Summary
Dit systematische protocol beschrijft een nieuw diermodel van posttraumatische epilepsie na repetitief licht traumatisch hersenletsel. Het eerste deel details stappen voor traumatisch hersenletsel inductie met behulp van een gewijzigd gewicht daling model. Het tweede deel geeft instructies over de chirurgische aanpak voor single- en multi-channel elektro-encefalografische data-acquisitiesystemen.
Abstract
Traumatisch hersenletsel (TBI) is een belangrijke oorzaak van verworven epilepsie. TBI kan leiden tot een brandpunts- of diffuus hersenletsel. Focal eerletsel is een gevolg van directe mechanische krachten, soms penetreren door de schedel, het creëren van een directe laesie in het hersenweefsel. Deze zijn zichtbaar tijdens de beeldvorming van de hersenen als gebieden met kneuzing, snijwond en bloeding. Focale laesies veroorzaken neuronale dood en glialittekenvorming en zijn aanwezig in 20%−25% van alle mensen die een TBI oplopen. In de meeste Gevallen van TBI wordt letsel echter veroorzaakt door versnellingsvertragingskrachten en daaropvolgende weefselafhoorwerken, wat resulteert in niet-focale, diffuse schade. Een subpopulatie van TBI-patiënten blijft posttraumatische epilepsie (PTE) ontwikkelen na een latentieperiode van maanden of jaren. Momenteel is het onmogelijk om te voorspellen welke patiënten PTE zullen ontwikkelen, en aanvallen bij PTE-patiënten zijn een uitdaging om te controleren, wat verder onderzoek noodzakelijk maakt. Tot voor kort was het veld beperkt tot slechts twee dier/knaagdiermodellen met gevalideerde spontane posttraumatische aanvallen, beide met grote brandpuntslaesies met enorm weefselverlies in de cortex en soms subcorticale structuren. In tegenstelling tot deze benaderingen werd vastgesteld dat diffuse TBI-geïnduceerde met behulp van een gewijzigd gewichtsvalmodel voldoende is om de ontwikkeling van spontane krampachtige en niet-krampende aanvallen in gang te zetten, zelfs bij afwezigheid van brandpuntslaesies of weefselverlies. Vergelijkbaar met menselijke patiënten met verworven posttraumatische epilepsie, dit model presenteert met een latentie periode na letsel voor het begin van de aanval. In dit protocol zal de gemeenschap worden voorzien van een nieuw model van posttraumatische epilepsie, waarin wordt beschreven hoe diffuse niet-lesional TBI kan worden veroorzaakt, gevolgd door continue langdurige video-elektroencephalografische diermonitoring in de loop van enkele maanden. Dit protocol zal de behandeling van dieren, de gewichtsvalprocedure, de elektrodeplaatsing voor twee acquisitiesystemen en de frequente uitdagingen die tijdens elk van de stappen van chirurgie, postoperatieve monitoring en gegevensverwerving worden ondervonden, detailleren.
Introduction
Elk jaar treft TBI naar schatting 60 miljoen mensen wereldwijd. Getroffen personen lopen een hoger risico op het ontwikkelen van epilepsie, die zich jaren na het initiële letsel kan manifesteren. Hoewel ernstige Tbs'jes gepaard gaan met een hoger risico op epilepsie, verhoogt zelfs milde TBI de kans van een individu op het ontwikkelen van epilepsie1,2,3,4. Alle TBI's kunnen worden geclassificeerd als focale, diffuse, of een combinatie van beide. Diffuus hersenletsel, aanwezig in veel, zo niet alle TBC's, is een gevolg van hersenweefsels van verschillende dichtheden scheren tegen elkaar als gevolg van versnelling-vertraging en rotatiekrachten. Diffuus letsel komt per definitie alleen in isolatie voor in mild/concussief niet-penetrerend hersenletsel, waarbij geen hersenletsels zichtbaar zijn op computertomografiescans5.
Er zijn momenteel twee kritieke problemen in de behandeling van patiënten die posttraumatische epilepsie (PTE) hebben of lopen. De eerste is dat zodra PTE zich heeft gemanifesteerd, aanvallen resistent zijn tegen beschikbare anti-epileptica (AED's)6. Ten tweede zijn AED's even ondoeltreffend in het voorkomen van epileptogenese, en er zijn geen effectieve alternatieve therapeutische benaderingen. Om dit tekort aan te pakken en betere therapeutische doelen en behandelingskandidaten te vinden, zal het nodig zijn om nieuwe cellulaire en moleculaire mechanismen aan de wortel van PTE6te verkennen.
Een van de prominente kenmerken van posttraumatische epilepsie is de latente periode tussen de eerste traumatische gebeurtenis en het begin van spontane, niet-uitgelokte, terugkerende aanvallen. De gebeurtenissen die zich voordoen binnen dit tijdelijke venster zijn een natuurlijke focus voor onderzoekers, omdat dit tijdvenster de behandeling en preventie van PTE helemaal mogelijk zou kunnen maken. Diermodellen worden meestal gebruikt voor dit onderzoek omdat ze verschillende voordelen bieden, niet de minste daarvan is dat continue monitoring van menselijke patiënten zowel onpraktisch als kostbaar zou zijn over een dergelijke potentieel lange tijdspanne. Bovendien kunnen cellulaire en moleculaire mechanismen aan de wortel van epileptogenese alleen worden onderzocht in diermodellen.
Diermodellen met spontane posttraumatische aanvallen en epilepsie hebben de voorkeur boven modellen waarbij aanvallen na TBI worden geïnduceerd door minder fysiologisch relevante middelen, zoals door chemoconvulsants of elektrische stimulatie acuut, chronisch of door aanmaak. Spontane posttraumatische epileptische aanvalsmodellen testen hoe TBI het gezonde hersennetwerk wijzigt dat leidt tot epileptogenese. Studies met behulp van extra stimulatie na TBI beoordelen hoe blootstelling aan TBI de aanvalsdrempel vermindert en de gevoeligheid voor aanvallen beïnvloedt. De voordelen van diermodellen met chemische aanvallen of elektrische stimulatie zijn het testen van de specifieke mechanismen van refractoriness aan AED's en de werkzaamheid van bestaande en nieuwe AED's. De mate van relevantie en vertaling van deze gegevens naar de mens kan echter dubbelzinnig zijn7 als gevolg van het volgende: 1) inbeslagnemingsmechanismen kunnen verschillen van die welke alleen door TBI worden veroorzaakt; 2) niet al deze modellen leiden tot spontane aanvallen7; 3) laesies gecreëerd door het convulsieve middel zelf, met de canule die nodig is voor de levering ervan, of door het stimuleren van elektrode plaatsing in dieptestructuren (bijvoorbeeld de hippocampus of amygdala) kan al leiden tot verhoogde inbeslagneming gevoeligheid en zelfs hippocampal epileptiform veld potentials7. Bovendien produceren sommige convulsieve middelen (d.w.z. kaionzuur) directe hippocampallaesies en sclerose, wat niet typisch is na diffuse TBI.
Tot voor kort bestonden er slechts twee diermodellen van posttraumatische epilepsie: gecontroleerde corticale impact (CCI, focal) of vochtpercussieletsel (FPI, focal en diffuus)8. Beide modellen resulteren in grote brandpuntslaesies naast weefselverlies, bloeding en gliosis bij knaagdieren8. Deze modellen bootsen posttraumatische epilepsie na die door grote brandpuntslaesies wordt veroorzaakt. Een recente studie toonde aan dat herhaalde (3x) diffuus TBI voldoende is voor de ontwikkeling van spontane aanvallen en epilepsie bij muizen, zelfs bij afwezigheid van focale laesies9, het toevoegen van een derde knaagdier PTE-model met bevestigde spontane terugkerende aanvallen. Dit nieuwe model bootst cellulaire en moleculaire veranderingen veroorzaakt door diffuse TBI na, beter vertegenwoordigen van de menselijke bevolking met milde, gelijktijdige TBI's. In dit model, de latente periode van drie weken of meer voor het begin van de aanval en de opkomst van de late, spontane, terugkerende aanvallen maakt het mogelijk om het onderzoeken van de onderliggende oorzaken van posttraumatische epileptogenese, het testen van de werkzaamheid van preventieve benaderingen en nieuwe therapeutische kandidaten na de aanval begin, en heeft potentieel voor de ontwikkeling van biomarkers van post-traumatische epileptogenese, omdat ongeveer de helft van de dieren ontwikkelen posttraumatische epilepsie.
