Method Article

환자 유래 췌장 선암 조직형 모델의 격리 및 특성 분석

DOI:

10.3791/60364

⸱

January 14th, 2020

 ,  , 
1Moores Cancer Center, University of California San Diego, 2Department of Surgery, Division of Surgical Oncology, University of California San Diego

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

췌장 덕트 선암의 환자 유래 오르가노이드 배양은 높은 충실도를 가진 상피 종양 세포 구획을 나타내는 급속하게 확립된 3차원 모형, 이 치명적인 악성에 번역 연구를 가능하게 합니다. 여기에서, 우리는 이 모형을 사용하여 관련 생물학 생물학 생물학 적인 생물학 적인 생물학 적인 생물학 적인 생물학 을 능력을 발휘하기 위하여 오르가노이드를 설치하고 전파하기 위하여 상세한 방법을 제공합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

췌장 덕트 선암 (PDAC)은 가장 치명적인 악성 종양 사이에 있습니다. 최근에는 이 질병의 3차원(3D) 모델링을 가능하게 하는 차세대 오르가노이드 배양 방법이 기술되고 있다. 환자 유래 오르가노이드(PDO) 모델은 수술 표본뿐만 아니라 작은 생검에서 분리될 수 있으며 배양에서 빠르게 형성될 수 있다. 중요한 것은, organoid 모형은 환자의 종양에서 검출된 병원성 유전 변경을 보존하고 환자의 처리 반응의 예측, 따라서 번역 연구를 가능하게 합니다. 여기서, 우리는 3D, 매트릭스 임베디드, 오르가노이드 모델을 연구하기 위해 조직 배양 워크플로우를 적응시키기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다. 우리는 1 차적인 PDAC 오르가노이드를 격리하고 전파하기 위한 방법 그리고 고려사항을 상세히 설명합니다. 또한 맞춤형 오르가노이드 미디어가 실험실에서 어떻게 준비되고 품질이 조절되는지 설명합니다. 마지막으로, 우리는 핵산 (DNA와 RNA)의 격리와 같은 오르가노이드 모형의 하류 특성화를 위한 실험 (DNA와 RNA), 및 약 시험을 기술합니다. 중요한 것은 우리는 연구 실험실에서 유기적 방법론을 구현하기위한 중요한 고려 사항을 제공합니다.

Introduction

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췌장 덕트 선암(PDAC)은 대부분의 환자에서 늦은 진단, 효과적인 치료법의 부족, 그리고 10% 미만으로 남아 있는 5년 전체 생존율이 낮은 치명적인질환이다. 환자의 20%만이 치료외과적 개입에 적합한 국부성 질환으로 진단된다2,3. 나머지 환자는 전형적으로 소수의 환자4,5에서효과적인 화학치료제의 조합으로 치료된다. 이러한 긴급한 임상 적 요구를 해결하기 위해 연구자들은 조기 발견 전략과 보다 효과적인 치료법 개발에 적극적으로 노력하고 있습니다. 중요한 발견의 임상 번역을 가속화하기 위하여는, 과학자는 유전으로 조작한 마우스 모형, 참을성 있는 파생된 이종이식, 단층 세포 선 및, 가장 최근에, organoid 모형6를채택하고 있습니다.

변형되지 않은 전구세포의 증식을 자극하는 성장인자 및 Wnt-리간드를 이용한 3차원 상피 오르가노이드 배양은 마우스장(7)에 대해 최초로 기술되었고 정상 인간 췌장 조직에....

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Protocol

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연구 사용을 위한 모든 인간 조직 수집은 내부 검토 위원회(IRB)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 다음 의정서는 모두 포유류 조직 배양 실험실 환경에서 무균 조건하에서 수행된다.

1. 미디어 준비

  1. 컨디셔닝된 미디어 준비.
    참고: 인간의 췌 장 오르가노이드 매체는 유기 체 확장에 대 한 충분 한 성장 자극을 제공 하기 위해 풍부한 성장 인자 및 영양소 뿐만 아니라 조건부 미디어 보충 필요. 아래에 기술된 두 조절 배지는 시판되는 세포주로부터 제조된다(재료 표참조). 전체 프로토콜 및 자료는 제조업체의 웹 사이트를 참조하십시오.
    1. 제조업체의 프로토콜에 따라 R-spondin1 컨디셔닝 미디어를 생산합니다.
      1. 먼저, 풍부한 혈청(10%)이 있는 상황에서 적절한 항생제(Zeocin) 선택 방법을 사용하여 R-spondin1을 발현하는 293T 세포를 확장한다. 컨디셔닝된 매체를 생산할 때, 항생제 선택과 혈청을 철회하고 씻어내지 않고 최종 조절된 매체에 항생제와 혈청이 존재하지 않는다. 중요한 것은, 컨디셔닝된 매체는 교차 오염을 방지하기 위해 수집 후(0.2 μm) 후 필터멸균되어야 합니다.
      2. 단기간 사용(6개월 이내) 또는 장기 보관을 위해 -20....

