-100-897
FACS溶解液	BD	340202
FBSプレミアムHI	アトランタバイオロジカルS1115OH
Ficoll	GE health one	17-1440-02
フローサイトメーター			FACS Aria II
フローサイトメトリーチューブを使用しました	Falcon	352054	5 ml ポリスチレンと丸底
HIV BaL			uQUANT コア施設で調製
ヒト PBMC			HIV 陽性および陰性 ボランティア
赤外線保温パッド	Venet scientific	DCT-25	小動物用仮治療用温暖パッド
Isentress (Raltegravir)	Merck	NSC 0006-0227061	ヒト免疫不全ウイルス(HIV)を治療するための抗レトロウイルス薬-インテグラーゼ阻害剤
イソフルラン	ヘンリー・シャイン	NDC 11695-6776-2
Mark I 照射器			大学所属機器メリーランド州
マイクロピペット
微量遠心分離機	Eppendorf
Mouse イヤータグ	National Band &タグ会社	1005-1L1
Natelson 採血チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	02-668-10
NOG-EXL	タコニック	HSCFTL-13395-F
NSG マウス	ジャクソン	5557	CD34 生着のための妊娠女性と PBMC 生着のための若年
NSG-SGM3	ジャクソン	13062
パラホルムアルデヒド 16%	電子顕微鏡科学	15710
PBS 1X pH 7.4	Gibco	100-10-023
シャー	レ フィッシャー科学	08-757-28
Quantistudio qPCRマシン	Thermo	QS3
試薬リザーバー	Costar	4870
RPMI media 1640 1X	Gibco	11875-093
シューカバー	フィッシャーサイエンティフィック	17-100-911
滅菌使い捨て手袋	Microflex	SUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix	Invitrogen	10080-400	cDNA synthesis
シリンジ 28-G x 1/2	BD	329-461
シリンジ 29-G x 1/2	BD	324-702
Truvada (Emtricitabine およびテノホビル	ギリア	ドNDC 61958-0701-1	ヒト免疫不全ウイルス(HIV)-ニクレオシドアナログ転写酵素阻害剤を治療するための抗レトロウイルス薬
パンブルー	シグマ	T8154	細胞数と生存率
Vick Vaporub	の健康	43214	メントールとユーカリに基づく軟膏
分子生物学グレード	生物学的	351-029-131