De keuze van het diermodel voor de studie van posttraumatische epilepsie hangt af van de wetenschappelijke vraag, het onderzochte type hersenletsel en welke instrumenten zullen worden gebruikt om de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen te bepalen. Uiteindelijk moet elk model van posttraumatische epilepsie zowel het ontstaan van spontane aanvallen na TBI als een eerste latentieperiode in een subgroep van TBI-dieren aantonen, omdat niet alle patiënten die een TBI oplopen, epilepsie ontwikkelen. Hiervoor wordt elektro-encefalografie (EEG) met gelijktijdige video-acquisitie gebruikt in dit protocol. Inzicht in de technische aspecten achter data-acquisitie hardware en benaderingen is van cruciaal belang voor nauwkeurige gegevensinterpretatie. De kritieke hardwareaspecten omvatten het type opnamesysteem, type elektroden (schroef of draadlood) en materiaal dat zij van worden gemaakt, gesynchroniseerde videoaanwinst (als deel van het systeem EEG of derde partij), en eigenschappen van het computersysteem. Het is absoluut noodzakelijk om de juiste acquisitieparameters in elk type systeem vast te stellen, afhankelijk van het studiedoel, eeg-gebeurtenissen van belang, verdere analysemethode en duurzaamheid van gegevensopslag. Ten slotte moet de methode van elektrodeconfiguratie (montage) worden overwogen, omdat elk van deze maatregelen en nadelen heeft en de interpretatie van de gegevens zal beïnvloeden.
Dit protocol beschrijft hoe het gewijzigde Marmarou-gewichtsvalmodel10,11 moet worden gebruikt om diffuus letsel te veroorzaken, wat resulteert in spontane, niet-uitgelokte, terugkerende aanvallen bij muizen, beschrijft chirurgische benaderingen om een single- en multi-channel continue, en gesynchroniseerde video-EEG te verkrijgen met behulp van monopolaire, bipolaire of gemengde montage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures beschreven in dit protocol werden uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Virginia Tech en in overeenstemming met de National Institutes of Health's 'Guide for the Care and Use of Laboratory Animals' .
1. Protocol inzake de behandeling van dieren
OPMERKING: Dit protocol is bedoeld om dieren die na aankomst bij een verkoper naar de faciliteit worden besteld te wenning en om te voorzien dat ze door de experimentator worden behandeld. Dit verbetert het welzijn van dieren door stress en angst te verminderen en vereenvoudigt bepaalde procedures die het hanteren van dieren vereisen, waaronder het induceren van de TBI, postoperatieve monitoring en het verbinden van het dier met het aankoopsysteem.
- Wanneer veel dieren worden ontvangen van de verkoper, oor-tag en willekeurig toewijzen aan een experimentele groep (TBI) of controlegroep (schijnoperatie) terwijl ze te combineren in kooien van 2-5 dieren. Huis TBI dieren los van schijndieren omdat sham muizen af en toe agressief handelen naar muizen die TBI ondergingen.
- Behandelingsdag 1 (24−48 uur na oor-tagging): Bereid een grafiek voor het loggen van dieroormerken, geboortedatum, data van behandeling, diergewicht op de behandelingsdagen, duur van de behandeling en een sectie voor opmerkingen en opmerkingen.
- Sluit het dier voorzichtig aan met beide handen. Pak het dier niet bij de staart omdat het afweermechanismen en een stressreactie veroorzaakt.
- Controleer en leg het oorplaatje van het dier op.
- Plaats het dier in de container op de weegschaal en leg het gewicht vast.
- Sluit het dier voorzichtig weer met beide handen aan en behandel het gedurende 1 min, waardoor het in de handen kan bewegen en verkennen. Voer dit uit over een bankje in de procedureruimte en wees voorzichtig om het dier niet op de grond te laten vallen.
- Na 1 min van behandeling, plaats het dier terug in zijn kooi.
- Herhaal stap 1.3−1.7 voor de andere dieren in de kooi.
- Behandelingsdag 2 (de volgende dag): Herhaal stappen 1.2−1.5.
- Sluit het dier voorzichtig weer met beide handen aan en behandel het gedurende 2 min, waardoor het in de handen kan bewegen en verkennen. Voer dit uit over een bankje in de procedureruimte en wees voorzichtig om het dier niet op de grond te laten vallen.
- Na 2 min van behandeling, plaats het dier terug in zijn kooi.
- Herhaal stap 1.10−1.11 voor de andere dieren in de kooi.
- Afhandeling dag 3 (de volgende dag): Herhaal stappen 1.2−1.5.
- Sluit het dier voorzichtig weer met beide handen aan en behandel het gedurende 4 min, waardoor het in de handen kan bewegen en verkennen. Voer dit uit over een bankje in de procedureruimte en wees voorzichtig om het dier niet op de grond te laten vallen.
- Na 4 min van behandeling, plaats het dier terug in zijn kooi.
- Herhaal stap 1.14−1.15 voor de andere dieren in de kooi.
- Afhandeling dag 4 (controledag, 1 week vanaf dag 1): Herhaal stappen 1.2−1.5.
- Sluit het dier voorzichtig weer met beide handen aan en behandel het gedurende 4 min, waardoor het in de handen kan bewegen en verkennen. Voer dit uit over een bankje in de procedureruimte en wees voorzichtig om het dier niet op de grond te laten vallen.
- Na 4 min behandeling, plaats het dier terug in zijn kooi.
- Herhaal stap 1.18-1.19 voor de andere dieren in de kooi.
OPMERKING: De controleafhandelingsdag test het behoud van het kalme gedrag na een driedaags behandelingsprotocol.
2. Gewichtsvalprocedure
- Plaats de muis in een inductiekamer. Stel de toevoer van zuurstof en vacuüm zowel op 1 L/min en het niveau van isoflurane gas op 3%−5%. Verdoven de muis voor 5 min.
- Haal de muis uit de inductiekamer en leg deze op een schuimpad. Test op het ontbreken van een reactie op een teen of staart knijpen.
- Een pijnstiller (0,1 mg/kg buprenorfine) onderhuids toedienen. Als de EEG-operatie diezelfde dag wordt uitgevoerd, dient u de buprenorfine onderhuids toe in combinatie met de niet-steroïde ontstekingsremmende carprofen (5 mg/kg).
- Voor of na de laatste botsing de natriumlactaatoplossing (3 μL per gram gewicht van het dier) onderhuids toedienen. De natriumlactaatoplossing kan worden gemengd met de pijnstillers voor snelle toediening in één injectie.
OPMERKING: De natriumlactaatoplossing bevat een mengsel van natriumchloride, kaliumchloride, calciumchloride en natriumlactaat in water. Deze stap helpt om vloeistoffen en elektrolyten te vervangen, waardoor herstel wordt hersteld. - Plaats de kop van de muis onder de gewichtsvalbuis(figuur 1A)en plaats een platte roestvrijstalen schijf (1,3 cm diameter, 1 mm dik en 880 mg gewicht) in het midden van de kop, tussen de lijn van de ogen en oren.
OPMERKING: Deze schijf verspreidt de impact over het oppervlak van de schedel(figuur 1B). - Verwijder de pin in de gewichtsdruppelbuis om de 100 g gewichtsstaaf los te laten van een hoogte van 50 cm. Om de schijnverwonding voor de controlemuizen te veroorzaken, verwijder de gewichtsstaaf van de buis om toevallige versie van de speld en de gewichtsdaling te verhinderen.
LET OP: Het hoofd van het dier moet plat worden geplaatst, zodat de staaf vrij op het gehele oppervlak van de schijf valt. - Plaats het onbewuste dier op zijn rug voor herstel op een verwarmingskussen bedekt met een steriele polylined absorberende handdoek. De hersteltijd van de rechterkantreflex (d.w.z. de tijd die de muis nodig heeft om zichzelf van zijn rug recht te zetten) kan worden gemeten als een uitlezing voor de tijd die onbewust wordt doorgebracht.
- Wanneer het dier weer bij bewustzijn komt, plaats het in een schone kooi die is opgewarmd op een verwarmingskussen, met herstelgel en een paar bevochtigde chowstukken om 45 minuten te herstellen. Zorg ervoor dat er voldoende strooisel is zodat de kooi niet oververhit raakt. Oververhitting van het dier kan net zo'n groot obstakel voor herstel blijken als waardoor de muis te koud wordt.
- Herhaal na 45 min twee maal stappen 2.1−2.8, waarbij stap 2.3 wordt weggenomen (d.w.z. toediening van pijnstillers en ontstekingsremmende geneesmiddelen).
- Laat de dieren 1,2 uur herstellen als op dezelfde dag een EEG-elektrodeimplantatieoperatie wordt uitgevoerd.
3. Chirurgische veldvoorbereiding voor implantatie van EEG-elektroden
LET OP: Autoclave de chirurgische instrumenten en schroeven voorafgaand aan de operatie. Reinig de chirurgische handschoenen door te spuiten en te wrijven met 70% ethanol voor en na het aanraken van het dier, niet-steriele materialen, en tussen de behandeling van de dieren. Steriliseer de chirurgische gereedschappen gedurende 2,3 min in de kraalsterilisator (zie Materiaaltabel)tussen dieren. Verander het steriele gordijn voordat u een nieuw dier in het stereotactische apparaat plaatst. Zorg ervoor dat het chirurgische veld alle benodigde componenten voor de operatie bevat (figuur 2). De afwezigheid van een invasieve chirurgische ingreep om de TBI in dit model te induceren heeft verschillende voordelen: 1) de implantatie van de elektroden is flexibel en kan worden uitgevoerd op dezelfde dag als TBI of na een bepaalde periode; 2) de hersteltijd van het dier sneller is; 3) de schedel intact blijft, waardoor meer oppervlakte en flexibiliteit voor het implanteren van elektroden.