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Results

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PDAC에서 오르가노이드를 분리하는 것과 관련된 문제를 설명하기 위해, 우리는 작은 세포내 종양 샘플로부터 환자 유래 오르가노이드 배양물의 확립을 보여준다. 초기 도금 후 그림 1과같이 웰당 몇 개의 오르가노이드만 보였습니다. 오가노이드는 2주 동안 더 크게 성장할 수 있었고, 초기 및 후기 통로 1의 대표적인 사진에 나타난 바와 같이 보다 견고한 문화를 확립하기 위해 우리의 프로토콜에 따라 통과되었다(그림1). 2.13단계에서 설명한 바와 같이, 후기 1차 분리기에서 관찰된 더 큰 낭포성 오르가노이드는 오르가노이드와 얼음-차가운 BME를 혼합하는 동안 더 작은 조각으로 쉽게 분해되었다는 점에 유의하는 것이 중요하다.

약리화 프로토콜의 결과를 입증하기 위해, 우리는 이 프로토콜에 기재된 바와 같이 확립되고 빠르게 성장하는 대표적인 PDAC 오르가노이드로부터 단일 세포를 준비.......

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Discussion

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여기에서는 환자 유래 PDAC 오르가노이드를 분리, 확장 및 특성화하기 위한 현재 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 문화를 확립하는 우리의 현재 성공률은 70 % 이상입니다; 따라서 이러한 방법은 아직 완성되지 않았으며 시간이 지남에 따라 개선되고 진화할 것으로 예상됩니다. PDAC는 낮은 신생물 세포성을 가지고 있기 때문에 샘플 크기에 중요한 고려 사항을 주어야합니다. 따라서, 작은 견본은 몇몇 종양 세포를 포함하고, 단지 오르가노이드의 소수를 생성할 것입니다. 추가적으로, 많은 환자는 외과 적 개입15의앞에 화학요법 및/또는 화학방사선 기지를 둔 neoadjuvant 처리를 수신합니다. 치료가 특정 환자에게 효과적이면, 종양 조직은 생존 세포가 결여될 수 있다. 화학-순진한 환자 샘플의 취득은 이 방법의 초기 최적화를 위해 바람직하지만, 이것이 항상 가능한 것은 아니다. 흥미롭게도 우리는 샘플이 24 시간 이내에 처리되는 한 종양 조직의 외과 적 제거 후 허혈 시간이 성공적인 오르.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 UC 샌디에고 무어 암 센터 생물 저장소 및 조직 기술 공유 자원의 지원에 감사드립니다, 로위 실험실의 구성원, 수술의 UC 샌디에고 부서, 외과 종양학의 부문. AML은 NIH CA155620, SU2C CRUK 루스트가르텐 재단 췌장암 드림 팀 상(SU2C-AACR-DT-20-16)과 췌장암 치료 기금에 대한 기부자들의 후원을 받고 있습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12채널 피펫(p20, p100 또는 p200) 및 팁
12웰 플레이트Olympus25-106
15 ml LoBind 코니컬 튜브EppendorfEP0030122208
15 ml 튜브 Rotator 및/또는 Nutator
37 ° C CO2 인큐베이터
37 ° C 수조
384 웰 플레이트Corning4588초저 부착물, 검은색 및 광학적으로 투명
함 A 83-01TOCRIS2939
ADV DMEMThermoFisher12634010
동물 무조합 인간 EGFPeprotechAF-100-15
자동 세포 계수기
B27 보충제ThermoFisher17504044
회수 솔루션Corning3542534°C에서 기저막 추출물을 해중합하는 시약; C
CellTiterGlowPromegaG7570발광 세포 생존 시약
클로로포름시그마C2432
컴퓨터
CryoStor CS10StemCELL Tech07930세포 동결 용액
Cultrex R-spondin1 (Rspo1) 세포Trevigen3710-001-K
DMEMATCC30-2002
DNase ISigmaD5025
약물 프린터TecanD300e이것은 우리가 실험실에서 사용하는 약물 프린터입니다.
분석을 위한Excel
Extra Fine Graefe ForcepsFine Science Tools11150-10
FBSThermoFisher16000044
G-418ThermoFisher10131035
Gastrin I (human)TOCRIS3006
Gentle Collagenase/hyaluronidaseSTEMCELL Tech7919
GlutaMAXThermoFisher35050061글루타민 솔루션
GraphPad Prism데이터 분석용
HEPESThermoFisher15140122
층류 조직 배양 후드
발광계
L-Wnt-3A 발현 세포ATCCCRL-2647
MACS 조직 저장 솔루션Miltenyi biotec130-100-008
Matrigel MatrixCorning356230기저막 추출물 (BME), 성장 인자 감소
Mr. Frosty 동결 컨테이너ThermoFisher5100-0001
N-아세틸시스테인SigmaA9165
니코틴아미드SigmaN0636
p1000 피펫(팁
p200 피펫(팁
PBSThermoFisher10010049
페니실린/스트렙토마이신ThermoFisher15630080
primocinInvivoGenant-pm-2
Rapid-Flow Filter Units (0.2 µ m)ThermoFisher121-0020
재조합 인간 FGF-10Peprotech100-26
재조합 쥐 NogginPeprotech250-38
멸균 일회용 메스, # 10 블레이드VWR89176-380
조직 배양 원심 분리기
조직 배양 접시 10cmOlympus25-202
TRIZolThermoFisher15596018산 페놀 용액
TrypLE ExpressThermoFisher12605010
Y-27632시그마Y0503
ZeocinThermoFisherR25001
세포 데이터 포함) 포함)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  2. Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Cli....

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