- Verdoven de muis in 3%−5% isoflurane gas in een inductiekamer voor 5 min.
- Breng de muis van de inductiekamer naar het stereotactische apparaat en leg deze op een steriel gordijn op een verwarmingskussen met isofluranegas en vacuümbuizen die op de neuskegel zijn aangesloten.
- Houd de lichaamstemperatuur op 37 °C in de loop van de operatie. Plaats de temperatuursensor zo dat deze contact maakt met de borst- of buikwand van de muis.
- Bevestig het hoofd van het dier op zijn plaats met behulp van de oorstaven.
- Houd de anesthesie op 1,5%−3,5% isoflurane of op ~ 60 ademhalingen / min in het chirurgische vlak (zonder reactie op teen of staart knijpen).
- Breng een oogzalf aan op de ogen van het dier om ze gedurende de operatie gesmeerd te houden.
- Toedienen van een mengsel van pijnstillers (0,1 mg/kg buprenorfine) en de niet-steroïde anti-inflammatoire drug (5 mg/kg carprofen) in een enkele injectie onderhuids, tenzij de TBI eerder werd uitgevoerd op de dag, in welk geval het dier al pijnstillers en ontstekingsremmers ontvangen.
OPMERKING: Buprenorfine moet opnieuw worden toegediend als de tijd tussen de eerste TBI- en EEG-plaatsingsoperatie meer dan 8 uur bedraagt of als het dier na de eerste toediening tekenen van pijn 8 uur vertoont, maar het moet worden gegeven zonder de toevoeging van carprofen. - Toedienen natriumlactaat oplossing (3 μL per gram van het gewicht van het dier) onderhuids ter vervanging van vloeistoffen en elektrolyten in het dier.
OPMERKING: Als een operatie onmiddellijk na de TBI wordt uitgevoerd, moet deze stap goed worden getimed. Natriumlactaatoplossing moet om de 2 uur worden toegediend, terwijl het dier de procedures ondergaat en eenmaal na de operatie 2 uur na de vorige injectie. - Verwijder het haar van de hoofdhuid met behulp van een ontharingcrème.
- Voor het maken van de incisie, desinfecteren de huid van de hoofdhuid met povidone-jodium chirurgische antiseptische oplossing en 70% ethanol in afwisselende wattenstaafjes met steriele gaaspads in een cirkelvormige beweging 3x (20 s per oplossing elke keer).
- Met behulp van een scalpel, maak een rostral-caudal incisie op de hoofdhuid middellijn van net boven de ogen naar de achterkant van het hoofd. Deze methode van hoofdhuid opening heeft de voorkeur boven het afsnijden van de hoofdhuid af, als huid flappen kunnen worden verzegeld over of rond de EEG-cap zorgen voor meer stabiliteit.
OPMERKING: Bij de voorbereiding van de schedel voor implantatie van de 3-EEG headmount, het afsnijden van de hoofdhuid af is vereist, als de grootte van de headmount zal niet mogelijk voor sluiting van de huid flappen over de headmount. - Breid het gebied van incisie uit door kleine hemostats toe te passen op de geopende huidranden. Als er bloeden optreedt na de incisie, reinig dan met een steriel katoenen gaas of wattenstaafje.
- Verwijder voorzichtig het periosteum (d.w.z. het dunne membraan over het schedelbot) met een scalpelblad. Als er tijdens deze stap bloedingen optreden, drukt u op de bloedingsplaats met een steriel wattenstaafje totdat het stopt.
- Gebruik steriele wattenstaafjes om de schedel schoon te maken met waterstofperoxide, maar vermijd het aanraken van het zachte weefsel rond het blootgestelde schedelgebied. Herhaal deze stap totdat de schedel is gereinigd van een zacht weefsel en heeft een witachtige uitstraling.
- Droog de schedel met een steriel gaas of wattenstaafje.
OPMERKING: Stappen 3.12−3.15 zijn belangrijk voor de juiste fixatie van de elektroden en tandcement. Elk zacht weefsel, niet-dichtgeschroeid bloeden, en puin kan leiden tot infectie, onstabiele headmount fixatie, vervormd of afwezig signaal, en verlies van het implantaat binnen enkele dagen of weken na de operatie.
4. Plaatsing van elektrode
- Implanteer de enkele EEG (1EEG) kanaal headmount.
OPMERKING: Afkortingen in de stereotactische coördinaten vertegenwoordigen ruimtelijke relaties en specificeren de afstand in millimeters van het doel van de bregma bij een bepaalde oriëntatie op het hoofd van het dier: anterior-posterior (AP) en mediaal-laterale (ML). Dorsale-ventral is niet van toepassing in dit protocol omdat alle elektroden in de epidurale ruimte worden geplaatst in plaats van in een bepaalde structuur in de hersenen (Figuur 3). Vin+ is een actieve elektrode en Vin is de referentie-elektrode.- Gebruik een high-speed boor met een stalen bit (0,5 mm, ronde, 1/4 inch) bij ~ 5.000−6.000 rondes per min (rpm) om zes braamgaten (drie voor stabiliteitschroeven en drie voor elektroden) te maken met behulp van de meegeleverde stereotactische coördinaten12. Voor de twee voorste schroeven: AP = +1,5 mm, ML = ±1,5 mm; voor de ene achterste schroef: AP = -5,2 mm, ML = -1,5 mm; voor de grondelektrode: AP = -5,2 mm, ML = +1,5 mm; voor de opname-elektroden: AP = -2,3 mm, ML = ±2,7 mm, met Vin+ aan de rechterkant en Vin- naar links.
- Voeg drie schroeven toe voor een verbeterde stabiliteit van het hoofdstadium. Met behulp van een schroevendraaier draai je schroeven 1−1,5 x elk om stabiel in de schedel te worden bevestigd.
LET OP: Het plaatsen van de schroeven dieper zal de hersenen beschadigen. - Steek de 1EEG-kopstel in een stereotactische houderarm en plaats de kopstel, zodat de drie elektroden zich langs de schedelmiddel bevinden. In deze configuratie is de grondelektrode en de respectievelijke opening op de top van de headmount aan de achterkant, de Vin+ elektrode in het midden en de Vin-elektrode aan de voorkant. Een merk kan worden gemaakt op de headmount met een permanente marker.
- Buig elke elektrode 90° zodat het uiteinde van elke draad naar beneden wordt gebogen en boven het overeenkomstige braamgat wordt geplaatst. Meet vervolgens 1 mm lengte van het gedeelte van de draad dat nu loodrecht op het braamgat staat en snijd het overtollige eraf (figuur 3). Dit zorgt voor de plaatsing van de elektroden. De elektroden moeten nauwelijks het dura mater oppervlak raken.
- Laat de headmount zakken en pas alle drie de elektroden aan om het betreffende braamgat aan te passen. Voor epidurale opname moeten de elektroden boven of nauwelijks de dura mater worden geplaatst.
- Bereid tandcement voor op toepassing door een 1/2 schep poeder te mengen met verschillende druppels oplosmiddel. Gebruik een mengspatel en roer tot het uiteindelijke mengsel is stopverf-achtige, smakeloos maar kneedbaar, en stijf genoeg om goed te worden gecondenseerd wanneer geplaatst op de schedel van het dier.
- Breng tandcement mengsel voor alle schroeven en elektroden en wacht ~ 3 −5 min voor het te stollen. Zorg ervoor dat u het plastic voetstuk niet bedekt met tandcement, omdat het onmogelijk zal zijn om het dier met een tether met de commutator te verbinden.
- Laat de hemostats met de huid flappen en sluit de incisie door het aansluiten van de huid flappen rond de plastic voetstuk. Breng verschillende druppels weefsellijm aan (zie Tabel met materialen)om de huidflappen te verzegelen.
- Breng chloorhexidine antiseptisch aan op het gebied rond het implantaat om infectie te voorkomen. Als het dier langer dan 2 uur onder narcose is na de vorige injectie van natriumlactaatoplossing, gegeven tijdens de TBI-inductie, dient u een andere injectie onderhuids toe. Om een goede hydratatie van het dier te behouden, herhaalt u de injectie om de 2 uur die het dier onder narcose doorbrengt.
- Geef na de operatie een laatste injectie van natriumlactaatoplossing 2 uur na de vorige injectie. Als de operatie minder dan 2 uur lang is, dient u vanaf de eerste injectie de uiteindelijke terugwinningsdosis van de natriumlactaatoplossing 2 uur toe.
- Verwijder het dier uit het stereotactische apparaat en meet het gewicht van het dier na de EEG-operatie als referentie voor toekomstige monitoring. Door het implantaat zal het gewicht van het dier groter zijn dan voor de operatie.
- Plaats het dier in een schone kooi op een warm verwarmingskussen voor herstel.
- Implanteer de twee EEG en een EMG (2EEG/1EMG) kanalen headmount.
- Gebruik de bregma als oriëntatiepunt voor plaatsing van de headmount. Breng een kleine hoeveelheid weefsellijm aan (zie Tabel met materialen)op de onderkant van de 2EEG/1EMG-kopzet, vermijd de vier schroefgaten en plaats de 2EEG/1EMG-kopstel op het oppervlak van de schedel.
OPMERKING: Er zijn geen specifieke coördinaten voor de plaatsing van deze headmount. De kopsteunen zijn 8 mm lang en 5 mm breed, die het grootste deel van het schedeloppervlak bedekt. Het plaatsen van de kopbeugel met de voorrand van 3,0 mm vooraan in de bregma is optimaal en zorgt voor een goede signaalkwaliteit. Snelle handmatige plaatsing is noodzakelijk voordat de daling van weefsellijm kuren. Laat ongeveer 5 min voor weefsellijm volledig te genezen. - Gebruik een steriele 23 G naald om piloot gaten voor de schroeven te creëren door de vier openingen in de headmount. Om dit te bereiken, duw voorzichtig de naald en langzaam draaien totdat het puntje van de naald de schedel penetreert zonder de hersenen te beschadigen. Verwijder eventuele bloeden uit de piloot gaten met behulp van een steriele wattenstaafje.
- Steek de 0,10 in schroeven in de piloot gaten en draai ze totdat elk is bevestigd in de schedel. Dit kan oplopen tot de helft van de schroeflengte, maar niet de volledige lengte, omdat dit de dura mater en cortex zou beschadigen. Als de headmount zo is geplaatst dat er een gat is tussen het schedeloppervlak en de achterzijde van de headmount gebruik twee 0,12 in schroeven in het achterste deel.
- Maak kleine opening aan de zijkanten van de twee-component epoxy (zilver-epoxy) twin-pack zakje. Neem een dubbelzijdige spatel en gebruik elke kant om een kleine en gelijke hoeveelheid van elk onderdeel uit het zakje te scheppen en meng ze door elkaar. Gebruik slechts een kleine hoeveelheid voldoende voor een enkele operatie, omdat het mengsel stolt binnen 20 min. Seal de zijkanten van het zakje om te voorkomen dat drogen.
OPMERKING: De zilver-epoxy zorgt voor een goede elektrische contact tussen de schroef en kopbevestiging en verbetert de stabiliteit van de schroeven. - Breng een kleine hoeveelheid van dit mengsel tussen schroefkop en schroefgat, draai dan elke schroef totdat de kop rust op de basis van het implantaat. Zorg ervoor dat er geen zilver-epoxy is het maken van contact tussen de twee schroeven, omdat elke schroef dient als een individuele elektrode en, om een nauwkeurig signaal te garanderen, mag het geen contact maken met de andere schroef.
- Als het zilver-epoxy mengsel was misplaatst, is er een paar seconden tijd venster om zorgvuldig schep uit het overtollige om de verbinding te scheiden. Buig beide EMG-leads vanaf de achterste rand van de kopstel voorzichtig om de contouren van het hoofd en de hals van het dier te volgen en steek ze vervolgens in de nuchal-spieren.
- Bereid tandcement voor op toepassing door een 1/2 schep poeder te mengen met verschillende druppels oplosmiddel. Gebruik een mengspatel en roer tot het uiteindelijke mengsel is stopverf-achtige, smakeloos maar kneedbaar, en stijf genoeg om goed te worden gecondenseerd wanneer geplaatst op de schedel van het dier.
- Breng tandheelkundige cement mengsel dat de gehele headmount, terwijl het vermijden van het bedekken van de zes gaatjes, omdat dit zal het onmogelijk maken om de voorversterker aan te sluiten. Wacht ~3−5 min tot het cement stolt. Zorg ervoor dat de huid niet is verzegeld aan de headmount met tandcement.
- Laat de hemostats met de huid flappen en sluit de incisie door het aansluiten van de huid flappen rond de plastic voetstuk. Breng verschillende druppels weefsellijm aan om de huidflappen te verzegelen.
OPMERKING: Als de huidincisie langer is gemaakt om het rechttrekken van de EMG-draadlood mogelijk te maken, kan de huid worden verzegeld met weefsellijm of gehecht. Het afdichten van de huid met weefsellijm is meestal voldoende. Echter, als tijdens postoperatieve monitoring opening van de incisie wordt waargenomen, hechtingen worden aanbevolen in plaats daarvan. - Breng chloorhexidine antiseptisch aan op het gebied rond het implantaat om infectie te voorkomen. Toedienen natriumlactaat oplossing (3 μL per gram van het gewicht van het dier) onderhuids om vloeistoffen en elektrolyten te vervangen als het dier onder narcose voor langer dan 2 uur na de vorige injectie.
- Verwijder het dier uit het stereotactische apparaat en meet het gewicht van het dier na de EEG-operatie als referentie voor toekomstige monitoring. Door het implantaat zal het gewicht van het dier groter zijn dan voor de operatie.
- Plaats het dier in een schone kooi op een warm verwarmingskussen, met herstelgel en een paar bevochtigde chowstukken voor herstel.
- Gebruik de bregma als oriëntatiepunt voor plaatsing van de headmount. Breng een kleine hoeveelheid weefsellijm aan (zie Tabel met materialen)op de onderkant van de 2EEG/1EMG-kopzet, vermijd de vier schroefgaten en plaats de 2EEG/1EMG-kopstel op het oppervlak van de schedel.
- Implanteer een drie EEG-kanalen (3EEG) headmount.
- Gebruik high-speed boor met een stalen bit (0,5 mm, ronde, 1/4) bij ~ 5.000−6.000 rpm om zes braamgaten (drie voor stabiliteitschroeven en drie voor elektroden) te maken met behulp van de meegeleverde stereotactische coördinaten12. Voor grond- en gemeenschappelijke referentie voor EEG1 en EEG2: AP = 5,2 mm, ML = ±1,5 mm; voor EEG1 en EEG2: AP = -3,0 mm, ML = ±3,0 mm; voor onafhankelijk EEG3: AP =-1,4 mm, ML = ±1,5 mm.
- Plaats de zes schroefelektroden in de braamgaten.
OPMERKING: Het plaatsen van de schroeven dieper zal leiden tot aanzienlijke schade aan de hersenen. Schroefelektroden zorgen voor een betere stabiliteit van de kopbeugel. - Bereid tandcement voor op toepassing door een 1/2 schep poeder te mengen met verschillende druppels oplosmiddel. Gebruik een mengspatel en roer tot het uiteindelijke mengsel is stopverf-achtige, smakeloos maar kneedbaar, en stijf genoeg om goed te worden gecondenseerd wanneer geplaatst op de schedel van het dier.
- Breng tandcement mengsel over het gehele blootgestelde oppervlak van de schedel en elke schroef elektrode. Zorg ervoor dat de huid niet is verzegeld aan de headmount met tandcement. Wacht ~1−2 min tot het cement licht stolt. Het is niet nodig om te wachten tot volledige verharding voordat u doorgaat naar de volgende stap.
- Zet het soldeerbout aan om het op te warmen. Plaats de 3EEG headmount in een stereotactische houder arm.
LET OP: Plaats de headmount zodat de zes draadloodposities overeenkomen met de positie van de draadkabels van elke schroefelektrode. - Laat de headmount zakken zodat het ventrale deel bovenop het tandcement rust.
- Draai de draad van elk lood van elk van de schroefelektroden met de overeenkomstige draadlood van de headmount.
OPMERKING: Het verdraaien van de verkeerde draadleads maakt de interpretatie van gegevens ingewikkeld of onmogelijk. - Zorgvuldig trim de overtollige draad af met behulp van een schaar. Soldeer elk gedraaid ei voor een goede signaalgeleiding.
OPMERKING: Elk paar draden moet contact maken met een ander paar, anders worden de signaalkwaliteit en de interpretatie van gegevens in het gedrang gekomen. - Buig elk gesoldeerd paar draad leidt rond de headmount, het vermijden van contact tussen elk paar.
OPMERKING: Als de draadkabels niet kort genoeg zijn bijgesneden, kan het moeilijk zijn om ze rond de kopte zetten zonder een andere draad aan te raken. In dit geval, buig een paar eerst, bedek het met tandheelkundige cement mengsel, wacht ~ 1 −2 min te stollen, ga dan verder met het volgende paar op dezelfde manier. - Werk alle draad met tandcement af waardoor alleen het zwarte gedeelte van de headmount wordt blootgesteld.
OPMERKING: Wees voorzichtig om geen tandcementpoeder of mengsel toe te passen op de bovenkant van het blootgestelde gedeelte van de headmount, omdat vuil of cement in de gaten het contact blokkeren en zal leiden tot afwezigheid van signalen of lawaai. - Laat de hemostats los met de huidflappen. Breng chloorhexidine antiseptisch aan op het gebied rond het implantaat om infectie te voorkomen.
- Toedienen natriumlactaat oplossing (3 μL per gram van het gewicht van het dier) onderhuids om vloeistoffen en elektrolyten te vervangen als het dier is onder narcose voor langer dan 2 uur na de vorige injectie.
- Verwijder het dier uit het stereotactische apparaat en meet het gewicht van het dier na de EEG-operatie als referentie voor toekomstige monitoring. Door het implantaat zal het gewicht van het dier groter zijn dan voor de operatie.
- Plaats het dier in een schone kooi op een warm verwarmingskussen, met herstelgel en een paar bevochtigde chowstukken voor herstel.
OPMERKING: Waterstofperoxide helpt bij het verwijderen van het resterende zachte weefsel uit de schedel.
5. Dieren verbinden met het aankoopsysteem
- Kop het dier met beide handen om het uit de aankoopkooi te verwijderen en breng het naar een schoon gebied met een vlakke ondergrond, zoals een Animal Transfer Station (ATS).
- Pak voorzichtig de muis bij de huid van zijn rug. Pak het dier niet bij de staart, want dit veroorzaakt leed.
- Identificeer de opening in de EEG-kopstel die overeenkomt met de grondelektrode en match de respectievelijke pin van de tether voor een goede verbinding.
OPMERKING: Omgekeerde verbinding van de koppeling van de commutator met de dierlijke headmount zal resulteren in een andere meting dan de elektroden en mogelijk vervormde golfvormen. - Breng het dier terug naar de aankoopkooi en sluit het andere uiteinde van de tether (EEG System 1) of voorversterker (EEG System 2) aan op de commutator.
OPMERKING: Bij het aansluiten van de voorversterker (EEG System 2) op de tether van de commutator, overeenkomen met de witte merken op de uiteinden van beide tethers. Reverse-aansluiting zal resulteren in blijvende schade van de versterker en vereist reparaties door de fabrikant, die duur zijn. - Draai voorzichtig de tether die het dier verbindt met de commutator om ervoor te zorgen dat het mechanisme goed werkt en het dier zich vrij kan bewegen.
6. INSTELLINGEN voor gegevensverwerving van EEG
- Stel de acquisitieparameters van EEG System 1 in.
- Stel de samplingsnelheid in op 500 Hz; 5.000 te winnen; modus Norm 35 Hz; LPN uit. Stel het high pass-filter in op 0,5 Hz.
LET OP: 100 Hz (low pass) is ingebouwd en vereist geen handmatige invoer.
- Stel de samplingsnelheid in op 500 Hz; 5.000 te winnen; modus Norm 35 Hz; LPN uit. Stel het high pass-filter in op 0,5 Hz.
- Stel de acquisitieparameters van EEG System 2 in.
- Stel de samplingsnelheid in op 600 Hz; voorversterker winst 100; winst 1 (EEG1,2). Stel low pass-filter in op 100 Hz.
LET OP: 1 Hz (high pass) is ingebouwd en vereist geen handmatige invoer.
- Stel de samplingsnelheid in op 600 Hz; voorversterker winst 100; winst 1 (EEG1,2). Stel low pass-filter in op 100 Hz.
7. Instellingen voor het verkrijgen van videogegevens
- Acquisitieparameters instellen voor EEG-systeem 1.
OPMERKING: Er is een videoacquisitiesysteem van derden nodig voor het verkrijgen van gelijktijdige videogegevens.- Stel de framesnelheid in tussen 15 (minimaal aanbevolen) en 30 (maximaal beschikbaar) voor de juiste videokwaliteit. Stel de resolutie in op 640 x 640 pixels. Stel type compressie in op H.264H.
- Acquisitieparameters instellen voor EEG System 2.
OPMERKING: Dit EEG-systeem biedt een videosysteem en software die video- en EEG-gegevens synchroniseren in één bestand voor maximaal vier dieren (zie Tabel met materialen).- Stel de framesnelheid in tussen 15 (minimaal aanbevolen) en 30 (maximaal beschikbaar) voor de juiste videokwaliteit. Stel de resolutie in op 640 x 480 pixels. Stel het type compressie in op de WebM-bestandsindeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier beschreven protocol beschrijft de methode voor inductie van een diffuus letsel in isolatie (bijvoorbeeld bij afwezigheid een brandpuntslaesie) met behulp van een muismodel van repetitieve diffuse TBI(figuur 1). Figuur 1A toont het gewichtsvalapparaat en de componenten daarvan ( figuur1A, a1−a5) die worden gebruikt voor inductie van TBI in dit model en cruciale stappen tijdens de procedure (figuur 1B, b1−b5).
Kenmerken van dit model zijn het ontbreken van een brandpuntslaesie voor de hersenen als gevolg van de TBI, bewustzijnsverlies, een hoge overlevingskans, het ontstaan van late epileptische aanvallen (>1 week van de TBI), en spontane, niet-uitgelokte, terugkerende aanvallen in een subset van TBI muizen na een latentieperiode van ten minste drie weken na TBI.
Dit protocol toont gedetailleerde procedures voor het opzetten van een schoon chirurgisch veld(figuur 2), biedt een stapsgewijze aanpak voor het implanteren van verschillende elektrodearrays(figuur 3)en bevat een gedetailleerde handleiding voor het gebruik van twee verschillende EEG-acquisitiesystemen (zie de Tabel met materialen)voor het opsporen van aanvallen(figuur 4 en figuur 5)in dit model. Het spectrale vermogen van een typische aanval geeft de hoogste dichtheid aan in het frequentiebereik van 10 tot 40 Hz met een piek op 15 Hz (figuur 4). De meerderheid van de aanvallen bij muizen zijn krampachtig, met een gemiddelde duur van 12−15 s. Slechts een klein deel van de aanvallen is niet-krampachtig. Een grondige vergelijking van de voor- en nadelen van het gebruik van een van beide systemen wordt beschreven in de discussie sectie. Bovendien toont dit protocol de tijdigheid voor het begin van de inbeslagneming bij dieren na herhaalde gewichtsdaling TBI, waaruit de inbeslagneming bij sommige dieren blijkt (figuur 6) die het belang benadrukt van het verwerven van continue in plaats van intermitterende opnames, omdat dit zal zorgen voor een nauwkeurige gelaagdheid van dieren die na TBI spontane aanvallen ontwikkelen van dieren die dat niet doen. Belangrijk is dat dit protocol ook de voor- en nadelen van knaagdiermodellen van PTE en hun vermogen om een specifieke populatie van mensen na TBI te vertegenwoordigen bespreekt.
Figuur 1: Het muismodel van repetitieve diffuse TBI. (A) Gewichtdruppel apparaat. (a1) Gewichtdruppel buis. (a2) Een 100 g gewichtsstaaf. (a3) Pin die de staaf houdt. (a4) String om de staaf omhoog te verhogen als het veranderen van de hoogte of het verwijderen van de staaf van het gewicht drop buis. (a5). Schuimpad voor het plaatsen van het dier onder de gewichtsdruppelbuis. b) Weight drop procedure. b1) De roestvrijstalen schijf is in het midden van het hoofd tussen de lijn van de ogen en oren geplaatst. b2 en b3) Na visuele bevestiging dat het hoofd van het dier zich in de vlakke positie bevindt en het schuimpad wordt verplaatst, waardoor het hoofd van het dier onder de gewichtsvalbuis wordt geplaatst. b4) Release van pin met het gewicht staaf, het raken van het midden van de roestvrijstalen schijf. b5) Muis wordt geplaatst op een steriele handdoek onmiddellijk na de impact en verlies van bewustzijn wordt beoordeeld door het meten van de tijd die nodig is voor het dier om te herstellen en recht zelf. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Chirurgische veldvoorbereiding en EEG-elektrodeplaatsingsregeling. Autoclaved tools en noodzakelijke materialen voor chirurgie en elektrode implantatie worden voorbereid voordat het dier te verdoven om de beschikbaarheid van alle benodigde onderdelen te garanderen. Dit is een steriele zone en het is absoluut noodzakelijk om deze zone niet te besmetten met niet-steriele materialen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Stereotactische oriëntatiepunten en schematische weergave van elektrodeplaatsing met EEG-systeem 1 en 2. Het bovenste paneel toont de methoden voor het implanteren van de drie verschillende headmounts beschreven in dit protocol. (A) Single EEG-kanaal, bipolaire montage. (B) Twee EEG-kanalen met gemeenschappelijke referentie, bipolaire montage en één EMG-kanaal. (C) Drie EEG-kanalen, met behulp van monopolaire (kanaal 1−2) en bipolaire (kanaal 3) montage. Het onderste paneel toont de headmounts en schroeven geïmplanteerd als in het bovenste paneel. De drie soorten schroeven die in dit protocol voor twee doeleinden worden gebruikt: als stabiliteitsschroeven (EEG-systeem 1) of zowel stabiliteit als elektrode (EEG-systeem 2). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Spontane inbeslagname verkregen met behulp van EEG-systeem 1. Het bovenste paneel toont een spontane aanval in een muis 23 dagen na herhaalde gewichtdaling TBI met behulp van gegevens verkregen met behulp van 1EEG headmount. (A) Pre-ictal (pre-seizure) activiteit. b) Activiteit van Ictal (beslaglegging). (C) Post-ictal (post-inbeslagneming) depressie. Onderste paneel: De vermogensspectrumdichtheid wordt berekend met behulp van aangepast script en software (zie Tabel met materialen). Gemiddelde kracht = gemiddeld vermogen van het vermogensspectrum binnen het tijdperk (eenheden: V2/Hz). Mediane frequentie = frequentie waarbij 50% van het totale vermogen binnen het tijdvak wordt bereikt (eenheden: Hz). Gemiddelde frequentie = frequentie waarbij het gemiddelde vermogen binnen het tijdvak wordt bereikt (eenheden: Hz). Spectrale rand = frequentie waaronder een door de gebruiker opgegeven percentage van het totale vermogen binnen het tijdvak wordt bereikt (eenheden: Hz). Piekfrequentie = frequentie waarbij het maximale vermogen optreedt tijdens het tijdperk. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Spontane aanvallen die zijn opgedaan met EEG System 2. (A) Spontane niet-krampachtige (elektrografische) aanval bij een muis 65 dagen na herhaalde gewichtsval TBI. Gegevens verkregen met behulp van 2EEG/1EMG headmount. (B) Spontane krampachtige aanval bij een muis 97 dagen na gewichtdaling TBI. Gegevens verkregen met behulp van 3EEG headmount. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Incidentie van aanvallen bij muizen na herhaalde gewichtsdaling TBI. De vroegste inbeslagname werd waargenomen drie weken na de schade. Sommige dieren ontwikkelen clusters van aanvallen binnen dezelfde dag, gevolgd door enkele weken zonder aanvallen. Dieren werden tot vier maanden na TBI geregistreerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In tegenstelling tot CCI- en FPI-modellen die focale of combinatie van brandpunts- en diffuse verwondingen veroorzaken, maakt het model van repetitieve diffuse TBI, beschreven in dit protocol, de inductie van diffuus letsel mogelijk bij afwezigheid van brandpuntshersenletsel en vereist geen hoofdhuid- of schedelopeningen en de bijbehorende ontsteking. Een bijkomend voordeel van de afwezigheid van craniectomie in dit model is dat het niet alleen mogelijk maakt om de elektroden te implanteren voor chronische continue EEG-opname, maar ook de creatie van een uitgedund schedelvenster voor chronische in vivo 2-foton beeldvorming van de dieren vóór, onmiddellijk na, en herhaaldelijk voor dagen, weken, en zelfs maanden na TBI zoals beschreven in Shandra en Robel 201913.
Ongeacht welk diermodel wordt gekozen, de gekozen benadering van gegevensverwerving is een cruciaal element van een succesvolle en uitgebreide studie. Bij knaagdiermodellen van posttraumatische epilepsie is de frequentie van aanvallen laag14, variërend tussen 0,3−0,4 aanvallen per dag9,15, en de latente periode vóór de eerste aanval kan ergens duren van dagen of weken tot zelfs maanden na de eerste TBI-procedure. Ten slotte zal, in tegenstelling tot niet-traumatische modellen, die over een kortere periode een over het algemeen hogere incidentie van aanvallen hebben, gemiddeld slechts 9%−50% van de dieren met TBI spontane aanvallen hebben over een periode van maximaal zes maanden8,16. Dit suggereert dat zinvolle studies vereisen continue lange termijn video-EEG-opname.
Het overkoepelende doel van elk diermodel van TBI is om de verschillende vormen van TBI bij menselijke patiënten zo goed mogelijk te reproduceren, om de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan PTE beter te onderzoeken. Technieken in dit protocol zullen helpen om de ontdekking van therapeutische doelen, het testen van de werkzaamheid en verdraagbaarheid van nieuwe preventieve en therapeutische kandidaten, en de ontwikkeling van betrouwbare biomarkers of voorspellers van epilepsie na TBI.
Mogelijke uitdagingen tijdens de gewichtsvalprocedure
Omdat de kop niet in een stereotactisch frame is bevestigd, moet extra voorzichtig worden om een vlakke positie van de kop en metalen plaat te garanderen. Als de gewogen staaf de metalen plaat of het hoofd onder een hoek raakt of als het gewicht naar de zijkant van de muiskop glijdt, zullen de biomechanica van de verwonding verschillen, wat mogelijk resulteert in een milder of geen letsel. In het verleden werd de metalen plaat aan de schedel gelijmd om variabiliteit te minimaliseren. Echter, verwijdering van de metalen plaat en lijm uit de muisschedel na gewichtsdaling, zelfs indien uitgevoerd met zorg, veroorzaakte schade aan de hersenvliezen, wat resulteert in vasculaire schade en daaropvolgende schade aan het hersenweefsel, zelfs bij schijndieren. Verder vereist de incisie genezing, mogelijk met een perifere immuunrespons, die variabiliteit kan introduceren. Om deze redenen werd gekozen om het lijmen van de metalen plaat weg te laten aan de schedel. Dieren kunnen overlijden met herhaalde (d.w.z. 3x in dit protocol) letsel. Muizen met een lichaamsgewicht van minder dan 25 g mogen geen herhaalde effecten verdragen. Hoewel enkelvoudige verwondingen bijna nooit leiden tot sterfte, sterft tot 7% van de C57BL/6-dieren na herhaalde botsingen9. Bij sommige dieren kunnen motorische tekorten worden waargenomen. Deze tekorten manifesteren zich als achterste ledematen parese of gang afwijkingen. Dit is meestal een prognostische factor voor slecht herstel en het wordt aanbevolen dat het dier worden opgeofferd. Tekenen van pijn of nood zijn gewichtsverlies, slechte verzorging, uitdroging, verhoogde angst, lage of afwezige verkennende activiteit (hydrogel/herstel, chow en/of nestlet blijven onaangeroerd). Reddingsanalgesie (0,1 mg/kg buprenorfine) kan gedurende drie dagen van TBI gedurende drie dagen onderhuids worden toegediend om de pijn te verlichten en te voorkomen dat het dier het humane eindpunt bereikt. Onderhuidse natriumlactaatoplossing (3 μL per gram gewicht van het dier) kan twee keer per dag worden toegediend voor hydratatie. Dieren herstellen meestal binnen drie dagen na TBI. Het gebruik van een vijftraps body condition score (BCS) voor dierbewaking na experimentele procedures wordt aanbevolen. De stadia omvatten (1) Uitgemergeld (skeletstructuren zijn zeer prominent, wervels zeer gesegmenteerd); (2) Ondergeconditioneerd (segmentatie van de wervelkolom is duidelijk, rugbekkenbotten zijn gemakkelijk voelbaar); (3) Goed geconditioneerd (wervels en rugbekken zijn niet prominent voelbaar met lichte druk); (4) Overgeconditioneerd (wervelkolom is een doorlopende kolom, wervels voelbaar alleen met stevige druk); (5) Zwaarlijvig (muis is glad en omvangrijk, botstructuur verdwijnt onder vlees en onderhuids vet). Het humane eindpunt wordt bereikt wanneer BCS 1−2, 20% of meer gewichtsverlies bij een volwassen muis is in vergelijking met het pre-TBI-gewicht, symptomen van pijn of nood worden niet verlicht door pijnstillers, tekenen van zelfverminking, symptomen van uitdroging, onderkoeling, aanwezigheid van neurologische tekorten (abnormale gang of motorische parese). Er moet rekening worden gehouden met verschillende mogelijke uitkomsten van de toediening van stoffen. Buprenorfine geïnjecteerd onderhuids bereikt de eerste piek van zijn pijnstillende effect op 10 min na injectie17. De eerste impact vindt plaats seconden nadat buprenorfine is toegediend, wat suggereert dat de eerste meting van de juiste tijd waarschijnlijk niet zal worden beïnvloed. Dit kan echter niet volledig worden uitgesloten als variabele. Daarom wordt onderzoekers geadviseerd om hun eigen oordeel uit te oefenen. Als de gewichtsvalprocedure wordt gevolgd door stereotactische chirurgie en carprofen wordt toegediend, is het belangrijk op te merken dat carprofen een ontstekingsremmend middel is dat de incidentie van aanvallen kan beïnvloeden, vandaar dat onderzoekers worden geadviseerd om het gebruik ervan zorgvuldig te overwegen.
Mogelijke uitdagingen tijdens de operatie
Het risico op besmetting of infectie zal worden verminderd met het gebruik van 70% ethanol, maar het zal niet resulteren in steriele omstandigheden. Als alternatief kunnen steriele chirurgische handschoenen worden gebruikt. Het stereotactische apparaat is echter zelf niet steriel, dus elke handmatige manipulatie zal leiden tot verlies van de steriele toestand van de handschoenen. Daarom is spuiten met 70% ethanol vereist na contact met niet-steriel materiaal tijdens de operatie. Boren door de schedel in de hersenen creëert schade aan het hersenweefsel en kan overvloedige bloedingen veroorzaken. Het creëren van de braamgaten vergt extreme zorg. Het bevestigen van de handboor in de stereotactische arm en het geleidelijk verlagen van het heeft de voorkeur boven het boren van de gaten terwijl de boor handmatig. Elektroden en fixatieschroeven kunnen dieper zinken dan gepland, waardoor de dura mater (subduraal placement) of de cortex (corticale plaatsing) wordt verwond. Dit kan overvloedige bloedingen en een brandpuntslaesie veroorzaken. De experimentator moet oververhitting van het dier tijdens de operatie voorkomen. Als de temperatuursensor niet correct is bevestigd, behoudt deze niet de vereiste temperatuur van 37 °C, waardoor oververhitting, brandwonden en soms de dood van het dier als gevolg daarvan worden veroorzaakt. De ogen van het dier worden droog, geïrriteerd of beschadigd tijdens de operatie als het niet gesmeerd wordt zodra het dier in het stereotactische apparaat wordt geplaatst.
Postoperatief toezicht
Postoperatieve controle begint onmiddellijk na de procedure of operatie eindigt. Observeer het dier totdat het wakker wordt van anesthesie en kijk voor de aanwezigheid of afwezigheid van een operatie-gerelateerde complicaties, met inbegrip van bloeden of parese. Als bloeden wordt waargenomen van de onvolledige incisiesluiting, verananeer het dier, reinig de bloedingsplaats met chloorhexidine, voer wondsluiting uit zoals hierboven beschreven en breng het dier terug naar de herstelkooi. Ongeveer 1,2 uur na de operatie moet het dier volledig wakker zijn van anesthesie en zich vrij in de kooi bewegen zonder tekenen van parese of pijn. Het dier zal beginnen met het verzorgen van zichzelf, dat is de reden waarom het afdichten van de incisie nodig is om te voorkomen dat het dier het opent tijdens het verzorgen. Zodra het dier is hersteld, breng het naar de kooi / kamer die zal worden gebruikt voor EEG-gegevens verwerving. Hierdoor kan het dier wennen aan de nieuwe omgeving. Dit is vooral belangrijk voor lange termijn opname (maanden). De dierenkooi moet een herstelgel hebben (zie Tafel van Materialen),bevochtigde chow, een nestlet en een waterfles. Dit zal een goede terugwinning mogelijk maken en geeft het dier toegang tot voedingsstoffen en water. Blijf het dier dagelijks in de gaten houden. De beoordeling moet (a) visuele inspectie van het gedrag van dieren op tekenen van pijn of nood omvatten, met inbegrip van gewichtsverlies, slechte verzorging, verhoogde angst, lage of afwezige verkennende activiteit (hydrogel/herstel, chow en/of nestlet onaangeroerd blijven) en een goede genezing van het incisiegebied rond het EEG-implantaat; b) beoordeling van het BCS op tekenen van uitdroging en ondervoeding; c) Gewicht van het dier. Toedienen natriumlactaatoplossing (3 μL per gram gewicht van het dier) onderhuids als het dier tekenen van uitdroging vertoont (zie Materiaaltabel). Buprenorfine (0,1 mg/kg) onderhuids toedienen als het dier tekenen van pijn of nood vertoont. Als tekenen van pijn aanhouden buprenorfine kan worden toegediend om de 8 uur. Monitoring moet worden verhoogd tot twee keer per dag als een dier vertoont tekenen van pijn en / of nood. Laat het dier ten minste drie dagen herstellen na een EEG-operatie voordat het via een tether verbinding maakt met het aankoopsysteem. De humane eindpuntcriteria zijn hetzelfde als bij potentiële uitdagingen tijdens de bovenstaande gewichtsvalprocedure.
Voor- en nadelen van acquisitiesystemen en headmounts
Het belangrijkste voordeel van de EEG System 1 met een enkele EEG-kanaal headmount is de relatief lage kosten van de hardware, componenten en service. De eenvoudige en eenvoudige configuratie stelt gebruikers ook in staat om het systeem aan te passen aan hun voorkeuren. Elke differentiële versterker biedt één EEG-kanaal, hoewel verschillende differentiële versterkers met elkaar kunnen worden verbonden, waardoor het aantal kanalen voor elk dier toeneemt. In dit systeem werd één kanaalconfiguratie per dier gebruikt om chronische EEG-opnames op lange termijn van 20 dieren tegelijk te verkrijgen. Posttraumatische aanvallen worden meestal gegeneraliseerd, en met een bilaterale bipolaire montage van de elektroden is het gemakkelijk om dit soort epileptiform activiteit te detecteren. Het nadeel van deze aanpak is echter dat het onmogelijk is om focaliteit, lateralisatie of de voortplanting van epileptiform activiteit betrouwbaar te detecteren, omdat hiervoor verschillende kanalen nodig zijn. Een andere potentiële uitdaging kan de geluidsverontreiniging van het ene kanaal in de loop van de tijd zijn, waardoor het niet in staat is nuttige gegevens van het dier te verkrijgen. Dit kan worden overwonnen door het combineren van twee of meer differentiële versterkers, die het aantal kanalen per dier verdubbelt. Ten slotte zijn gegevens die zijn verkregen uit een enkel kanaal moeilijker te onderscheiden van potentiële artefacten, en epileptiform activiteit wordt het best ondersteund door video-opnamen van het gedrag van het dier. Om deze reden, alle opnames gecombineerd gesynchroniseerde continue video monitoring met EEG acquisitie. Een beperking van dit systeem en de software is dat het niet het video-acquisitiesysteem omvat, en daarom een aangepast systeem van derden vereist voor het verkrijgen van synchrone video.
Het grote voordeel van het EEG System 2 met multi-channel headmounts is de hoge kwaliteit van het signaal vanwege het voorfilteren van het verworven signaal door de voorversterker (zie Tabel met Materialen)voordat het door de commutator naar de versterker gaat. De versterkers in dit systeem maken het mogelijk om gegevens in drie kanalen in de volgende configuraties te verkrijgen: 2 EEG+1 EMG-kanalen of drie EEG-kanalen (zie Tabel met materialen). Dit zorgt voor de detectie niet alleen van gegeneraliseerde activiteit, maar ook, potentieel, focale epileptiform activiteit. Een ander groot voordeel is dat dit systeem speciaal is ontworpen voor dieronderzoek en daarom een video-opnamesysteem en software biedt die de EEG- en videokanalen voor maximaal vier dieren in één bestand kunnen synchroniseren, wat de analyse eenvoudiger en handiger maakt dan het EEG-systeem 1. Dit systeem is eenvoudig te gebruiken voor het verkrijgen van gegevens voor inbeslagneming en slaapanalyse zonder enige wijziging van het systeem, anders dan het type headmount dat wordt gebruikt. De 2EEG/1EMG headmount maakt het mogelijk om de elektroden alleen op vaste locaties te implanteren, vanwege de grootte en configuratie van de printplaat. De schroefelektroden met draadkabels in 3EEG-kopsteunen bieden flexibiliteit in het implanteren op de gewenste locatie met de mogelijkheid om monopolaire of bipolaire acquisitie te doen, afhankelijk van waar de referentie-elektrode wordt geplaatst. Echter, het implanteren van de 3EEG headmount vereist solderen, die meer stappen toevoegt aan de operatie en vereist extra voorzichtigheid en precisie. De verbindingstethers en voorversterkers zijn speciaal ontworpen voor kleine knaagdieren zoals muizen en onvolwassen ratten, en zijn dunne, lage gewichtskabels die weinig druk op het hoofd van het dier veroorzaken. Een nadeel van het systeem is de relatief hoge kosten van de hardware, software, video licentie, en componenten (dat wil zeggen, voorversterkers en headmounts).
Betekenis en kritieke stappen in de acquisitie van EEG-gegevens
De commutator heeft een roterend mechanisme, waardoor de tether kan draaien, afhankelijk van de richting van de beweging van dieren. Als dit mechanisme uitvalt, zal de verplaatsing van het dier worden beperkt, wat kan leiden tot verwijdering van de EEG-dop. Herhaalde chirurgie om nieuwe elektroden te plaatsen kan worden geprobeerd. Dit kan echter een uitdaging of onmogelijk zijn als het verwijderen van de vorige EEG-dop schade aan de schedel en de hersenen heeft veroorzaakt. De bemonsteringssnelheid voor de verwerving van EEG-gegevens moet ten minste 2−2,5 x de hoogste rentefrequentie zijn. Hogere bemonsteringspercentages resulteren in een hogere resolutie van de gegevens tegen de prijs van een toename van de bestandsgrootte, die moeilijk op te slaan en te verwerken kan worden wanneer continue opnames van meerdere dieren worden verkregen. Daarom is het noodzakelijk om de sampling rate te optimaliseren tot een niveau dat het mogelijk maakt het verkrijgen van de nodige gegevens zonder verlies van kwaliteit, terwijl het minimaliseren van bestandsgrootte.
Betekenis en kritieke stappen in het verkrijgen van videogegevens
Bij knaagdieren, zoals bij mensen, kan PTE zich manifesteren met een brede variabiliteit in de bijbehorende symptomatologie en elektrografische correlaten, waardoor het noodzakelijk is om een gelijktijdige video te verkrijgen tijdens de EEG-verwerving om de waargenomen EEG-gebeurtenissen goed te interpreteren en te classificeren. Interpretatie van EEG-gegevens bij afwezigheid van gesynchroniseerde video is bijzonder uitdagend wanneer één EEG-kanaal wordt gebruikt. In dit geval kan het moeilijk zijn om te bepalen of de EEG-golfvorm een artefact is, tenzij ander bewijs (video) de classificatie als een aanval ondersteunt. Bewegingsartefacten kunnen lijken op het elektrografische patroon van de aanval. Vandaar, video met of zonder EMG bevestiging is een vereiste. Terwijl video-opname wordt uitgevoerd tijdens zowel lichte als donkere cycli, kan de videokwaliteit niet altijd bevredigend en duidelijk zijn tijdens de donkere uren. Bovendien, als het dier wordt afgewend van de camera tijdens de ictal-achtige EEG-evenement, kan het een uitdaging zijn om zijn gedrag te beoordelen. In die gevallen kan het verkrijgen van een elektromyografie (EMG) signaal in aanvulling op EEG en video de uitdaging oplossen door informatie te verstrekken over de spieractiviteit tijdens mildere gedragsaanvallen (met lage motorische componenten) of om het gebrek aan dierlijke beweging te bevestigen tijdens afwezigheid-achtige spike-en-slow-wave lozingen op het EEG. De potentiële uitdagingen met het EMG-kanaal zijn vergelijkbaar met de uitdagingen met de EEG-kanalen, zoals geluidsverontreiniging, onjuiste plaatsing van elektroden of de elektroden die losraken (of oppervlaktecontact verliezen) gedurende de langere tijd van de opname. Het gebruik van video samen met EEG-analyse heeft twee doeleinden: om te bevestigen dat een EEG-gebeurtenis geen artefact is dat wordt veroorzaakt door de beweging van het dier (verkennend gedrag, drinken, kauwen, krabben, stretching, grooming of snelle/moeizame ademhaling) en om onderscheid te maken tussen krampachtige en niet-convulsieve aanvallen. Het gebruik van een gemodificeerde Racine-schaal om krampachtige of niet-krampachtige aanvallen te karakteriseren wordt aanbevolen. De stadia omvatten (0) Zuivere elektrografische inbeslagneming zonder enige identificeerbare motorische manifestatie; (1) Orofaciale automatismen en hoofdknikken; (2) Voorpoot klonische ruk; (3) Bilateraal voorpootclonus; (4) Voorpootklonen en grootbrengen; (5) Voorpoot clonus met opfok en vallen. Elk videokanaal moet duidelijk het hele oppervlak met het dier in de kooi, een etiket met een dier identificatienummer, waterfles tip, voedsel, en dieet / recovery gel. Gebruik een infraroodnachtbron om video-acquisitie tijdens de donkere uren te garanderen. (Sommige camera's hebben ingebouwde apparaten of vereisen mogelijk extra onderdelen. Zie de tabel met materialen). Pas het frame per secondesnelheid en beeldresolutie aan. De hogere framesnelheid en resolutie gaan ten koste van een grotere bestandsgrootte. De belangrijkste nadelen van het verkrijgen van video tijdens langdurige chronische continue experimenten zijn de noodzaak om zeer grote hoeveelheden gegevens op te slaan en de technische problemen die gepaard gaan met de verwerking van de grote bestanden. Ook moet worden gekeken naar de vaardigheid van de experimentator om de gedragsgegevens effectief te interpreteren samen met EEG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/Verenigde Staten en CURE op basis van een subsidie CURE ontvangen van het United States Army Medical Research and Materiel Command, Department of Defense (DoD), via het Psychological Health and Traumatic Brain Injury Research Program under Award No. W81XWH-15-2-0069. Ivan Zuidhoek wordt zeer gewaardeerd voor het proeflezen van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8209 | 0.10 inch long stainless steel |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8403 | 0.10 inch long with pre-soldered wire lead |
| 0.12" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8212 | 0.12 inch long stainless steel |
| 1EEG headmount | Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA | MS333/8-A/SPC | 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal |
| 2EEG/1EMG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8201 | 2EEG/1EMG channels |
| 3% hydrogen peroxide | Pharmacy | ||
| 3EEG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8235-SM-C | custom 6-Pin Connector for 3EEG channels |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| C57BL/6 mice | Harlan/Envigo Laboratories Inc | male, 12-16 weeks old | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | male, 12-16 weeks old | |
| Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day |
| Chlorhexidine antiseptic | Pharmacy | ||
| Dental cement and solvent kit | Stoelting Co., USA | 51459 | |
| Drill | Foredom | HP4-917 | |
| Drill bit | Meisinger USA, LLC, USA | HM1-005-HP | 0.5 mm, Round, 1/4, Steel |
| Dry sterilizer | Cellpoint Scientific, USA | Germinator 500 | |
| EEG System 1 | Biopac Systems, CA, USA | ||
| EEG System 2 | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | ||
| Ethanol ≥70% | VWR, USA | 71001-652 | KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof) |
| Eye ointment | Pro Labs Ltd, USA | Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies | |
| Fluriso liquid for inhalation anesthesia | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Hair removal product | Church & Dwight Co., Inc., USA | Nair cream | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Povidone-iodine surgical solution | Purdue Products, USA | 004677 | Betadine |
| Rimadyl/Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | |
| Solder | Harware store | ||
| Soldering iron | Weller, USA | WP35 | ST7 tip, 0.8mm |
| Stainless steel disc | Custom made | ||
| Sterile cotton swabs | |||
| Sterile gauze pads | Fisher Scientific, USA | 22362178 | |
| Sterile poly-lined absorbent towels pads | Cardinal Health, USA | 3520 | |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, USA | 1469SB |
References
- Christensen, J., et al. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373 (9669), 1105-1110 (2009).
- Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, Suppl 2 4-9 (2009).
- Ferguson, P. L., et al. A population-based study of risk of epilepsy after hospitalization for traumatic brain injury. Epilepsia. 51 (5), 891-898 (2010).
- Abou-Abbass, H., et al. Epidemiology and clinical characteristics of traumatic brain injury in Lebanon: A systematic review. Medicine (Baltimore). 95 (47), 5342 (2016).
- Management of Concussion/mTBI Working Group. VA/DoD Clinical Practice Guideline for Management of Concussion/Mild Traumatic Brain Injury. The Journal of Rehabilitation Research and Development. 46 (6), 1-68 (2009).
- Piccenna, L., Shears, G., O'Brien, T. J. Management of post-traumatic epilepsy: An evidence review over the last 5 years and future directions. Epilepsia Open. 2 (2), 123-144 (2017).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Ostergard, T., Sweet, J., Kusyk, D., Herring, E., Miller, J. Animal models of post-traumatic epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 272, 50-55 (2016).
- Shandra, O., et al. Repetitive Diffuse Mild Traumatic Brain Injury Causes an Atypical Astrocyte Response and Spontaneous Recurrent Seizures. Journal of Neuroscience. 39 (10), 1944-1963 (2019).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
- Paxinos, G., Keith, B. J., Franklin, M. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Science. (2007).
- Shandra, O., Robel, S. Imaging and Manipulating Astrocyte Function In Vivo in the Context of CNS Injury. Methods in Molecular Biology. 1938, 233-246 (2019).
- Pitkanen, A., Immonen, R. Epilepsy related to traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 11 (2), 286-296 (2014).
- Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscience. 140 (2), 685-697 (2006).
- Pitkanen, A., Bolkvadze, T., Immonen, R. Anti-epileptogenesis in rodent post-traumatic epilepsy models. Neuroscience Letters. 497 (3), 163-171 (2011).
- Gades, N. M., Danneman, P. J., Wixson, S. K., Tolley, E. A. The magnitude and duration of the analgesic effect of morphine, butorphanol, and buprenorphine in rats and mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 39 (2), 8-13 (2000).
